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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons une cellule mononucléaire périphérique humaine de sang (PBMC) — modèle humanisé basé de souris de xénogreffe pour la recherche translationnelle d'immuno-oncologie. Ce protocole pourrait servir de ligne directrice générale pour établir et caractériser des modèles similaires pour l'évaluation de la thérapie I-O.

Résumé

La découverte et le développement de la thérapie immuno-oncologie (I-O) au cours des dernières années représente une étape importante dans le traitement du cancer. Cependant, les défis de traitement persistent. Des modèles animaux robustes et pertinents pour la maladie sont des ressources vitales pour la poursuite de la recherche et du développement précliniques afin de s'attaquer à une gamme de points de contrôle immunitaires supplémentaires. Ici, nous décrivons une cellule mononucléaire périphérique humaine de sang (PBMC) — modèle humanisé basé de xénogreffe. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorps anti-PD-1 humanisé par investigation dans le développement clinique à un stade avancé, est utilisé comme exemple pour discuter de la mise en place de la plate-forme, de la caractérisation des modèles et des évaluations de l'efficacité des médicaments. Ces souris humanisées soutiennent la croissance de la plupart des tumeurs humaines testées, permettant ainsi l'évaluation des thérapies I-O dans le contexte de l'immunité humaine et des cancers humains. Une fois établi, notre modèle est relativement rentable dans le temps et le coût, et donne généralement des résultats hautement reproductibles. Nous suggérons que le protocole décrit dans cet article pourrait servir de ligne directrice générale pour établir des modèles de souris reconstitués avec le PBMC humain et les tumeurs pour la recherche d'I-O.

Introduction

L'immuno-oncologie (I-O) est un domaine en pleine expansion du traitement du cancer. Les chercheurs ont récemment commencé à apprécier le potentiel thérapeutique de moduler les fonctions du système immunitaire pour attaquer les tumeurs. Les blocages de points de contrôle immunitaires ont démontré des activités encourageantes dans une variété de types de cancer, y compris le mélanome, le carcinome rénal, la tête et le cou, le poumon, la vessie et les cancers de la prostate1,2. Contrairement aux thérapies ciblées qui tuent directement les cellules cancéreuses, les thérapies I-O potentiat le système immunitaire du corps pour attaquer les tumeurs3.

À ce jour, de nombreux modèles animaux I-O pertinents ont été établis. Ceux-ci incluent : 1) les lignes de cellules de tumeur de souris ou l'homogreffe de tumeur dans les souris syngeneic ; 2) tumeurs spontanées dérivées de la souris génétiquement modifiée (GEM) ou cancérogène-induction ; 3) GEMs chimériques avec le knock-in de la cible humaine de drogue(s) dans un système immunitaire murine fonctionnel ; et 4) souris avec l'immunité humaine reconstituée transplantée avec les cellules cancéreuses humaines ou les xénogreffes patient-dérivées (PDXs). Chacun de ces modèles présente des avantages évidents ainsi que des limites, qui ont été décrites et examinées en profondeur ailleurs4.

La reconstitution de l'immunité humaine chez les souris immunodéficientes ont été de plus en plus appréciées comme une approche cliniquement pertinente pour la recherche translationnelle D'O.I. Ceci est habituellement réalisé par l'engraftment 1 des cellules immunitaires adultes (par exemple, les cellules mononucléaires périphériques de sang (PMBC))5,6, ou 2) l'engraftment des cellules souches hématopoïétiques (HSC) du sang de cordon ombilical ou foetal foie7,8. Ces souris humanisées pourraient soutenir la croissance des tumeurs humaines, permettant ainsi l'évaluation des thérapies d'I-O dans le contexte de l'immunité humaine et des cancers humains. Malgré les avantages, les applications des souris humanisées dans la recherche I-O ont généralement été entravées par plusieurs préoccupations, telles que le long temps de développement du modèle et le coût considérablement élevé.

Ici, nous décrivons un modèle humain basé sur PBMC qui pourrait être largement appliqué pour les études translationnelles I-O. Ce modèle est comparativement temporel et rentable avec une reproductibilité élevée dans les études d'efficacité. Il a été utilisé en interne pour les évaluations de plusieurs thérapies I-O actuellement en cours de développement préclinique et clinique. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorps anti-PD-1 humanisé enquêteur9 , est utilisé comme exemple pour discuter du développement du modèle, de la caractérisation et des applications possibles pour des analyses d'efficacité antitumorale.

Protocole

Toutes les procédures effectuées dans le cas d'études impliquant des participants humains étaient conformes aux normes éthiques de BeiGene et/ou du comité national de recherche et à la déclaration d'Helsinki de 1964 et à ses modifications ultérieures ou normes éthiques comparables. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants inclus dans l'étude. Toutes les procédures effectuées dans le cas d'études portant sur des animaux ont été approuvées par la Commission d'examen interne de BeiGene. Ce protocole a été spécifiquement ajusté pour l'évaluation de BGB-A317 (Tislelizumab) chez des souris NOD/SCID humanisées.

1. Mise en place d'un modèle humain basé sur le PBMC

  1. Myéloablation des souris NOD/SCID à l'aide de cyclophosphamide : détermination des doses optimales
    1. Achetez des souris femelles NOD/SCID (6-8 semaines).
      REMARQUE: Toutes les souris impliquées dans cette étude étaient femelles.
    2. Préparer le cyclophosphamide (CP) à différentes doses (50, 100 et 150 mg/kg) en solution saline. Préparer le disulfiram (DS) en 0,8 % de Tween-80 en salin à 125 mg/kg.
      REMARQUE : Différentes concentrations de CP ont été préparées pour permettre l'administration de volumes égaux de solution de drogue aux souris obtenant différentes doses de CP.
    3. Traiter les animaux avec CP (i.p.) et DS (p.o.) une fois par jour pendant 2 jours. Donnez DS (p.o.) 2 h après chaque dose de CP.
      REMARQUE: DS diminue l'urotoxicité du CP chez les souris, et CP combiné avec DS a été suggéré d'avoir une neutropénie plus durable que les animaux traités avec CP seul10 Le régime de dose de CP pourrait avoir besoin d'être prédéterminé avant les études réelles et s'est avéré varier légèrement entre différentes souches de souris immunodéficientes.
    4. Recueillir des échantillons de sang du sinus veineux orbital et le transfert vers des tubes enduits EDTA-K sur la glace le jour 0 (1 h avant la 1ère dose), le jour 2 (24 h après la dose de 2nd) et le jour 4 (72 h après la 2e dose).
    5. Examiner l'effet de myéloablation après le traitement de CP et de DS par FACS. Utilisez rat anti-souris CD11b (M1/70), rat anti-souris Ly6C (HK1.4, ) et rat anti-souris Ly6G (1A8) pour gating CD11b- Ly6Gélevé comme neutrophiles, CD11b-Ly6Célevé comme monocytes11,12.
    6. Enregistrez le poids corporel et les conditions de santé des souris tous les jours pendant une semaine. La dose optimale de CP et de DS est déterminée comme le régime qui a comme conséquence l'épuisement maximum des neutrophiles et des monocytes sans causer la toxicité grave aux souris.
  2. Transplantation humaine de PBMC et engraftment de tumeur : configuration de modèle
    1. Isoler les PBMC humains des donneurs sains par centrifugation de gradient de densité selon les instructions du fabricant.
    2. Prétraiter les souris avec CP et DS comme indiqué par l'étape 1.1.2 et 1.1.3 pour augmenter l'efficacité de transplantation.
    3. 20 à 24 h après la deuxième dose de CP et de DS, injecter la lignée cellulaire tumorale humaine comme les cellules A431 (ATCC, 2,5 x 106) et 5 x 106 PBMC isolés (mélangés dans un total de 200 l phosphate tamponné saline (PBS) contenant 50% de Matrigel) , ou fragments de tumeur (3 x 3 x 3 mm3, dans un volume total de 200 PbS ll contenant 50% de Matrigel) et 200 L de 5 x 106 PBMC (100 l chacun sur le côté gauche et droit du fragment de tumeur greffé) (s.c.) sous-cutané sur le flanc droit des animaux.
    4. Mesurer le volume primaire de tumeur et enregistrer deux fois par semaine pendant 4-6 semaines.
      REMARQUE: Les souris seront euthanasiées une fois que leur poids corporel perdra plus de 20% ou leur volume tumoral atteindra 2.000 mm3 ou la tumeur est ulcérée.
    5. Euthanasier les souris dans les chambres à gaz avec du dioxyde de carbone. Recueillir les tissus tumoraux entiers chez les souris sacrifiées avec des ciseaux ophtalmiques et les traiter pour l'analyse d'histologie et d'immunohistochimie (IHC). Examinez les expressions CD8, PD-1 et PD-L1 humaines dans ces tissus. Voir l'étape 4 du protocole.

2. Écran de donneur PBMC

  1. Sélection d'un panel de donateurs PBMC en raison des variations prévues résultant de PBMc recueillies auprès des individus. Utilisez des cellules A431 co-injectant avec des PBMC de différents donneurs selon les procédures indiquées par l'étape 1.2.
    REMARQUE: Plus de 50 donneurs de PBMC en bonne santé ont été examinés dans le but d'obtenir un nombre suffisant de donneurs appropriés. Les chercheurs qui aimeraient adopter ce protocole pourraient décider eux-mêmes du nombre de donneurs de PBMC en bonne santé qui seront examinés, en se fondant sur la conception des études prévues.
  2. Surveiller le volume tumoral deux fois par semaine en mesurant avec un étrier.
    REMARQUE: Le taux de croissance de tumeur peut varier avec PBMC de différents donateurs.
  3. Recueillir les tissus tumoraux à un volume moyen de 200-500 mm3 et les traiter pour l'analyse d'histologie et d'immunohistochimie (IHC). Examiner les expressions CD8, PD-1 et PD-L1. Voir l'étape 4 pour un protocole détaillé.
  4. Sélectionnez les donneurs de PBMC qui se traduisent par une croissance modérée des tumeurs (volume tumoral de 200 mm3 14 jours après l'inoculation) et des expressions PD-1, PD-L1 et CD8 relativement élevées (scores iHC moyens 'gt; 2). Voir l'étape 4 pour le protocole de notation détaillé du CSI.

3. Ligne de cellules de cancer humain et écran de PDX

  1. Lignes cellulaires d'écran et PDXs selon les procédures indiquées à l'étape 1.2, pour évaluer le taux de croissance de tumeur, l'expression humaine de PD-L1 des tumeurs et des infiltrations de cellules immunitaires.
    REMARQUE: Plus de 30 lignées de cellules cancéreuses humaines et plus de 20 PDX de différents types de cancer ont été examinés par les auteurs. Des données des modèles choisis de tumeur ont été montrées dans la section de résultats.

4. Immunohistochimie (IHC)

  1. Récoltez comme indiqué par l'étape 1.2.5 et fixez des tissus de tumeur en immergeant dans la formaline. Déshydrater et incorporer les tissus fixes dans la paraffine. Sectionnez les tissus fixes à 3 m et placez-les sur des lames recouvertes de polylysine.
  2. Déparaffininer en xylènes trois fois 7 min chacun. Hydratez les sections à l'alcool classé : 100 % d'éthanol deux fois pendant 3 min chacune, suivi de 90 %, 80 % et 70 % d'éthanol à leur tour pendant 3 min chacun. Rincer par H2O déionisé trois fois et retirer l'excès de liquide des glissières.
  3. Effectuer la récupération d'antigène en plaçant les glissières dans un récipient et recouvrir de 10 mM de tampon de citrate de sodium (pH 6,0), ou Tris-EDTA (pH 9,0). Chauffer le récipient de diapositives par micro-ondes pendant 3 min. Faire bouillir dans un bain d'eau à 95 oC pendant 30 min, puis refroidir à température ambiante. Rincer par h2O déionisé trois fois et aspirer l'excès de liquide des lames.
  4. Bloquer les sections par 3% d'albumine de sérum bovin en PBS pour 1 h et 0,3% H2O2 solution en PBS pour 10 min. Tache par des anticorps contre les anticorps humains CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) et PD-L1 (E1L3N) à 4 oC pendant la nuit, et HRP conjugué 2 anticorpsnd à RT pendant 1 h. Déposer le substrat DAB (3,3'-diaminobenzidine) sur les diapositives et contrôler le temps de réaction (de quelques secondes à quelques minutes) en surveillant la couleur brune du microscope.
  5. Couvrir les diapositives de baume neutre après avoir immergé les diapositives dans 0,5% d'alcool d'acide chlorhydrique et 0,5% d'eau d'ammoniac à son tour pour 5 s chacun, puis en 80%, 90% et 100% d'éthanol en séquence pendant 3 min chacun, et enfin en xylènes en utilisant trois changements pour 5 min chacun. Détecter les anticorps en observant la couleur brune de DAB à l'aide d'un microscope.
    REMARQUE: L'expression humaine de CD8 et de PD-1 sur des leucocytes tumeur-infiltrants (TIL) ont été évaluées en attribuant un score d'expression sur une échelle de 5 points (score d'IHC, gamme 0-4) au grossissement objectif élevé (20x, 40x). 0, absent; 1, faible intensité/ moins de 20% de cellules; 2, faible à modérée intensité/ cellules de 20%-50%; 3, cellules d'intensité modérée à forte/50%-80%; 4, forte intensité/ plus de 80% de cellules. La coloration humaine de PD-L1 dans les cellules de tumeur a été notée utilisant un système ajusté de notation sur une échelle de 5 points (score d'IHC, gamme 0-4) en raison de son signal relativement diffus. 0, absent; 1, faible intensité/ moins de 10% de cellules; 2, cellules d'intensité faible à modérée/10%-30%; 3, cellules modérées/ 30%-50%; 4, forte intensité/ plus de 50% de cellules.

5. In Vivo efficacité et études pharmacodynamiques dans les modèles humanisés PBMC-NOD/SCID Xenograft

  1. Prétraiter les souris NOD/SCID indiquées par l'étape 1.1.3. En bref, traiter les souris avec 100 mg/kg CP (i.p.) et 125 mg/kg DS (p.o.) une fois par jour pendant 2 jours.
  2. 20 à 24 h après la deuxième dose, injecter sous-cutanée (s.c.) avec le nombre indiqué de cellules cancéreuses humaines et 2,5-5 x 106 PBMC (un total de 200 l mélange de cellules dans 50% Matrigel) dans le flanc avant droit des animaux.
    REMARQUE: Le nombre de PBMC utilisés pour une souris individuelle dans une seule étude devrait être le même. Cependant, en raison des variations dans la disponibilité du PBMC isolé total au moment de chaque étude, les auteurs ont choisi d'utiliser 2.5 x 106, 4 x 106, ou 5 x 106 PBMC à différentes études. Bien que cette différence de deux fois dans la quantité administrée de PBMCs pourrait affecter le degré d'humanisation, les auteurs n'observent pas des différences significatives dans l'évaluation des efficacités antitumorales des immunothérapies testées.
  3. Pour l'engraftment de PDXs, injectez sous-cutanéedes des fragments de tumeur (3 x 3 x 3 mm3) sur le flanc avant droit des animaux. Injecter sous-cutanéement 200 L de 5 x 106 PBMC (100 L de chaque côté) à gauche et à droite du fragment de tumeur greffé.
    REMARQUE: Les tissus tumoraux de PDX ont été administrés dans une solution de Matrigel, même que décrit pour les modèles de ligne de cellules.
  4. Le jour de l'inoculation cellulaire, le groupe aléatoire des animaux et de traiter comme le protocole d'étude prévu.  Évaluer l'activité antitumorale des médicaments candidats, BGB-A317 (QW, i.p.) dans ce cas, aux doses indiquées dans divers modèles de tumeur.
    REMARQUE: Les trois lignées cellulaires cancéreuses humaines (c.-à-d. A431 (carcinome épidimatoire), SKOV3 (cancer de l'ovaire) et SK-MES-1 (cancer du poumon)), ainsi que deux modèles De PDX (c.-à-d. BCLU-054 (cancer du poumon) et BCCO-028 (cancer du côlon)), sont considérés comme de bons modèles tumoraux pour la thérapie I-O. dans ce modèle de souris humanisé.
  5. Mesurer le volume tumoral primaire deux fois par semaine, à l'aide d'un étrier.
    REMARQUE: La perte de poids de corps de gand a été observée autour de 4-6 semaines après l'engraftment de PBMC dans nos études, permettant une fenêtre de 1-2 mois pour des évaluations thérapeutiques d'efficacité.
  6. Pour l'analyse pharmacodynamique des cellules immunitaires infiltrées par tumeur, couper les tissus tumoraux en petits morceaux et les digérer avec du collagène de type I (1 mg/mL) et du DNase I (100 g/mL) dans RPMI1640 plus 5% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 30 min à 37 oC. Passer les tissus digérés à travers des passoires cellulaires de 40 m pour obtenir des suspensions à cellule unique.
  7. Laver les cellules et ajuster le nombre de cellules à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans le tampon FACS froid de glace (PBS, 1% FBS) dans des plaques inférieures rondes de 96 puits. Laver les cellules en les centrifugeant et les bloquer en ajoutant 20 IgG humain de 20 g/mL pendant 30 min, puis tachée d'anticorps anti-humains CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) et PD-1 (MIH4) à 4 oC pendant 30 min. Ensuite, soumettez les échantillons tachés à la cytométrie et d'analyser à l'aide de goyaveSoft 3.1.1.

Résultats

Suivant les procédures présentées ici, un modèle humanisé de xénogreffe PBMC a été avec succès établi. En bref, les effets de la myéloablation du CP chez les souris NOD/SCID ont été déterminés par l'analyse de cytométrie du débit des populations de neutrophiles et de monocytes post-traitement DU CP et DS (figure1). 100 mg/kg CP plus 125 mg/kg DS a été déterminé comme dose optimale et utilisé dans des études ultérieures que le régime entraîne un épuisement maximal d...

Discussion

Notre connaissance du développement et de la progression de cancer a avancé de manière significative ces dernières années, avec l'accent sur une compréhension globale des cellules de tumeur et de son stroma associé. L'exploitation des mécanismes immunitaires de l'hôte pourrait avoir un plus grand impact sur les cellules cancéreuses, ce qui représente une stratégie de traitement prometteuse. Les modèles de murine avec les systèmes immunitaires intacts de souris, tels que les modèles syngénéiques et GEM, o...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ont une participation dans BeiGene. Tong Zhang et Kang Li sont les inventeurs d'un brevet couvrant BGB-A317 décrit dans cette étude.

Remerciements

Nous remercions les membres de nos laboratoires pour leurs discussions utiles. Ce travail a été partiellement appuyé par le Programme de recherche sur l'innovation et la culture en sciences biomédicales et en sciences de la vie de la Commission municipale des sciences et de la technologie de Beijing, en vertu de l'accord de subvention no. Z151100003915070 (projet « Étude préclinique sur un nouveau médicament antitumoral d'oncologie immunitaire BGB-A317 »), et il a également été partiellement soutenu par le financement interne de l'entreprise pour la recherche préclinique.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
PBMC separation /cell culture
Histopaque-1077Sigma10771Cell isolation
DMEMCorning10-013-CVRCell culture
DPBSCorning21-031-CVRCell culture
FBSCorning35-076-CVCell culture
Penicillin-Streptomycin, LiquidGibco15140-163Cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200-114Cell culture
MatrigelCorning356237CDX inoculation
FACS analysis
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigmaDN25Sample preparation
Collagenase Type ISigmaC0130Sample preparation
Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibodyBioLegend101206FACS
Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibodyBioLegend128008FACS
Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibodyBioLegend127614FACS
Anti-human CD8 (OKT8) antibodySungene BiotechH10082-11HFACS
Anti-human CD279 (MIH4) antibodyeBioscience12-9969-42FACS
Anti-human CD3 (HIT3a) antibody4A Biotech--FACS
Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow CytometerMillipore0500-4008FACS
Tumor/PDX implantation /dosing / measurement
CyclophosphamideJ&KCat#419656, CAS#6055-19-2In vivo efficacy
DisulfiramJ&KCat#591123, CAS#97-77-8In vivo efficacy
SyringeBD300841CDX inoculation
Hypodermic needles (14G)Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd.0.7*32 TW SBPDX inoculation
Vernier Caliper (MarCal)Mahr16ERTumor measurement
IVC individual ventilated cagesLingyunboji Ltd.IVC-128Animal facility
IHC
Leica ASP200 Vacuum tissue processorLeicaASP200IHC
Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine SectioningLeicaRM2235IHC
Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding ModuleLeicaEG1150 HIHC
Ariol-Clinical IHC and FISH ScannerLeicaAriolIHC
Anti-human CD8 (EP334) antibodyZSGB-BioZA-0508IHC
Anti-human PD1 [NAT105] antibodyAbcamab52587IHC
Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibodyCell Signaling Technology13684SIHC
Polink-2 plus Polymer HRP Detection SystemZSGB-BioPV-9001/9002IHC

Références

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