Präklinisches Modell der Herzspende nach Kreislauftod

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt einen einfachen und flexiblen Ansatz für die Bewertung neuer Konditionierungsmittel oder Strategien zur Erhöhung der Durchführbarkeit von Herzspenden nach Kreislauftod.

Zusammenfassung

Die Nachfrage nach Herztransplantationen steigt; Dennoch ist die Verfügbarkeit von Organen aufgrund eines Mangels an geeigneten Spendern begrenzt. Organspende nach Kreislauftod (DCD) ist eine Lösung, um diese begrenzte Verfügbarkeit zu adressieren, aber aufgrund einer Zeit der längeren warmen Ischämie und des Risikos von Gewebeverletzungen ist ihre routinemäßige Anwendung bei Herztransplantationen selten zu sehen. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das aktuelle klinische Praktiken im Kontext von DCD mit kontinuierlicher Überwachung der Herzfunktion nachahmt, so dass die Bewertung neuartiger kardioprotektive Strategien und Interventionen Ischämie-Reperfusionsverletzung.

In diesem Modell wird das DCD-Protokoll bei anästhesierten Lewis-Ratten initiiert, indem die Beatmung gestoppt wird, um den Kreislauftod auszulösen. Wenn der systolische Blutdruck unter 30 mmHg sinkt, wird die warme ischämische Zeit eingeleitet. Nach einer voreingestellten warmen ischämischen Periode werden die Herzen mit einer normothermen kardioplegischen Lösung gespült, beschafft und auf ein Langendorff ex vivo Herzperfusionssystem montiert. Nach 10 min anfänglicher Reperfusion und Stabilisierung wird die Herzrekonditionierung 60 min lang kontinuierlich mit hilfe der intraventrikulären Drucküberwachung evaluiert. Eine Herzverletzung wird durch Messung des Herztroponins T beurteilt und die Infarktgröße wird durch histologische Färbung quantifiziert. Die warme ischämische Zeit kann moduliert und auf die gewünschte Menge an strukturellen und funktionellen Schäden zugeschnitten werden. Dieses einfache Protokoll ermöglicht die Bewertung verschiedener kardioprotektive Konditionierungsstrategien, die zum Zeitpunkt der Kardioplegie, der anfänglichen Reperfusion und/oder während der Ex-vivo-Perfusion eingeführt wurden. Die aus diesem Protokoll gewonnenen Erkenntnisse können in großen Modellen reproduziert werden, was die klinische Übersetzung erleichtert.

Einleitung

Feste Organtransplantationen im Allgemeinen und Herztransplantationen im Besonderen sind weltweit auf dem Vormarsch^1,2. Die Standardmethode der Organbeschaffung ist die Spende nach dem Hirntod (DBD). Angesichts der strengen Inklusionskriterien der DBD werden weniger als 40% der angebotenen Herzen^{akzeptiert 3}, wodurch das Angebot angesichts der steigenden Nachfrage begrenzt und die Orgelwarteliste erweitert wird. Um dieses Problem anzugehen, wird die Verwendung von Organen, die nach dem Kreislauftod gespendet werden (DCD), als mögliche Lösung betrachtet⁴.

Bei DCD-Spendern sind jedoch eine agonale Phase nach Entzug der Pflege und eine Periode ungeschützter warmer Ischämie vor Reanimation unvermeidlich⁵. Die mögliche Organverletzung nach dem Kreislauftod kann zu Organfunktionsstörungen führen, was die Abneigung gegen routinemäßige DCD-Herztransplantationen erklärt. Es wird berichtet, dass nur 4 Zentren DCD-Herzen klinisch verwenden, mit strengen Kriterien, die sehr kurze warme Ischämie-Zeiten und junge Spender ohne chronische Pathologien^{umfasst 6,7}. Aus ethischen und rechtlichen Gründen können bei Spendern vor dem Kreislauftod^5,8,9begrenzte oder keine kardioprotektive Eingriffe angewendet werden. Daher ist jede Abschwächung zur Linderung der Ischämie-Reperfusion (IR)-Verletzung auf kardioprotektive Therapien beschränkt, die während der frühen Reperfusion mit kardiopdiogischen Lösungen eingeleitet werden, und lässt keine ordnungsgemäße funktionelle Bewertung zu. Ex-vivo-Herzperfusion (EVHP) und Rekonditionierung des DCD-Herzes mit speziellen Plattformen wurde als alternative Lösung vorgeschlagen und von verschiedenen Wissenschaftlern untersucht^10,11,12,13 . EVHP bietet eine einzigartige Gelegenheit, Post-Konditionierungs-Agenten an DCD-Herzen zu liefern, um die funktionelle Erholung zu verbessern. Für eine effiziente klinische Übersetzung müssen jedoch noch viele technische und praktische Fragen angegangen werden, und dies wird noch verstärkt durch einen Mangel an Konsens über eine Reihe von Perfusions- und funktionellen Kriterien zur Bestimmung der Transplantierbarkeit^{6, 8}.

Hierin berichten wir über die Entwicklung eines reproduzierbaren präklinischen DCD-Protokolls für Kleintiere in Kombination mit einem Ex-vivo-Herzperfusionssystem, das zur Untersuchung der zum Zeitpunkt der Beschaffung eingeleiteten Organpostkonditionierung während der ersten Reperfusion verwendet werden kann, und /oder in ganz EVHP.

Protokoll

Alle Tierpflege- und Versuchsprotokolle entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom institutionellen Tierpflege- und Einsatzausschuss des Centre Hospitalier de l'Université de Montréal Research Center genehmigt.

1. Vorvorbereitungen

1. Schalten Sie das Wasserbad ein, um das Cardioplegie-Abgabesystem (Abbildung 1A) und das Langendorff ex vivo Perfusionssystem (Abbildung 1B) zu erwärmen. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 38,5 °C für eine Lösungstemperatur von 37 °C ein. Setup-Fotos sind in der Ergänzenden Abbildung 1A,B zusehen.
2. Bereiten Sie 1 L kardionlegische Lösung vor. 1 ml 2% Lidocainhydrochlorid und 10 ml 2 mM KCl (Endkonzentration 20 mM) zu 1 L Plasma-Lyt A (140 mM Na, 5 mM K, 1,5 mM Mg, 98 mM Cl, 27 mM Acetat, 23 mM Gluconat) hinzufügen. Korrigieren Sie pH auf 7,4 mit 6 N HCl.
   ACHTUNG: Dieses Modell ist sehr empfindlich auf pH-Wert. Eine falsche pH-Korrektur (außerhalb des physiologischen Bereichs 7.3-7.4) oder pH-unstable-Lösungen kann das Experiment gefährden oder unzuverlässige Daten liefern.
3. Bereiten Sie 4 L Krebs Lösung (113 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,6 mM NaH₂PO₄, 1,25 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂6H₂O, 5,5 mM MM D-Glucose, 25 mM NaHCO₃). Die Substratmassen pro 1 L Lösung sollten wie folgt sein: 6,1 g NaCl, 0,3355 g KCl, 0,2035 g MgCl₂6H₂O, 0,192 g NaH₂PO₄, 0,1387 g CaCl₂, 0,99 g D-Glucose, 2,1 g NaHCO₃ , Endvolumen von 1 L in ultrareinem entionisiertem Wasser. Fügen Sie die NaHCO ₃ zuletzt, um Niederschlag zuvermeiden. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m Filter und lagern Sie sie über Nacht. Korrigieren Sie den pH-Wert auf 7,4, wenn die Lösung bei 37 °C liegt, und blasen Sie mit 5% CO₂/95% O₂.
4. Füllen Sie die Langendorff-Schaltung mit Krebs-Lösung und starten Sie die Systempumpe. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in den Schläuchen gelassenwerden. Stellen Sie die peristaltische Pumpendrehzahl auf 80 Rpm (entspricht 1 L/min) ein. Passen Sie mit dem Zwei-Wege-Stopphahn den Durchfluss an, um einen langsamen Tropf durch die Aortenkanüle aufrechtzuerhalten, bis das Herz befestigt ist (Abbildung 1B). Halten Sie eine Probe der Krebs-Lösung (15 ml) in einem 50 ml Kegelrohr auf Eis für den Herztransport.
5. Füllen Sie das Cardioplegie-Liefersystem mit der kardioplegischen Lösung. Sobald die Blasen entfernt sind, schalten Sie die Schaltung mit einem 3-Wege-Stopp-Hahn in Die Saline um (Abbildung 1A). Passen Sie die Tropfrate an. Saline muss langsam von der Spitze des Katheters tropfen, um sicherzustellen, dass vor dem Tod des Tieres keine kardionlegische Lösung injiziert wird.

2. Tierzubereitung

1. Mit einer Inhalationskammer eine Anästhesie mit 3% Isofluran induzieren. Sobald das Tier nicht reagiert, führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) oder ähnlich geeignetean anesthetische, nach den örtlichen Vorschriften, um Anästhesie für den Rest des Verfahrens zu erhalten. Stellen Sie die Tiefe der Anästhesie sicher, indem Sie keine Reaktion auf Zehenkneifen und palpebralen Reflex.
2. Intubieren Sie das Tier mit einem 14 G, 2-Zoll-I.V.-Katheter. Beginnen Sie die Belüftung mit 50 Atemzügen pro min, wobei der Atemwegsdruck auf 20 cmH₂O begrenzt ist.
3. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, das auf "Medium" eingestellt ist, und decken Sie es mit einem saugfähigen Pad ab, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Setzen Sie eine rektale Temperatursonde ein und befestigen Sie einen transdermalen Pulsoximetersensor an einem der Füße. Halten Sie die Rektaltemperatur während des gesamten Verfahrens bei 37 °C.
4. Gefäßzugang
   1. Machen Sie einen 3 bis 4 cm mittelseitigen Hautschnitt im Hals mit einer Schere. Mit stumpfer Spitze gekrümmte Schere, stumpf sezieren Sie das subkutane Gewebe und belichten die rechte sternohyoid Muskel. Mit nicht-traumatischen Zangen, bewegen Sie den Muskel seitlich, bis die rechte Halsschlagader (pulsierend), Jugularvene (nicht pulsierend) und der Vagusnerv (weiß) visuell identifiziert werden (Ergänzende Abbildung 2A). Trennen Sie den Vagusnerv vorsichtig von der Halsschlagader mit einer stumpfen, gebogenen Schere.
   2. Heparin (2.000 I.E./kg) über die richtige Jugularvene injizieren. Wenden Sie Druck auf die Injektionsstelle nach dem Nadelrückzug an, um Blutleckszufuhr zu vermeiden.
   3. Mit gebogenen Zangen, passieren Sie zwei 5-0 Seiden Nähte um die Halsschlagader. Fest befestigen Eine distale Naht, um die Halsschlagader am überlegenen Aspekt der exponierten Arterie zu verschließen. Halten Sie die proximale Naht ungebunden. Das Ziehen der proximalen Naht wird zur Blutungskontrolle im nächsten Schritt verwendet (Zusatzabbildung 2B). Der Abstand zwischen den Nähten sollteca. 2 cm betragen.
   4. Mit einem Stereomikroskop für eine bessere Visualisierung, sorgfältig einen 1 mm Schnitt mit Mikrochirurgie Schere über die vordere Wand der Halsschlagader. Legen Sie einen 22 G, 1-Zoll geschlossenen I.V.-Katheter in Richtung Aortenbogen ein. Der Katheter ist mit einem 2-Wege-Stopphahn verbunden, der den Anschluss an einen Druckwandler für eine konstante Überwachung ermöglicht, mit der Möglichkeit, Koch- oder Kardioplegie über das Cardioplegia-Liefersystem zu injizieren (Abbildung 1A).

3. Einleitung einer Herzspende nach Kreislauftod (DCD) Protokoll

HINWEIS: Eine vollständige Protokollzeitleiste ist in Abbildung 2zu sehen.

1. Die Anästhesietiefe wird durch eine Zehenklemmung und die Bewertung des palpebralen Reflexes erneut untersucht. Wenn eine Reaktion beobachtet wird, führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (37,5 mg/Kg) und Xylazin (2,5 mg/Kg) durch. Nach 5 Minuten neu bewerten. Wenn keine Antwort beobachtet wird, fahren Sie mit dem Verfahren fort. Trachealklemme sollte nur bei ausreichend anästhesierten Tieren durchgeführtwerden.
2. Schalten Sie das Beatmungsgerät aus und extubieren Sie das Tier. Mit Mückenzangen die Luftröhre einklemmen. Dieser Moment gilt als Beginn der Agonalphase. Beginnen Sie mit der Zählung der funktionellen warmen ischämischen Zeit (WIT), wenn der systolische Spitzenblutdruck unter 30 mmHg sinkt oder wenn Asystole oder Kammerflimmern auftritt, was auch immer zuerst kommt (Abbildung 3).
   HINWEIS: Schadensumfang sollte proportional zu WIT sein. Experimente sind notwendig, um die WIT-Zeit entsprechend der verwendeten Anästhesie, der verwendeten Tierstämme, des Geschlechts und des gewählten Gewichts zu optimieren. Bei Kontrolltieren wird unmittelbar nach der Sicherung des Karotis-Gefäßzugangs Eine Kardioplegie injiziert und das Herz beschafft, wie im nächsten Schritt beschrieben (Abbildung 2). Der Beginn der Perfusion mit Kardioplegie gilt als das Ende von WIT.
3. Führen Sie am Ende von WIT eine mediale Sternotomie durch. Halten Sie den Thorax offen, indem Sie einen Alm-Retraktor verwenden. Öffnen Sie mit einer Schere die untere Vena cava und beide Vorhöfe, um Myokardverspannungen oder Kardioplegie-Rezirkulation zu vermeiden (Zusatzabbildung 3). Klemmen Sie die Aorta über dem Zwerchfell. Durch die zuvor katheterisierte Karotisarterie die kardioplegische Lösung bei einem konstanten Druck von 60 mmHg für 5 min mit dem Cardioplegia-Liefersystem einzudecken. Der Infusionsdruck kann durch Änderung der Höhe der Wassersäule verändert werden.
4. Am Ende der kardiepischen Infusion die aufsteigende proximale Aorta aus der Lungenarterie mit gekrümmten Zangen zu dissektieren (Zusatzfigur 4A). Schneiden Sie die Aorta distal auf die linke subklavische Arterie. Stellen Sie eine Aortenlänge von mindestens 0,5 cm für die Cannulation für das Langendorff-Gerät sicher.
5. Halten Sie das Herz von der Aorta, vervollständigen Sie die Kardiektomie, indem Sie das Herz von den Lungenvenen und anderen Thoraxstrukturen trennen (Ergänzende Abbildung 4B). Tauchen Sie schnell das Herz in die eiskalte Krebs-Lösung für den schnellen Transport zum Ex-vivo-System ein. Halten Sie die Sezieren und Transportzeiten so kurz wie möglich (5 min).

4. Ex Vivo Heart Perfusion System (EVHP) und Cardiac Functional Assessment

1. Öffnen Sie das Aortenlumen mit Zangen. Deair the aorta by filling the lumen with the dripping Krebs solution to avoid forcing bubbles in to the coronary vessels. Senken Sie die Kanüle in die Aorta, wobei Sie darauf achten, die Aortenwurzel nicht zu passieren oder die Aortenklappenblätter zu beschädigen. Beheben Sie das Setup mit einer kleinen Klemme.
2. Mit dem 2-Wege-Stopphahn, erhöhen Sie den Fluss, um nach möglichen Lecks in der Aorta zu suchen. Wenn keine erkannt werden, fixieren Sie die Aorta mit einer 2-0 Seidennaht fest an der Kanüle. Öffnen Sie den Fluss zur Kanüle vollständig. Aortendruck bei einem physiologischen Druck von 60-70 mmHg (angepasst durch Änderung der Systemhöhe). In diesem Moment wird die erste Reperfusions- und Stabilisierungszeit eingeleitet. Der Aortendruck kann nach dem Versuchsplan des Prüfers geändert werden.
3. Drehen Sie das Herz so, dass die Basis des Herzens (Atria) dem Drucksensor zugewandt ist. Verbreitern Sie die linke ventrikuläre Vorhoföffnung, indem Sie die Lungenvenen sezieren. Legen Sie den Latexballon ein, der mit einem Drucksensor verbunden ist. Stellen Sie sicher, dass der Ballon vollständig im Inneren des Ventrikels positioniert ist, indem Sie dies durch sichtoptische Inspektion enden. Füllen Sie den Ballon langsam mit Kochsaline, bis der Enddiastolischer Druck (EDP) auf 15 mmHg eingestellt ist. Stellen Sie sich nach Bedarf ein, um die EDP-Konstante zu halten (vorbestimmtes physiologisches EDP). Das EDP kann an die experimentellen Ziele jedes Prüfers angepasst werden.
4. Legen Sie die Schrittelektrode in die vordere Gesichtsfläche des Herzens (rechtsventrikulärer Abflusstrakt) ein. Vermeiden Sie das Punktieren der Herzkranzgefäße. Sobald spontanes Schlagen beobachtet wird, initiieren Sie Tempo bei 300 Schlägen pro min. Erforderliche Spannung kann zwischen Experimenten und Rattenstämmen variieren.
5. Nach 10 min Stabilisierung eine kontinuierliche intraventrikuläre Druckmessung einleiten. Dieser Moment gilt als Beginn der Instandsetzungs- und Bewertungsphase (Zeit 0), die 1 h dauern wird (Abbildung 2). Die Instandsetzung kann verlängert werden, aber in allen Herzen wird mit einem zeitabhängigen Rückgang der Kontraktilität gerechnet.
6. Zu Beginn der Rekonditionierung, sammeln Herzabwässer aus den Herzvenen für 5 min für Baseline koronare Flussbewertung und biochemische Analysen. Für Troponin T alle 15 min wiederholen (mal 0, 15, 30, 45 und 60 min). Für andere Analysen ist eine Individualisierung der Sammelzeiten erforderlich (Abbildung 2).

5. Ende der Erfahrung

1. Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Apparat.
2. Entfernen Sie mit einer geraden Hochkohlestahlklinge (Mikrotomeklinge oder ähnliches) die Basis des Herzens (einschließlich Aorta und Lungenarterie).
3. Mit dem rechten Ventrikel nach unten, schneiden Querventrikuläre von 1-2 mm Dicke. In einem repräsentativen Abschnitt (normalerweise der dritte) verbrauchen Sie den rechten Ventrikel und fangen Sie den linken Ventrikel ein. Diese Probe kann für biochemische Analysen verwendet werden.
4. Untertauchen Sie die restlichen Abschnitte in frisch zubereitete 5%2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid in kommerziellen Phosphatpuffer-saline-pH-Gehalt 7,4 für 10 min bei 37 °C. Lebensfähige Gewebe sind rote Ziegel gefärbt.
5. Zweimal mit Phosphatpuffer-pH-gehalt 7,4 waschen und über Nacht mit 10% Formalin bei 4 °C fixieren. Zweimal mit Phosphat gepufferter saline pH 7.4 waschen und jede Scheibe unter Wasser halten.
6. Überschüssige Flüssigkeit und Gewicht pro Rutsche zurückziehen. Nehmen Sie digitale Farbbilder von beiden Seiten. Verwenden Sie planimetrische Analysen, um die Prozentuale Infarktgröße zu berechnen und das Gewicht der Scheibe und des gesamten ventrikulären Gewichts zu korrigieren. Die Färbung verblasst mit der Zeit. Fotos müssen so schnell wie möglich gemacht werden.

6. Datenanalysen

1. Speichern Sie alle Druckdaten in einer neuen Datei pro Tier.
2. Wählen Sie für Druckanalysen mindestens 200 Druckzyklen pro Zeitpunkt aus. Analysen können online (nach Abschluss des Experiments) mit dedizierter Software (z.B. LabChart) durchgeführt werden. Häufige kardiovaskuläre Parameter sind: Maximal erzeugter Druck, End-Diastolischer Druck, +dP/dt (steilste Steigung während des Aufschlags der Druckkurve, Indikator für ventrikuläre Kontraktilität), -dP/dt (steilste Neigung während der Druckkurve, ein Indikator für die ventrikuläre Entspannungsfähigkeit) u.a..
   HINWEIS: Bei Troponinanalysen wird eine Erhöhung der Troponinfreisetzung bei der Reperfusion erwartet. Nach 1 h Reperfusion im EVHP-System können die Troponinspiegel auf den Ausgangswert sinken, was die Notwendigkeit eines sorgfältigen Timings bei der Entnahme und Handhabung dieser Proben betont.

Ergebnisse

Nach der Extubation sinkt der Blutdruck in einem vorhersagbaren Muster rapide (Abbildung 3). Die erwartete Todeszeit beträgt weniger als 5 min.

Abbildung 4 zeigt eine durchschnittliche Druck-/Zeitkurve zu Beginn der Instandsetzung nach 0, 10 und 15 min WIT. Die Kontraktile-Funktion wird sich im Laufe der Zeit verbessern. Die Verwendung kurzer WIT-Zeiträume wird es ermöglichen, dass sich die Kontraktilität wieder normalisiert, und ...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll stellt ein einfaches, bequemes und vielseitiges Modell von Herz-DCD vor, das die Möglichkeit bietet, die herzfunktionelle Erholung, Gewebeschäden und den Einsatz von kardioprotektive naktiven Nachhilfemitteln zu bewerten, um die Genesung des Spenders zu verbessern. Herzen, die sonst zur Transplantation verworfen werden. Ex-vivo-Herzperfusionssysteme (EVHP) wurden optimiert, um eine Plattform zur Beurteilung der Herzfunktion zu bieten und eine einzigartige Möglichkeit zu bieten, modifizi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL