Modelo preclínico de donación cardíaca después de la muerte circulatoria

Resumen

Este protocolo muestra un enfoque simple y flexible para la evaluación de nuevos agentes acondicionadores o estrategias para aumentar la viabilidad de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria.

Resumen

La demanda de trasplantes cardíacos está en aumento; sin embargo, la disponibilidad de órganos es limitada debido a la escasez de donantes adecuados. La donación de órganos después de la muerte circulatoria (DCD) es una solución para abordar esta disponibilidad limitada, pero debido a un período de isquemia cálida prolongada y el riesgo de lesión tisular, su uso rutinario en trasplante cardíaco rara vez se ve. En este manuscrito proporcionamos un protocolo detallado que imita estrechamente las prácticas clínicas actuales en el contexto de la DCD con monitoreo continuo de la función cardíaca, lo que permite la evaluación de nuevas estrategias e intervenciones cardioprotectoras para disminuir lesión por reperfusión de isquemia.

En este modelo, el protocolo DCD se inicia en ratas Lewis anestesiadas deteniendo la ventilación para inducir la muerte circulatoria. Cuando la presión arterial sistólica cae por debajo de 30 mmHg, se inicia el tiempo isquémico cálido. Después de un período isquémico cálido preconfigurado, los corazones se enjuadean con una solución cardiopléjica normotérmica, se obtienen y se montan en un sistema de perfusión cardíaca ex vivo de Langendorff. Después de 10 minutos de reperfusión inicial y estabilización, el reacondicionamiento cardíaco se evalúa continuamente durante 60 minutos utilizando la monitorización de la presión intraventricular. Una lesión cardíaca se evalúa midiendo la troponina T cardíaca y el tamaño del infarto se cuantifica mediante tinción histológica. El tiempo isquémico cálido se puede modular y adaptar para desarrollar la cantidad deseada de daño estructural y funcional. Este sencillo protocolo permite la evaluación de diferentes estrategias de acondicionamiento cardioprotectores introducidas en el momento de cardioplejia, reperfusión inicial y/o durante la perfusión ex vivo. Los hallazgos obtenidos de este protocolo se pueden reproducir en grandes modelos, facilitando la traducción clínica.

Introducción

El trasplante de órganos sólidos en general y el trasplante cardíaco, en particular, van en aumento en todo el mundo^1,2. El método estándar de adquisición de órganos es la donación después de la muerte cerebral (DBD). Dados los estrictos criterios de inclusión de DBD,se aceptan menos del 40% de los corazones ofrecidos 3, limitando así la oferta frente al aumento de la demanda y ampliando la lista de espera de órganos. Para abordar este problema, el uso de órganos donados despuésde la muerte circulatoria (DCD) se considera una posible solución 4.

En los donantes de DCD, sin embargo, una fase agonal después de la retirada de la atención y un período de isquemia cálida sin protección antes de la reanimación son inevitables⁵. La posible lesión de órganos después de la muerte circulatoria puede conducir a la disfunción del órgano, lo que explica la renuencia a adoptar rutinariamente trasplantes cardíacos DCD. Se informa que sólo 4 centros utilizan los corazones DCD clínicamente, con criterios estrictos que incluyentiempos de isquemia cálida muy cortos y jóvenes donantes sin patologías crónicas 6,⁷. Por razones éticas y legales, se pueden aplicar intervenciones cardioprotectoras limitadas o sin cardioprotectores en donantes antes de la muerte circulatoria^5,8,9. Por lo tanto, cualquier mitigación para aliviar la lesión isquemia-reperfusión (IR) se limita a las terapias cardioprotectoras iniciadas durante la reperfusión temprana con soluciones cardiopléjicos, y no permiten una evaluación funcional adecuada. La perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) y el reacondicionamiento del corazón DCD utilizando plataformas dedicadas han sido propuestos como una solución alternativa y estudiado por varios estudiosos^10,11,12,13 . EVHP ofrece una oportunidad única para entregar agentes post-acondicionado a los corazones de DCD para mejorar la recuperación funcional. Sin embargo, para una traducción clínica eficiente, quedan muchas cuestiones técnicas y prácticas por abordar, y esto se agrava aún más por la falta de consenso sobre una serie de criterios de perfusión y funcionales para determinar la trasplantabilidad^{6, 8}.

Aquí informamos del desarrollo de un protocolo preclínico de DCD preclínico preclínico de DCD combinado con un sistema de perfusión cardíaca ex vivo que se puede utilizar para investigar el postcondicionamiento de órganos iniciado en el momento de la adquisición, durante la reperfusión inicial, y /o a través de EVHP.

Protocolo

Todos los protocolos de cuidado de animales y experimentales se ajustaban a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales del Centro Hospitalario de investigación de la Universidad de Montreal.

1. Preparativos preliminares

1. Encienda el baño de agua para calentar el sistema de administración de cardioplejia (Figura1A)y el sistema de perfusión Langendorff ex vivo (Figura 1B). Establezca la temperatura del agua en 38,5 oC para una temperatura de solución de 37 oC. Las fotografías de configuración se pueden ver en la Figura suplementaria 1A,B.
2. Preparar 1 L de solución cardiopléjica. Añadir 1 mL de 2% de clorhidrato de lidocaína y 10 mL de 2 mM de KCl (concentración final 20 mM) a 1 L de Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM ClM, acetato de 27 mM, gluconato de 23 mM). Corrija el pH a 7.4 usando 6 N HCl.
   PRECAUCION: Este modelo es muy sensible al pH. Una corrección de pH incorrecta (fuera del rango fisiológico 7.3-7.4) o soluciones inestables de pH pueden comprometer el experimento o proporcionar datos poco fiables.
3. Preparar 4 L de solución Krebs (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂x 6H₂O, 5,5 mM D-Glucosa, 25 mM NaHCO_3). Las masas de sustrato por 1 L de solución deben ser las siguientes: 6,1 g de NaCl, 0,3355 g de KCl, 0,2035 g de MgCl₂x 6H₂O, 0,192 g de NaH₂PO₄, 0,1387 g de CaCl_2,0,99 g de D-Glucosa, 2,1 g de NaHCO₃ , volumen final de 1 L en agua ultrapura desionizada. Añadir la NaHCO ₃ para evitar precipitaciones. Filtre la solución con un filtro de 0,22 m y guárdela durante la noche. Corrija el pH a 7,4 cuando la solución esté a 37 oC y burbuja con 5% co₂/95% O₂.
4. Llene el circuito Langendorff con la solución Krebs e inicie la bomba del sistema. Asegúrese de que no queden burbujas dentro deltubo. Ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 80 rpm (equivalente a 1 L/min). Usando la polla de parada de dos vías, ajuste el flujo para mantener un goteo lento a través de la cánula aórtica hasta que el corazón esté unido (Figura 1B). Mantenga una muestra de solución de Krebs (15 ml) en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo para el transporte cardíaco.
5. Llene el sistema de administración de cardioplejia con la solución cardiopléjica. Una vez que se quitan las burbujas, cambie el circuito a salina usando una polla de parada de 3 vías (Figura1A). Ajuste la velocidad de goteo. La salina debe estar goteando lentamente desde la punta del catéter para asegurar que no se inyecta solución cardiopléjica antes de la muerte del animal.

2. Preparación animal

1. Usando una cámara de inhalación, inducir anestesia con 3% de isoflurano. Una vez que el animal no responde, realizar una inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) o anestesia igualmente adecuada, siguiendo las regulaciones locales, para mantener la anestesia para el resto del procedimiento. Asegurar la profundidad de la anestesia sin reacción al pellizco del dedo del dedo del día y al reflejo palpebral.
2. Intubar al animal usando un catéter Inviderso de 14 G y 2 pulgadas. Comience la ventilación a 50 respiraciones por minuto, con presión de las vías respiratorias limitada a 20 cmH₂O.
3. Coloque el animal en una almohadilla calefactora establecida en "medio" y cubra con una almohadilla absorbente para mantener la temperatura corporal. Inserte una sonda de temperatura rectal y conecte un sensor de oxímetro de pulso transdérmico a uno de los pies. Mantener la temperatura rectal a 37oC durante todo el procedimiento.
4. Acceso vascular
   1. Haga una incisión de piel de línea media de 3 a 4 cm en el cuello usando tijeras. Usando tijeras curvadas de punta contundente, diseccionar con teliza el tejido subcutáneo y exponer el músculo estuomiidederecho derecho. Usando fórceps no traumáticos, mueva el músculo lateralmente hasta que la arteria carótida derecha (pulsando), la vena yugular (no pulsante) y el nervio vago (blanco) se identifiquen visualmente (FiguraSuplementaria 2A). Separe cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida usando tijeras curvadas de punta contundente.
   2. Inyecte heparina (2.000 UI/kg) a través de la vena yugular derecha. Aplique presión en el lugar de inyección después de la retracción de la aguja para evitar fugas de sangre.
   3. Usando fórceps curvos, pasa dos suturas de seda 5-0 alrededor de la arteria carótida. Fije firmemente una sutura distal para ocluir la arteria carótida en el aspecto superior de la arteria expuesta. Mantenga la sutura proximal desatada. La extracción de la sutura proximal se utilizará para el control del sangrado en el siguiente paso (Figurasuplementaria 2B). La distancia entre suturas debe ser de aproximadamente 2cm.
   4. Usando un estereomicroscopio para una mejor visualización, realice cuidadosamente una incisión de 1 mm con tijeras de microcirugía sobre la pared anterior de la arteria carótida. Inserte un catéter I.V. cerrado de 22 G y 1 pulgada hacia el arco aórtico. El catéter está conectado a un grifo de parada de 2 vías, lo que permite la conexión a un transductor de presión para un monitoreo constante, con la posibilidad de inyectar salina o cardioplejia a través del sistema de administración de cardioplejia (Figura1A).

3. Inicio de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria (DCD) Protocolo

NOTA: Una línea de tiempo completa del protocolo se puede ver en la Figura2.

1. Reasve la profundidad anestésica realizando un pellizco del dedo del pie y evaluando el reflejo palpebraal. Si se observa una reacción, realice una inyección intraperitoneal de ketamina (37,5 mg/Kg) y xilazina (2,5 mg/Kg). Reevaluar después de 5 minutos. Si no se observa ninguna respuesta, continúe el procedimiento. La abrazadera traqueal sólo debe realizarse en animales adecuadamente anestesiados.
2. Apague el respirador y extube al animal. Con los mosquitos fórceps, sujeta la tráquea. Este momento se considera como el inicio de la fase agonal. Comience a contar el tiempo isquémico cálido funcional (WIT) cuando la presión arterial sistólica máxima cae por debajo de 30 mmHg, o si aparece asistolia o fibrilación ventricular, lo que ocurra primero (Figura3).
   NOTA: La extensión de los daños debe ser proporcional a WIT. Los experimentos son necesarios para optimizar el tiempo de wiT de acuerdo con el anestésico utilizado, la cepa animal, el sexo y el peso elegido. En los animales controlados, inmediatamente después de asegurar el acceso vascular carótido, se inyecta cardioplejia y se adquiere el corazón como se describe en el siguiente paso (Figura2). El inicio de la perfusión con cardioplejia se considera como el final del WIT.
3. Al final del WIT, realice una estenotomía medial. Mantenga el tórax abierto usando un retractor de alm. Con tijeras, abra la vena cava inferior y ambas aurículas para evitar la distensión miocárdica o la recirculación cardioplejia (Figura suplementaria 3). Sujete la aorta por encima del diafragma. A través de la arteria carótida previamente catetela, infundir la solución cardiopléjica a una presión constante de 60 mmHg durante 5 min utilizando el sistema de administración de cardioplejia. La presión de perfusión se puede modificar alterando la altura de la columna de agua.
4. Al final de la perfusión cardiopléjica, diseccionar la aorta proximal ascendente de la arteria pulmonar utilizando fórceps curvos (FiguraSuplementaria 4A). Cortar la aorta distal a la arteria subclavia izquierda. Asegurar una longitud aórtica de al menos 0,5 cm para la cánula para el aparato Langendorff.
5. Sosteniendo el corazón de la aorta, completar la cardiectomía separando el corazón de las venas pulmonares y otras estructuras torácicas (FiguraSuplementaria 4B). Rápidamente, sumerja el corazón en una solución Krebs helada para un transporte rápido al sistema ex vivo. Mantenga la disección y los tiempos de transporte lo más cortos posible (5 min).

4. Ex Vivo Sistema de Perfusión Cardiaca (EVHP) y Evaluación Funcional Cardíaca

1. Abra el lumen aórtico usando fórceps. Desate la aorta llenando el lumen con la solución de Krebs que gotea para evitar forzar burbujas a los vasos coronarios. Baje la cánula hacia la aorta, teniendo cuidado de no pasar la raíz aórtica ni dañar los foliolos de la válvula aórtica. Fije la configuración con una pequeña abrazadera.
2. Usando el tapón de 2 vías, aumente el flujo para buscar posibles fugas en la aorta. Si no se detecta ninguno, fije firmemente la aorta a la cánula usando una sutura de seda 2-0. Abra completamente el flujo a la cánula. Mantener la presión aórtica a una presión fisiológica de 60-70 mmHg (ajustada cambiando la altura del sistema). En este momento se inicia el tiempo inicial de reperfusión y estabilización. La presión aórtica se puede modificar de acuerdo con el plan experimental del investigador.
3. Gire el corazón para que la base del corazón (arículas) esté frente al sensor de presión. Amplía la abertura auricular ventricular izquierda disecting las venas pulmonares. Inserte el globo de látex conectado a un sensor de presión. Asegúrese de que el globo esté completamente colocado dentro del ventrículo mediante inspección visual. Llene lentamente el globo con salina hasta que la presión diastólica final (EDP) se ajuste a 15 mmHg. Ajuste según sea necesario para mantener el EDP constante (EDP fisiológico predeterminado). El EDP se puede ajustar de acuerdo con los objetivos experimentales de cada investigador.
4. Inserte el electrodo de ritmo en la cara anterior del corazón (tracto de salida ventricular derecho). Evite puntuar los vasos coronarios. Una vez que se observa un golpe espontáneo, inicie el ritmo a 300 latidos por minuto.
5. Después de 10 minutos de estabilización, inicie el registro continuo de la medición de la presión intraventricular. Este momento se considera el comienzo de la fase de reacondicionamiento y evaluación (tiempo 0) que durará 1 h (Figura2). El reacondicionamiento puede ser prolongado, pero se espera una disminución de la contractilidad dependiente del tiempo en todos los corazones.
6. Al comienzo del reacondicionamiento, recoger efluentes cardíacos que caen de las venas cardíacas durante 5 minutos para la evaluación basal del flujo coronario y análisis bioquímicos. Para la troponina T repetir cada 15 min (tiempos 0, 15, 30, 45 y 60 min). Para otros análisis es necesaria la individualización de los tiempos de recogida (Figura 2).

5. Fin de la experiencia

1. Retire el corazón del aparato Langendorff.
2. Usando una hoja recta de acero al carbono alto (hoja de microtome o similar), retire la base del corazón (incluyendo aorta y arteria pulmonar).
3. Con el ventrículo derecho hacia abajo, corte los portaobjetos ventriculares transversales de 1-2 mm de espesor. En una sección representativa (normalmente la tercera) eximulice el ventrículo derecho y congele el ventrículo izquierdo. Esta muestra se puede utilizar para análisis bioquímicos.
4. Sumerja las secciones restantes en cloruro de 5%2,3,5-trifenilo-tetrazolium recién preparado en fosfato comercial tampón de solución salina pH 7,4 durante 10 min a 37 oC. Los tejidos viables son de ladrillo rojo de color.
5. Lavar dos veces con el pH salino tampón de fosfato 7.4 y fijar con 10% de formalina a 4 oC durante la noche. Lavar dos veces con el pH salino tamponado fosfato 7.4 y mantener cada rebanada sumergida.
6. Retire el exceso de líquido y el peso de cada diapositiva. Tome imágenes digitales en color de ambos lados. Utilice análisis planimétricos para calcular el tamaño del porcentaje de infarto y corregir el peso de la rebanada y el peso ventricular total. La coloración se desvanece con el tiempo. Las fotos deben tomarse lo antes posible.

6. Análisis de datos

1. Guarde todos los datos de presión en un nuevo archivo por animal.
2. Para los análisis de presión, seleccione al menos 200 ciclos de presión por puntos de tiempo. Los análisis se pueden realizar fuera de línea (después de la finalización del experimento) utilizando software dedicado (es decir, LabChart). Los parámetros cardiovasculares comunes disponibles incluyen: Presión máxima generada, presión diastólica final, +dP/dt (pendiente más pronunciada durante la curva de presión, un indicador de capacidad contráctil ventricular), -dP/dt (pendiente más pronunciada durante el bajada de la curva de presión, un indicador de la capacidad de relajación ventricular) entre otros.
   NOTA: Para los análisis de troponina, se espera un aumento en la liberación de troponina en la reperfusión. Después de 1 h de reperfusión en el sistema EVHP, los niveles de troponina pueden disminuir a la línea de base, haciendo hincapié en la necesidad de una sincronización cuidadosa en la recolección y manipulación de estas muestras.

Resultados

Después de la extubación, la presión arterial disminuye rápidamente en un patrón predecible (Figura 3). El tiempo esperado hasta la muerte es de menos de 5 min.

La Figura 4 muestra una curva de presión/tiempo promedio al inicio del reacondicionamiento después de 0, 10 y 15 min de WIT. La función contractile mejorará con el tiempo. El uso de períodos cortos de WIT permitirá que la contractilidad vuelva a la normalidad, y el ...

Discusión

El protocolo presentado aquí introduce un modelo simple, conveniente y versátil de DCD cardíaco, que ofrece la oportunidad de evaluar la recuperación funcional cardíaca, el daño tisular y el uso de agentes cardioprotectores post-acondicionadopara mejorar la recuperación del donante corazones de lo contrario desechados para el trasplante. Los sistemas de perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) se han optimizado para proporcionar una plataforma para evaluar la función cardíaca y ofrecer una oportunidad única para ofr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL