Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

Resumo

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Resumo

A descoberta e desenvolvimento da terapia de imuno-Oncologia (I-O) nos últimos anos representa um marco no tratamento do câncer. No entanto, persistem desafios de tratamento. Modelos animais robustos e relevantes para a doença são recursos vitais para a continuação da investigação pré-clínica e do desenvolvimento, a fim de abordar uma série de pontos de verificação imunológicos adicionais. Aqui, nós descrevemos uma pilha mononucleares humana do sangue periférico (PBMC)-modelo humanizado baseado do xenograft. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional no desenvolvimento clínico em estágio tardio, é usado como exemplo para discutir a criação da plataforma, a caracterização do modelo e as avaliações da eficácia do fármaco. Estes ratos humanizados apoiam o crescimento da maioria dos tumores humanos testados, permitindo assim a avaliação de terapias de I-O no contexto da imunidade humana e dos cânceres humanos. Uma vez estabelecido, nosso modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz, e geralmente produzem resultados altamente reprodutíveis. Nós sugerimos que o protocolo esboçado neste artigo pudesse servir como uma diretriz geral para estabelecer os modelos do rato reconstituídos com O PBMC humano e os tumores para a pesquisa do I-O.

Introdução

A imuno-Oncologia (I-O) é um campo de tratamento de câncer em rápida expansão. Os pesquisadores começaram recentemente a apreciar o potencial terapêutico das funções moduladoras do sistema imunológico para atacar tumores. Bloqueios de ponto de verificação imunológico demonstraram atividades encorajadoras em uma variedade de tipos de câncer, incluindo melanoma, Carcinoma de células renais, cabeça e pescoço, pulmão, câncer de bexiga e próstata^1,2. Ao contrário das terapias direcionadas que matam diretamente as células cancerosas, as terapias I-O potenciam o sistema imunológico do corpo para atacar os tumores³.

Até à data, foram estabelecidos numerosos modelos de animais de I-O relevantes. Estes incluem: 1) linhas de pilha do tumor do rato ou homoenxerto do tumor em ratos syngeneic; 2) tumores espontâneos derivados do rato geneticamente projetado (GEM) ou da indução carcinogênica; 3) gemas quiméricas com o knock-in de alvo de droga humana (s) em um sistema imunológico funcional murino; e 4) camundongos com imunidade humana reconstituída transplantados com células cancerosas humanas ou xenoenxertos derivados do paciente (PDXs). Cada um destes modelos têm vantagens óbvias, bem como limitações, que foram descritos e revistos extensivamente em outros lugares⁴.

A reconstituição da imunidade humana em camundongos imunodeficientes tem sido valorizada como uma abordagem clinicamente relevante para a pesquisa de I-O translacional. Isto é conseguido geralmente com o 1) Engraftment de pilhas imunes adultas (por exemplo, pilhas mononucleares do sangue periférico (pmbc))^5,6, ou 2) Engraftment de pilhas de haste hematopoietic (HSC) de, por exemplo, sangue do cordão umbilical ou fetal fígado^7,8. Estes ratos humanizados poderiam apoiar o crescimento de tumores humanos, permitindo assim a avaliação de terapias do I-O no contexto da imunidade humana e dos cancros humanos. Apesar das vantagens, as aplicações de camundongos humanizados na pesquisa I-O foram geralmente prejudicadas por diversas preocupações, como o tempo de desenvolvimento do modelo longo e o custo consideravelmente elevado.

Aqui, nós descrevemos um modelo PBMC-baseado humano que poderia extensamente ser aplicado para estudos translacional do I-O. Este modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz com reprodutibilidade elevada em estudos da eficácia. Tem sido utilizado em casa para as avaliações de várias terapêuticas I-O atualmente desenvolvimento pré-clínico e clínico. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional⁹ , é utilizado como exemplo para discutir o desenvolvimento do modelo, caracterização e possíveis aplicações para análises de eficácia antitumoral.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do BeiGene e/ou Comitê Nacional de pesquisa e com a declaração de Helsínquia 1964 e suas emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes individuais incluídos no estudo. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de revisão interna do BeiGene. Este protocolo foi ajustado especificamente para a avaliação de BGB-A317 (Tislelizumab) em camundongos humanizados NOD/SCID.

1. estabelecimento do modelo humano baseado em PBMC

1. Mieloablação de camundongos NOD/SCID usando ciclofosfamida: determinação de doses ideais
   1. Compre camundongos NOD/SCID femininos (6-8 semanas).
      Nota: Todos os camundongos envolvidos neste estudo eram do sexo feminino.
   2. Prepare a ciclofosfamida (PC) em doses diferentes (50, 100 e 150 mg/kg) em soro fisiológico. Preparar dissulfiram (DS) em 0,8% Tween-80 em soro fisiológico a 125 mg/kg.
      Nota: diferentes concentrações de PC foram preparadas para permitir a administração de volumes iguais de solução de medicamentos para camundongos recebendo diferentes doses de PC.
   3. Trate os animais com CP (i.p.) e DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias. Dar DS (p.o.) 2 h após cada dose de PC.
      Nota: O DS diminui a urotoxicidade da PC em camundongos, e a CP combinada com DS tem sido sugerida para ter neutropenia de maior duração do que os animais tratados apenas com PC¹⁰ o regime posológico de PC pode necessitar de ser pré-determinado antes dos estudos reais e foi encontrado para variar ligeiramente entre diferentes estirpes de rato imunodeficientes.
   4. Colete amostras de sangue do seio venoso orbital e transfira para tubos revestidos de EDTA-K no gelo no dia 0 (1 h antes da dose de 1^St ), dia 2 (24 h após a 2^ª dose) e dia 4 (72 h após a 2^ª dose).
   5. Examine o efeito da mieloablação após o tratamento com PC e DS por FACS. Use Rat anti-mouse CD11b (M1/70), Rat anti-mouse Ly6C (HK 1.4,) e Rat anti-mouse Ly6G (1a8) para gating CD11b⁺ Ly6G^alta como neutrófilos, CD11b⁺Ly6C^alta como monócitos^11,12.
   6. Grave o peso corporal e as condições de saúde dos ratos diariamente durante uma semana. A dose óptima de PC e de DS é determinada como o regime que conduz ao esgotamento máximo dos neutrófilos e dos monócitos sem causar a toxicidade severa aos ratos.
2. Transplantação humana do PBMC e Engraftment do tumor: ajuste do modelo
   1. Isole PBMCs humanos de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Pré-trate os ratos com CP e DS como indicado pela etapa 1.1.2 e 1.1.3 para aumentar a eficiência da transplantação.
   3. 20 a 24 h após a segunda dose de PB e DS, injetar linha celular tumoral humana, como células A431 (ATCC, 2,5 x 10⁶) e 5 x 10⁶ PBMCs isolados (misturado em um total de 200 μL de soro tampão fosfato (PBS) contendo 50% de matrigel) , ou fragmentos tumorais (3 x 3 x 3 mm³, em um volume total de 200 ΜL de PBS contendo 50% de Matrigel) e 200 μL de 5 x 10⁶ PBMCs (100 μl cada um para o lado esquerdo e direito do fragmento de tumor enenxertado) (s.c.) subcutaneamente no flanco direito dos animais.
   4. Meça o volume preliminar do tumor e recorde duas vezes por semana por 4-6 semanas.
      Nota: Os ratos serão eutanasiados uma vez que seus pesos corporais perdem mais de 20% ou seu volume tumoral atinge 2.000 mm³ ou o tumor é Ulcerado.
   5. Eutanizar os camundongos em câmaras de gás com dióxido de carbono. Colete todos os tecidos tumorais em camundongos sacrificados com tesoura oftálmicas e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1 nestes tecidos. Consulte o protocolo passo 4.

2. tela de doador PBMC

1. Tela de um painel de doadores PBMC devido às variações antecipadas resultantes de PBMCs coletados de indivíduos. Use células A431 coinjetando com PBMCs de diferentes doadores de acordo com os procedimentos, conforme indicado pela etapa 1,2.
   Nota: Mais de 50 doadores saudáveis de PBMC foram rastreados no estudo, a fim de obter número suficiente de doadores adequados. Pesquisadores que gostariam de adotar esse protocolo podem decidir por conta própria quantos doadores saudáveis de PBMC devem ser rastreados, com base no projeto dos estudos planejados.
2. Monitore o volume tumoral duas vezes por semana medindo com um paquímetro.
   Nota: A taxa de crescimento tumoral pode variar com PBMC de diferentes doadores.
3. Colete os tecidos tumorais em um volume médio de 200-500 mm³ e processe-os para análise histológica e imuno-histoquímica (IHC). Examine as expressões humanas CD8, PD-1 e PD-L1. Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado.
4. Selecione doadores de PBMC que resultam em crescimento moderado do tumor (volume tumoral > 200 mm³ 14 dias após a inoculação) e relativamente altas expressões PD-1, PD-L1 e CD8 (escores médios do ihc > 2). Consulte a etapa 4 para obter um protocolo detalhado de Pontuação do IHC.

3. linha celular do cancro humano e tela de PDX

1. Linhas de células de tela e PDXs de acordo com os procedimentos indicados na etapa 1,2, para avaliar a taxa de crescimento tumoral, a expressão de PD-L1 humana dos tumores e infiltrações de células imunes.
   Nota: Mais de 30 linhagens de células cancerosas humanas e mais de 20 PDXs de diferentes tipos de câncer foram rastreadas pelos autores. Os dados dos modelos de tumores selecionados foram mostrados na seção de resultados.

4. imunoistoquímica (IHC)

1. Colheita como indicado pela etapa 1.2.5 e fixar tecidos tumorais por imersão em formalina. Deshidratar e incorporar tecidos fixos em parafina. Corte os tecidos fixos a 3 μm e coloque-os em lâminas revestidas com polylysine.
2. Desparaffinize em xilenos três vezes 7 min cada. Hidratar as secções através de álcoois classificados: 100% etanol duas vezes por 3 min cada, seguido por 90%, 80% e 70% etanol por turno por 3 min cada. Enxágüe por H₂o desionizado três vezes e remova o excesso de líquido das lâminas.
3. Realize a recuperação do antígeno colocando as lâminas em um recipiente e cubra com tampão do citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0), ou Tris-EDTA (pH 9,0). Aqueça o recipiente de slides por microondas por 3 min. Ferva em um banho de água a 95 ° c por 30 min e depois esfrie até a temperatura ambiente. Enxágüe por H₂O desionizado três vezes e aspirar o excesso de líquido das lâminas.
4. Bloquear as secções em 3% de albumina sérica bovina em PBS durante 1 h e 0,3% H₂O₂ solução em PBS durante 10 min. mancha por anticorpos contra o CD8 humano (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 ° c durante a noite, e HRP conjugado 2^ND anticorpos na RT para 1 h. soltar o substrato DAB (3, 3 '-diaminobenzidina) sobre as lâminas e controlar o tempo de reação (segundos a minutos), monitorando a cor marrom do microscópio.
5. Cubra as lâminas com bálsamo neutro depois de mergulhar as lâminas em 0,5% álcool ácido clorídrico e 0,5% de água de amônia por sua vez para 5 s cada, em seguida, em 80%, 90% e 100% etanol em seqüência por 3 min cada, e, finalmente, em xilenos usando três mudanças para 5 min cada. Detecte os anticorpos observando a cor marrom do DAB usando o microscópio.
   Nota: A expressão humana de CD8 e de PD-1 em leucócito tumor-infiltrando (TIL) foi avaliada atribuindo uma contagem da expressão em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) na ampliação objetiva elevada (20x, 40x). 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 20% células; 2, intensidade fraca a moderada/20%-50% células; 3, moderada a forte intensidade/50%-80% células; 4, intensidade forte/mais de 80% células. A mancha PD-L1 humana dentro das pilhas do tumor foi anotada usando um sistema de Pontuação ajustado em uma escala de 5 pontos (contagem de IHC, escala 0-4) por causa de seu sinal relativamente difuso. 0, ausente; 1, fraca intensidade/menos de 10% células; 2, fraca-a-moderada intensidade/10%-30% células; 3, moderada/30%-50% células; 4, intensidade forte/mais de 50% células.

5. estudos de eficácia e farmacodinâmica in vivo em modelos de PBMC-NOD/SCID xenograft humanizados

1. Pré-trate camundongos NOD/SCID como indicado pela etapa 1.1.3. Em suma, trate os camundongos com 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) uma vez por dia durante 2 dias.
2. 20 a 24 h após a segunda dose, injete por via subcutânea (s.c.) com número indicado de células cancerosas humanas e 2,5-5 x 10⁶ PBMCs (um total de 200 μL de mistura de células em 50% de Matrigel) no flanco dianteiro direito dos animais.
   Nota: O número de PBMC usado para qualquer mouse individual em um único estudo deve ser o mesmo. No entanto, devido a variações na disponibilidade de PBMC isolados totais no momento de cada estudo, os autores optaram por usar 2,5 x 10⁶, 4 x 10⁶ou 5 x 10⁶ PBMC em diferentes estudos. Embora essa diferença de 2 vezes na quantidade administrada de PBMCs possa afetar o grau de humanização, os autores não observam diferenças significativas na avaliação de eficácias antitumorais das imunoterapias testadas.
3. Para o Engraftment de pdxs, injete fragmentos por via subcutânea do tumor (3 x 3 x 3 milímetros³) no flanco dianteiro direito dos animais. Injete por via subcutânea 200 μL de 5 x 10⁶ PBMCs (100 μl cada lado) à esquerda e à direita do fragmento enxertado do tumor.
   Nota: Os tecidos do tumor de PDX foram administrados em uma solução de Matrigel, mesmo que descrito para os modelos da linha celular.
4. No dia da inoculação celular, agrupe aleatoriamente os animais e trate-o como o protocolo de estudo planejado.  Avalie a atividade antitumoral de drogas candidatas, BGB-A317 (QW, i.p.) neste caso, nas doses indicadas em vários modelos tumorais.
   Nota: As três linhagens de células cancerosas humanas (i.e., A431 (Carcinoma epidemoide), SKOV3 (cancro do ovário) e SK-MES-1 (cancro do pulmão)), bem como dois modelos PDX (i.e., BCLU-054 (cancro do pulmão) e BCCO-028 (cancro do cólon)), são considerados bons modelos tumorais para avaliação neste modelo humanizado do rato.
5. Meça o volume preliminar do tumor duas vezes cada semana, usando um compasso de calibre.
   Nota: A perda de pesos corporais de Gand foi observada em torno de 4-6 semanas após o Engraftment de PBMC em nossos estudos, permitindo uma janela de 1-2 meses para avaliações terapêuticas da eficácia.
6. Para a análise da farmacodinâmica de células imunes infiltradas tumorais, corte os tecidos tumorais em pequenos pedaços e digerir-os com colagenase tipo i (1 mg/ml) e DNase i (100 μg/ml) em RPMI1640 mais 5% soro fetal bovino (FBS) por 30 min a 37 ° c. Passe os tecidos digeridos através de filtros de células de 40 μm para obter suspensões de células únicas.
7. Lave as células e ajuste o número da célula para uma concentração de 1 x 10⁷ células/ml em gelo frio FACS buffer (PBS, 1% FBS) em 96-bem fundo redondo placas. Lave as células por centrifugação e bloqueá-las adicionando 20 μg/mL de IgG humana por 30 min, seguida de coloração com anticorpos anti-humanos CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 ° c durante 30 min. Em seguida, sujeitar as amostras manchadas a citometria de fluxo e analisar usando guavaSoft 3.1.1.

Resultados

Seguindo os procedimentos aqui apresentados, foi estabelecido com sucesso um modelo humanizado de Xenoenxerto com base em PBMC. Em síntese, os efeitos da mieloablação de PB nos camundongos NOD/SCID foram determinados pela análise de citometria de fluxo de populações de neutrófilos e monócitos pós-tratamento de CP e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP mais 125 mg/kg DS foi determinada como a dose óptima e utilizada em estudos posteriores, uma como o regime resulta na depleção máxima de n...

Discussão

Nosso conhecimento do desenvolvimento e da progressão do cancro avançou significativamente nos últimos anos, com foco em uma compreensão detalhada das pilhas do tumor e de seu estroma associado. Aproveitar os mecanismos imunes do hospedeiro poderia induzir um maior impacto contra as células cancerosas, representando uma estratégia de tratamento promissora. Os modelos murinos com sistemas imunológicos de rato intacto, como os modelos syngeneic e GEM, têm sido amplamente utilizados para estudar a imunidade mediada ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMC separation /cell culture
Histopaque-1077	Sigma	10771	Cell isolation
DMEM	Corning	10-013-CVR	Cell culture
DPBS	Corning	21-031-CVR	Cell culture
FBS	Corning	35-076-CV	Cell culture
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140-163	Cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-114	Cell culture
Matrigel	Corning	356237	CDX inoculation
FACS analysis
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Sample preparation
Collagenase Type I	Sigma	C0130	Sample preparation
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody	BioLegend	101206	FACS
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody	BioLegend	128008	FACS
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody	BioLegend	127614	FACS
Anti-human CD8 (OKT8) antibody	Sungene Biotech	H10082-11H	FACS
Anti-human CD279 (MIH4) antibody	eBioscience	12-9969-42	FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody	4A Biotech	--	FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer	Millipore	0500-4008	FACS
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement
Cyclophosphamide	J&K	Cat#419656, CAS#6055-19-2	In vivo efficacy
Disulfiram	J&K	Cat#591123, CAS#97-77-8	In vivo efficacy
Syringe	BD	300841	CDX inoculation
Hypodermic needles (14G)	Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.	0.7*32 TW SB	PDX inoculation
Vernier Caliper (MarCal)	Mahr	16ER	Tumor measurement
IVC individual ventilated cages	Lingyunboji Ltd.	IVC-128	Animal facility
IHC
Leica ASP200 Vacuum tissue processor	Leica	ASP200	IHC
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning	Leica	RM2235	IHC
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module	Leica	EG1150 H	IHC
Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner	Leica	Ariol	IHC
Anti-human CD8 (EP334) antibody	ZSGB-Bio	ZA-0508	IHC
Anti-human PD1 [NAT105] antibody	Abcam	ab52587	IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody	Cell Signaling Technology	13684S	IHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection System	ZSGB-Bio	PV-9001/9002	IHC