Modello preclinico di donazione cardiaca dopo la morte circolatoria

Riepilogo

Questo protocollo mostra un approccio semplice e flessibile per la valutazione di nuovi agenti di condizionamento o strategie per aumentare la fattibilità della donazione cardiaca dopo la morte circolatoria.

Abstract

La domanda di trapianto cardiaco è in aumento; tuttavia, la disponibilità di organi è limitata a causa della scarsità di donatori idonei. La donazione di organi dopo la morte circolatoria (DCD) è una soluzione per affrontare questa disponibilità limitata, ma a causa di un periodo di ischemia calda prolungata e il rischio di lesioni tissutali, il suo uso di routine nel trapianto cardiaco è raramente visto. In questo manoscritto forniamo un protocollo dettagliato che imita da vicino le attuali pratiche cliniche nel contesto della DCD con il monitoraggio continuo della funzione cardiaca, consentendo la valutazione di nuove strategie cardioprotettivhe e interventi per diminuire lesione da ischemia-reperfusione.

In questo modello, il protocollo DCD viene avviato in ratti Lewis anestesizzati fermando la ventilazione per indurre la morte circolatoria. Quando la pressione sanguigna sistolica scende al di sotto di 30 mmHg, viene iniziato il tempo ischemico caldo. Dopo un periodo ischemico caldo preimpostato, i cuori vengono lavati con una soluzione cardioplegica normotermica, procurati e montati su un sistema di perfusione cardiaca ex vivo di Langendorff. Dopo 10 min di riperfusione e stabilizzazione iniziale, il ricondizionamento cardiaco viene continuamente valutato per 60 min utilizzando il monitoraggio della pressione intraventricolare. Una lesione cardiaca viene valutata misurando la troponina cardiaca T e la dimensione dell'infarto è quantificata dalla colorazione istologica. Il tempo ischemico caldo può essere modulato e su misura per sviluppare la quantità desiderata di danni strutturali e funzionali. Questo semplice protocollo consente la valutazione di diverse strategie di condizionamento cardioprotettivo introdotte al momento della cardioplegia, della riperfusione iniziale e/o durante la perfusione ex vivo. I risultati ottenuti da questo protocollo possono essere riprodotti in grandi modelli, facilitando la traduzione clinica.

Introduzione

Il trapianto di organi solidi in generale e il trapianto cardiaco, in particolare, sono in aumento in tutto il mondo^1,2. Il metodo standard di approvvigionamento degli organi è la donazione dopo la morte cerebrale (DBD). Dati i rigorosi criteri di inclusione della DBD, meno del 40% dei cuori offerti sono accettati³, limitando così l'offerta a fronte della crescente domanda ed estendendo la lista d'attesa dell'organo. Per risolvere questo problema, l'uso di organi donati dopo la morte circolatoria (DCD) è considerato una potenziale soluzione⁴.

Nei donatori di DCD, tuttavia, una fase agonale dopo il ritiro delle cure e un periodo di ischemia calda non protetta prima della rianimazione sono inevitabili⁵. La potenziale lesione dell'organo dopo la morte circolatoria può portare alla disfunzione dell'organo, spiegando la riluttanza ad adottare regolarmente trapianti di cuore DCD. Si dice che solo 4 centri utilizzino clinicamente i cuori DCD, con criteri rigorosi che includono tempi di ischemia calda molto brevi e giovani donatori senza patologie croniche^6,7. Per motivi etici e giuridici, nei donatori possono essere applicati interventi cardioprotettivi limitati o associali prima della morte circolatoria^5,8,9. Pertanto, qualsiasi mitigazione per alleviare la lesione ischemia-reperfusione (IR) è limitata alle terapie cardioprotettive iniziate durante la reperfusione precoce con soluzioni cardiopleganti e non consente una corretta valutazione funzionale. Ex vivo cuore perfusione (EVHP) e il ricondizionamento del cuore DCD utilizzando piattaforme dedicate è stato proposto come soluzione alternativa e studiato da vari studiosi^10,11,12,13 . EVHP offre un'opportunità unica per fornire agenti post-condizionamento ai cuori DCD per migliorare il recupero funzionale. Tuttavia, per una traduzione clinica efficiente, restano da affrontare molte questioni tecniche e pratiche, e ciò è ulteriormente aggravato dalla mancanza di consenso su una serie di criteri funzionali e per la perfusione per determinare la capacità dei trapianti^{6, 8}.

Qui segnaliamo lo sviluppo di un protocollo DCD preclinico preclinico preclinico riproducibile combinato con un sistema di perfusione cardiaca ex vivo che può essere utilizzato per indagare organo post-condizionamento avviato al momento dell'approvvigionamento, durante la riperfusione iniziale, e /o in tutta EVHP.

Protocollo

Tutti i protocolli di cura degli animali e sperimentali sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di ricerca Centre Hospitalier de l'Université de Montréal.

1. Preparativi preliminari

1. Accendere il bagno d'acqua per riscaldare il sistema di consegna cardioplegia (Figura 1A) e il sistema di perfusione ex vivo Langendorff (Figura 1B). Impostare la temperatura dell'acqua a 38,5 gradi centigradi per una temperatura di soluzione di 37 gradi centigradi. Le fotografie di installazione possono essere visualizzate nella Figura supplementare 1A,B.
2. Preparare 1 L di soluzione cardioplegica. Aggiungere 1 mL di 2% cloruro lidocaino e 10 mL di 2 mM KCl (concentrazione finale 20 mM) a 1 L di Plasma-Lyte A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, acetato da 27 mM, 23 mM di gluconato). Correggere il pH a 7,4 utilizzando 6 N HCl.
   ATTENZIONE: Questo modello è altamente sensibile al pH. Una correzione errata del pH (al di fuori della portata fisiologica 7.3-7.4) o soluzioni instabili per il pH possono compromettere l'esperimento o fornire dati inaffidabili.
3. Preparare la soluzione 4 L di Krebs (113 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM NaH₂PO₄, 1.25 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂x 6H₂O, 5.5 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO₃). Le masse di substrati per 1 L di soluzione dovrebbero essere le seguenti: 6,1 g di NaCl, 0,3355 g di KCl, 0,2035 g di MgCl₂x 6H₂O, 0,192 g di NaH₂PO₄, 0,1387 g di CaCl₂, 0,99 g di D-Glucose, 2,1 g di NaHCO₃ , volume finale di 1 L in acqua ultrapura deionizzata. Aggiungere il NaHCO ₃ (COM del nome per evitare precipitazioni. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 m e conservarla durante la notte. Correggere il pH a 7,4 quando la soluzione è a 37 gradi centigradi e bolla con 5% CO₂/95% O₂.
4. Riempire il circuito Langendorff con la soluzione Krebs e avviare la pompa di sistema. Assicurarsi che non vengano lasciate bolle all'interno del tubo. Regolare la velocità della pompa peristale a 80 giri/mm (equivalente a 1 L/min). Utilizzando il cazzo arresto a due vie, regolare il flusso per mantenere una goccia lenta attraverso la cannula aortica fino a quando il cuore è attaccato (Figura 1B). Tenere un campione di soluzione Krebs (15 mL) in un tubo conico da 50 ml sul ghiaccio per il trasporto del cuore.
5. Riempire il sistema di erogazione di cardioplegia con la soluzione cardioplegica. Una volta rimosse le bolle, passare il circuito in salina utilizzando un cazzo di arresto a 3 vie (Figura 1A). Regolare la frequenza di gocciolamento. La salina deve gocciolare lentamente dalla punta del catetere per assicurare che nessuna soluzione cardiopelgica venga iniettata prima della morte dell'animale.

2. Preparazione degli animali

1. Utilizzando una camera di inalazione, indurre l'anestesia con 3% isoflurane. Una volta che l'animale non risponde, eseguire un'iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) o anestetici altrettanto adatti, seguendo le normative locali, per mantenere l'anestesia per il resto della procedura. Garantire la profondità dell'anestesia senza alcuna reazione al pizzico e al riflesso palpebrale.
2. Intubare l'animale utilizzando un catetere I.V da 14 G e 2 pollici. Iniziare la ventilazione a 50 respiri al min, con pressione delle vie aeree limitata a 20 cmH₂O.
3. Posizionare l'animale su un pad di riscaldamento impostato su "medio" e coprire con un pad assorbente per mantenere la temperatura corporea. Inserire una sonda di temperatura rettale e collegare un sensore ossimetro a impulsi transdermici a uno dei piedi. Mantenere la temperatura rettale a 37 gradi centigradi per tutta la durata della procedura.
4. Accesso vascolare
   1. Fare un'incisione cutanea media da 3 a 4 cm nel collo utilizzando le forbici. Utilizzando forbici curve contundenti, sezionato sezionato il tessuto sottocutaneo ed esporre il muscolo sternoioide destro. Utilizzando la forza non traumatica, spostare il muscolo lateralmente fino a quando l'arteria carotide destra (pulsazione), la vena giugulare (non pulsante) e il nervo vago (bianco) sono identificati visivamente (Figura supplementare 2A). Separare con cura il nervo vago dall'arteria carotide utilizzando forbici curve con punta smussata.
   2. Iniettare l'eparina (2.000 IU/kg) attraverso la vena giugulare destra. Applicare la pressione sul sito di iniezione dopo la retrazione dell'ago per evitare perdite di sangue.
   3. Utilizzando pinze curve, passare due suture di seta 5-0 intorno all'arteria carotide. Fissare saldamente una sutura distale per occludono l'arteria carotide all'aspetto superiore dell'arteria esposta. Mantenere la sutura prossimale slegata. La trazione della sutura prossimale verrà utilizzata per il controllo del sanguinamento nella fase successiva ( Figura supplementare2B). La distanza tra le suture deve essere di circa 2 cm.
   4. Utilizzando uno stereoscopio per una migliore visualizzazione, fare con attenzione un'incisione di 1 mm con forbici microchirurgiche sulla parete anteriore dell'arteria carotide. Inserire un catetere I.V. chiuso da 22 G e 1 pollice verso l'arco aortico. Il catetere è collegato a un cazzo di arresto a 2 vie, consentendo il collegamento a un trasduttore di pressione per un monitoraggio costante, con la possibilità di iniettare salina o cardioplegia tramite il sistema di consegna cardioplegia (Figura 1A).

3. Avvio della donazione cardiaca dopo il protocollo di morte circolatoria (DCD)

NOT: Una sequenza temporale del protocollo completo può essere visualizzata nella Figura 2.

1. Ri-asses la profondità anestetica eseguendo un pizzico di toe e valutando il riflesso palpebrale. Se si osserva una reazione, eseguire un'iniezione intraperitoneale di Ketamina (37,5 mg/Kg) e xylazina (2,5 mg/kg). Rivalutare dopo 5 minuti. Se non viene osservata alcuna risposta, continuare la procedura. Il morsetto tracheale deve essere eseguito solo in animali adeguatamente anestesizzati.
2. Spegnere il ventilatore ed estralare l'animale. Utilizzando pinze antizanzare, bloccare la trachea. Questo momento è considerato come l'inizio della fase agonia. Iniziare a contare il tempo ischemico caldo funzionale (WIT) quando la pressione sanguigna sistolica di picco scende al di sotto di 30 mmHg, o se appare fibrillazione asistole o ventricolare, qualunque cosa venga prima (Figura3).
   NOT: L'entità del danno deve essere proporzionale alla WIT. Sono necessari esperimenti per ottimizzare il tempo WIT in base all'anestetico utilizzato, ceppo animale, sesso e peso scelti. Negli animali di controllo, subito dopo l'accesso vascolare carotideè è assicurato, la cardioplegia viene iniettata e il cuore viene procurato come descritto nella fase successiva (Figura 2). L'inizio della perfusione con cardioplegia è considerato come la fine del WIT.
3. Alla fine del WIT, eseguire una sternotomia mediale. Tenere aperto il torace utilizzando un retrattore Alm. Usando le forbici, aprire la vena cava inferiore e sia atri a tria per evitare la distensione miopidea o la ricircolazione cardioplegia (Figura supplementare 3). Stringete l'aorta sopra il diaframma. Attraverso l'arteria carotide precedentemente catetere, infondere la soluzione cardioplegica ad una pressione costante di 60 mmHg per 5 min utilizzando il sistema di consegna cardioplegia. La pressione di infusione può essere modificata alterando l'altezza della colonna d'acqua.
4. Alla fine dell'infusione cardioplegica, sezionare l'aorta prossimale ascendente dall'arteria polmonare utilizzando la forza curva (Figura supplementare 4A). Tagliare il distale dell'aorta all'arteria subclavianaria sinistra. Assicurare una lunghezza aortica di almeno 0,5 cm per la connulura per l'apparato Langendorff.
5. Tenendo il cuore dall'aorta, completare la cardiectomia separando il cuore dalle vene polmonari e da altre strutture toraciche (Figura supplementare 4B). Rapidamente, immergi il cuore nella soluzione Krebs ghiacciata per un trasporto rapido al sistema ex vivo. Mantenere i tempi di dissezione e trasporto il più breve possibile (5 min).

4. Ex Vivo Heart Perfusion System (EVHP) e Valutazione Funzionale Cardiaca

1. Aprire il lume aortico usando le pinze. Deair l'aorta riempiendo il lume con la soluzione Krebs gocciolante per evitare di forzare le bolle nei vasi coronarici. Abbassare la cannula nell'aorta, facendo attenzione a non passare la radice aortica o danneggiare i volantini della valvola aortica. Fissare l'installazione con un piccolo morsetto.
2. Utilizzando il stopcock a 2 vie, aumentare il flusso per cercare possibili perdite nell'aorta. Se non vengono rilevati, fissare saldamente l'aorta alla cannula utilizzando una sutura di seta 2-0. Aprire completamente il flusso verso la cannula. Mantenere la pressione aortica ad una pressione fisiologica di 60-70 mmHg (regolata cambiando l'altezza del sistema). In questo momento viene avviato il tempo iniziale di riperfusione e stabilizzazione. La pressione aortica può essere modificata secondo il piano sperimentale dello sperimentatore.
3. Ruotare il cuore in modo che la base del cuore (atria) sia rivolta verso il sensore di pressione. Allargare l'apertura atriale ventricolare sinistra sezionando le vene polmonari. Inserire il palloncino in lattice collegato a un sensore di pressione. Assicurarsi che il palloncino sia completamente posizionato all'interno del ventricolo mediante ispezione visiva. Riempire lentamente il palloncino con la pressione diastolica finale (EDP) è impostato su 15 mmHg. Regolare in base alle esigenze per mantenere costante EDP (EDP fisiologico predeterminato). L'EDP può essere regolato in base agli obiettivi sperimentali di ciascun ricercatore.
4. Inserire l'elettrodo di stimolazione nella faccia anteriore del cuore (tratto di deflusso ventricolare destro). Evitare di perforare i vasi coronarici. Una volta osservata la battitura spontanea, avviare il ritmo a 300 battiti al min. La tensione richiesta può variare tra esperimenti e ceppi di ratto.
5. Dopo 10 min di stabilizzazione, avviare la registrazione continua di misurazione della pressione intraventricolara. Questo momento è considerato l'inizio della fase di ricondizionamento e valutazione (tempo 0) che durerà per 1 h (Figura 2). Il ricondizionamento può essere prolungato, ma si prevede una diminuzione della contrattilità dipendente dal tempo in tutti i cuori.
6. All'inizio del ricondizionamento, raccogliere gli effluenti cardiaci che cadono dalle vene cardiache per 5 min per la valutazione del flusso coronario di base e le analisi biochimiche. Per troponina T ripetere ogni 15 min (per 0, 15, 30, 45 e 60 min). Per altre analisi è necessaria l'individualizzazione dei tempi di raccolta (Figura 2).

5. Fine dell'esperienza

1. Togliere il cuore dall'apparato Langendorff.
2. Utilizzando una lama di acciaio ad alto carbonio dritto (lama di microtoma o simili), rimuovere la base del cuore (compresa l'aorta e l'arteria polmonare).
3. Con il ventricolo destro rivolto verso il basso, tagliare i vetrini ventricolari trasversali di 1-2 mm di spessore. In una sezione rappresentativa (normalmente la terza) accisa il ventricolo destro e snap congelare il ventricolo sinistro. Questo campione può essere utilizzato per analisi biochimiche.
4. Sommergi le restanti sezioni per preparare il 5% 2,3,5 tripile-tetrazolium cloruro nel buffer salina commerciale di fosfato pH 7,4 per 10 minuti a 37 gradi centigradi. Tessuti vitali sono di colore mattone rosso.
5. Lavare due volte con fosfato tampone salina pH 7.4 e fissare con 10% formalina a 4 gradi durante la notte. Lavare due volte con fosfato tamponato pH 7.4 e mantenere ogni fetta sommersa.
6. Ritirare il liquido in eccesso e il peso di ogni diapositiva. Scatta immagini a colori digitali di entrambi i lati. Utilizzare le analisi planimetriche per calcolare la dimensione percentuale in farta e correggere la fetta e il peso ventricolare totale. Colorazione svanisce con il tempo. Le foto devono essere scattate il prima possibile.

6. Analisi dei dati

1. Salvare tutti i dati di pressione in un nuovo file per animale.
2. Per le analisi della pressione, selezionare almeno 200 cicli di pressione per punto temporale. Le analisi possono essere eseguite off-line (dopo il completamento dell'esperimento) utilizzando un software dedicato (ad esempio, LabChart). I parametri cardiovascolari più comuni disponibili includono: Pressione massima generata, pressione diastolica finale, dP/dt (pendenza più ripida durante l'upstroke della curva di pressione, indicatore di capacità contrattile ventricolare), -dP/dt (pendenza più ripida durante la verso il basso della curva di pressione, un indicatore di capacità di rilassamento ventricolare) tra gli altri.
   NOTA: per le analisi della troponina, è previsto un aumento del rilascio della troponina durante la riperfusione. Dopo 1 h di reperfusione nel sistema EVHP, i livelli di troponina possono diminuire al basale, sottolineando la necessità di un'attenta tempistica nella raccolta e nella gestione di questi campioni.

Risultati

Dopo l'estubazione, la pressione sanguigna diminuisce rapidamente in un modello prevedibile (Figura 3). L'ora prevista per la morte è inferiore a 5 min.

La figura 4 mostra una curva media pressione/tempo all'inizio del ricondizionamento dopo 0, 10 e 15 min di WIT. Funzione contrattile migliorerà nel tempo. L'uso di brevi periodi di WIT consentirà la contrattilità per tornare alla normalità, e danni morfologici non saranno rilevab...

Discussione

Il protocollo qui presentato introduce un modello semplice, comodo e versatile di DCD cardiaco, che offre l'opportunità di valutare il recupero funzionale cardiaco, i danni ai tessuti e l'uso di agenti cardioprotettivi post-condizionamento per migliorare il recupero del donatore altrimenti scartati per il trapianto. I sistemi di perfusione del cuore ex vivo (EVHP) sono stati ottimizzati per fornire una piattaforma per la valutazione della funzione cardiaca e offrono un'opportunità unica di fornire e testare soluzioni m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL