순환사망 후 심장 기증 전 임상 모델

요약

이 프로토콜은 순환기 죽음 후에 심장 기증의 타당성을 증가시키기 위하여 새로운 컨디셔닝 에이전트 또는 전략의 평가를 위한 간단하고 유연한 접근을 보여줍니다.

초록

심장 이식 수요가 증가하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 장기 가용성은 적당한 기증자의 빈곤때문에 제한됩니다. 순환 기 죽음 후 장기 기증 (DCD) 이 제한 된 가용성을 해결 하기 위해 솔루션, 하지만 장기간된 따뜻한 허 혈의 기간 및 조직 손상의 위험으로 인해, 심장 이식에 그것의 일상적인 사용은 거의 볼 수 없습니다. 이 원고에서 우리는 심장 기능의 지속적인 모니터링과 DCD의 맥락에서 현재의 임상 관행을 밀접하게 모방하는 상세한 프로토콜을 제공하여 새로운 심장 보호 전략 및 내정간섭을 평가할 수 있습니다. 허혈 재관류 부상.

이 모델에서, DCD 프로토콜은 순환 죽음을 유도하기 위해 환기를 중지하여 마취 루이스 쥐에서 시작된다. 수축기 혈압이 30 mmHg 이하로 떨어지면 따뜻한 허혈 시간이 시작됩니다. 미리 설정된 따뜻한 허혈성 기간 이후에, 심장은 노르보노모믹 심전증 용액으로 플러시되고, 조달되고, 랑엔도르프 ex 생체 심장 관류 시스템에 장착됩니다. 초기 재관류 및 안정화 10분 후, 심장 재조정은 혈관 내 압력 모니터링을 사용하여 60분 동안 지속적으로 평가됩니다. 심장 상해는 심장 troponin T를 측정해서 평가되고 경색 규모는 조직학적 염색에 의해 정량화됩니다. 따뜻한 허혈 시간은 조절되고 구조적 및 기능적 손상의 원하는 양을 개발하기 위해 맞춤화 될 수있다. 이 간단한 프로토콜은 심전도, 초기 재관류 및/또는 생체 외 관류 중에 도입된 다양한 심장 보호 컨디셔닝 전략을 평가할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜에서 얻은 사실 인정은 임상 번역을 용이하게 하는 큰 모형에서 재현될 수 있습니다.

서문

고체 장기 이식은 일반적으로 심장 이식, 특히 전세계적으로 1,²가 증가하고 있습니다. 장기 조달의 표준 방법은 뇌 사멸 후 기부 (DBD)입니다. DBD의 엄격한 포함 기준을 감안할 때, 제공 된 마음의 40 % 미만이³을 받아 들여 수요가 증가하고 장기 대기자 명단을 연장하는 상황에서 제안을 제한합니다. 이 문제를 해결하기 위해 순환사망 후 기증된 장기(DCD)의 사용은잠재적인 해결책 4.

DCD 기증자에서는, 그러나, 배려의 철수 및 소생술의 앞에 보호되지 않은 온난한허혈의 기간 다음 고형 단계는 불가피한 5. 순환 기 죽음 후에 잠재적인 기관 상해는 기관 역기능으로 이끌어 낼 수 있습니다, 일상적으로 DCD 심장 이식을 채택하는 것을 꺼리는 설명. 만성 병리학없이 매우 짧은 따뜻한 허혈 시간과 젊은 기증자를 포함하는 엄격한 기준을 가진 4 개의 센터만이DCD 심장을 임상적으로 사용하는 것으로 보고됩니다 6,^7. 윤리적 및 법적 이유로, 제한적이거나 심장 보호 개입은 순환 사망 전에 기증자에 적용 할 수 있습니다^5,8,9. 따라서, 허혈 재관류(IR) 상해를 완화하기 위한 임의의 완화는 심전도 용액을 가진 초기 재관류 중에 시작된 심장 보호 요법으로 제한되며, 적절한 기능 적 평가를 허용하지 않는다. Ex vivo 심장 관류 (EVHP) 전용 플랫폼을 사용 하 여 DCD 심장의 재조정 대안 솔루션으로 제안 하 고 다양 한 학자에 의해 공부^10,11,12,13 . EVHP는 기능 적 회복을 개선하기 위해 DCD 심장에 컨디셔닝 후 에이전트를 제공 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 그러나, 효율적인 임상 번역을 위해, 많은 기술적 및 실질적인 문제는 해결되어야 남아 있고, 이것은 이식가능성을 결정하기 위하여 관류 및 기능 기준의 범위에 대한 합의의 부족에 의해 더 복잡해집니다^{6, 8}.

본 명세서에서 우리는 조달 시, 초기 재관류 시 개시된 장기 사후 컨디셔닝을 조사하는데 사용될 수 있는 생체 내 심혼 관류 시스템과 결합된 재현 가능한 전임상 소형 동물 DCD 프로토콜의 개발을 보고하고, /또는 EVHP 전체에 걸쳐.

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하고 센터 Hospitalier 드 l'Université 드 몬트리올 연구 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 예비 준비

1. 수조를 켜서 심전도 전달 시스템(그림1A)과랑엔도르프 엑생체 관류 시스템(그림1B)을가열한다. 용액 온도를 37°C인 용액 온도에 대해 수온을 38.5°C로 설정합니다. 설치 사진은 보조 그림 1A,B에서 볼 수 있습니다.
2. 심전도 용액 1L을 준비하십시오. 플라즈마-라이테 A(140 mM Na, 5 mM K, 1.5 mM MM MM, 98 mM Cl, 27 mM아세테이트, 23 mM) 글루코네이트에 2% 리도카인 염산염 1mL과 2 mM KCl(최종 농도 20 mM)의 10 mL를 추가합니다. 6 N HCl을 사용하여 pH를 7.4로 수정합니다.
   주의 사항: 이 모델은 pH에 매우 민감합니다. 잘못된 pH 보정(7.3-7.4 생리적 범위 밖) 또는 pH 불안정한 용액은 실험을 손상시키거나 신뢰할 수 없는 데이터를 제공할 수 있습니다.
3. 크렙스 용액 4L(113 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1.6 mM NaH₂PO_4,1.25 mM CaCl_2,1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.5 mM D-글루코스, 25 mM NaHCO 3)를 준비한다. 용액 1L당 기판 질량은 다음과 같이되어야 합니다: NaCl 6.1 g, KCl 0.3355 g,MgCl 2∙6H₂O, 0.192 g의 NaH₂PO_4,0.1387 g의 CaCl_2,0.99 g의 D-글루코스, 2.1 g의 NaH_3CO , 초순수 탈이온수에서 1L의 최종 부피. NaHCO 추가 _3개 마지막 강수량을 피하기 위해. 0.22 μm 필터를 사용하여 용액을 걸과 하룻밤 동안 보관하십시오. 용액이 37 °C에서 5 % CO₂/ 95 % O2로기포가있을 때 pH를 7.4로 수정하십시오.
4. Krebs 솔루션으로 랑엔도르프 회로를 채우고 시스템 펌프를 시동합니다. 튜브 내부에 거품이 남아 있지 않은지확인하십시오. 연동 펌프 속도를 80rpm(1L/min에 해당)으로 조정합니다. 양방향 정지 수탉을 사용하여, 심장이 부착 될 때까지 대동맥 캐뉼라를 통해느린 드립을 유지하기 위해 흐름을 조정 (그림 1B). 심장 수송을 위해 50 mL 원추 튜브에 크렙스 용액 (15 mL)의 샘플을 얼음에 보관하십시오.
5. 심전도 전달 시스템을 심전도 용액으로 채웁니다. 기포가 제거되면 3 방향 정지 콕 (그림 1A)을사용하여 회로를 식염수로 전환하십시오. 드립 속도를 조정합니다. 식염수는 카테터 끝에서 천천히 떨어지며 동물이 죽기 전에 심전도 용액을 주입하지 않도록해야합니다.

2. 동물 준비

1. 흡입 챔버를 사용하여 3 % 이소플루란으로 마취를 유도하십시오. 동물이 반응하지 않는 경우, 케타민 (75 mg/kg) 및 자일라진 (5 mg/kg) 또는 유사하게 적합한 마취제의 복강 내 주사를 수행, 현지 규정에 따라, 절차의 나머지 부분에 대한 마취를 유지. 발가락 핀치와 팔목 반사에 반응하지 않고 마취의 깊이를 확인하십시오.
2. 14G, 2인치 I.V. 카테터를 사용하여 동물을 삽관합니다. 분당 50회 호흡으로 환기를 시작하고 기도 압력이 20cmH 2O로 제한됩니다.
3. 동물을 "중간"으로 설정한 가열 패드에 놓고 체온을 유지하기 위해 흡수 패드로 덮습니다. 직장 온도 프로브를 삽입하고 경피 펄스 산소 측정기 센서를 발 중 하나에 부착합니다. 절차 전반에 걸쳐 37 °C에서 직장 온도를 유지하십시오.
4. 혈관 접근
   1. 가위를 사용하여 목에 3 ~ 4cm 미드 라인 피부 절개를합니다. 무딘 팁 곡선 가위를 사용하여, 무딘 피하 조직을 해부하고 오른쪽 sternohyoid 근육을 노출. 비외상성 집게를 사용하여, 오른쪽 경동맥(맥동), 경정맥(non-pulsating) 및 미주 신경(흰색)이 육안으로 식별될 때까지 근육을측면으로 이동한다(보충도 2A). 무딘 팁 곡선 가위를 사용하여 경동맥에서 미주 신경을 조심스럽게 분리하십시오.
   2. 오른쪽 경정맥을 통해 헤파린(2,000 IU/kg)을 주입합니다. 혈액 누출을 피하기 위해 바늘 후퇴 후 주사 부위에 압력을 가하십시오.
   3. 구부러진 집게를 사용하여 경동맥 주위에 두 개의 5-0 실크 봉합사를 전달합니다. 단단히 노출 된 동맥의 우수한 측면에서 경동맥을 폐색하기 위해 말단 봉합사를 부착합니다. 근위 봉합사를 묶어 두십시오. 근위 봉합사의 당기는 다음 단계에서 출혈 조절에 사용될 것이다 (보충도 2B). 봉합사 사이의 거리는 약 2cm이어야합니다.
   4. 더 나은 시각화를 위해 입체 현미경을 사용하여 경동맥의 앞쪽 벽에 미세 수술 가위로 1mm 절개를 조심스럽게 합니다. 대동맥 아치쪽으로 22G, 1인치 닫힌 I.V. 카테터를 삽입합니다. 카테터는 2 way 스톱 콕에 연결되어 있어 지속적인 모니터링을 위해 압력 트랜스듀서에 연결할 수 있으며, 심전도 전달 시스템을 통해 식염수 또는 심전도를 주입할 수 있습니다(그림1A).

3. 순환사 후 심장 기증 개시 (DCD) 프로토콜

참고: 전체 프로토콜 타임라인은 그림2에서 볼 수 있습니다.

1. 발가락 핀치를 수행하고 팔모릴 반사를 평가하여 마취 깊이를 다시 분석합니다. 반응이 관찰되면, 케타민 (37.5 mg / Kg)과 자일라진 (2.5 mg / Kg)의 복강 내 주사를 수행하십시오. 5분 후에 다시 평가합니다. 응답이 관찰되지 않으면 절차를 계속하십시오. 기관 클램프는 적절하게 마취 된 동물에서만 수행해야합니다.
2. 인공호흡기를 끄고 동물을 떼어내십시오. 모기 집게를 사용하여 기관을 고정합니다. 이 순간은 고형단계의 시작으로 간주됩니다. 피크 수축기 혈압이 30 mmHg 이하로 떨어지거나, 비톨또는 심실 세동이 나타나는 경우 기능성 따뜻한 허혈시간(WIT)을계수하기 시작합니다(그림 3).
   참고: 피해 범위는 WIT에 비례해야 합니다. 실험은 선택한 마취, 동물 변형, 성별 및 체중에 따라 WIT 시간을 최적화하는 데 필요합니다. 대조군 동물에서, 경동맥 혈관 접근이 확보된 직후, 심전도가 주입되고 다음 단계에서 설명된 대로심장이 조달된다(그림 2). 심장 전절기와 관류의 시작은 WIT의 끝으로 간주됩니다.
3. WIT의 끝에서, 중간 절제술을 수행합니다. Alm 리트랙터를 사용하여 흉부를 열어 두십시오. 가위를 사용하여 열등한 정맥카바와 심근 경화 또는 심전소 재순환을 피하기 위해 심방 경화 또는 심방 재순환을 피하기 위해 모두 심방을 엽니다 (보충 그림 3). 대상자를 다이어프램 위에 고정합니다. 이전에 카테터화 된 경동맥을 통해 심전도 전달 시스템을 사용하여 5 분 동안 60 mmHg의 일정한 압력으로 심전도 용액을 주입하십시오. 주입 압력은 물 기둥의 높이를 변경하여 수정할 수 있습니다.
4. 심전증 주입의 끝에서, 구부러진 집게를 사용하여 폐 동맥에서 오름차순 근위 대동맥을 해부(보충 그림 4A). 대동맥을 왼쪽 쇄골 동맥으로 잘라냅니다. Langendorff 장치에 대한 캐너레이션에 대한 적어도 0.5 cm의 대동맥 길이를 확인합니다.
5. 대동맥에서 심장을 잡고, 폐 정맥 및 기타 흉부 구조에서 심장을 분리하여 절제술을 완료하십시오 (보충그림 4B). 급속하게, 생체 외 시스템으로 신속한 수송을 위한 얼음 차가운 Krebs 해결책에 심혼을 잠급기. 해부 및 운송 시간을 가능한 한 짧게 유지하십시오 (5 분).

4. 전 생체 내 심혼 관류 시스템 (EVHP) 및 심장 기능 평가

1. 집게를 사용하여 대동맥 루멘을 엽니다. 관상 동맥 용기에 거품을 강제로 피하기 위해 떨어지는 크렙스 용액으로 루멘을 채우어 대동맥을 제거합니다. 대동맥에 캐뉼라를 내리고 대동맥 뿌리를 통과시키지 않도록주의하거나 대동맥 판막 전단지를 손상시키지 않도록하십시오. 작은 클램프로 설정을 수정합니다.
2. 2 way 스톱콕을 사용하여 대류에서 누출 가능성을 검색하는 흐름을 늘립니다. 아무도 발견되지 않으면 2-0 실크 봉합사를 사용하여 대장을 캐뉼러에 단단히 고정하십시오. 캐뉼라로의 흐름을 완전히 엽니다. 60-70 mmHg의 생리적 압력에서 대동맥 압력을 유지하십시오 (시스템의 높이를 변경하여 조정). 이 시점에서 초기 재관류 및 안정화 시간이 시작됩니다. 대동맥 압은 조사자의 실험 계획에 따라 수정될 수 있습니다.
3. 심장(심토리)의 기저부가 압력 센서를 향하도록 하트를 회전시다. 폐 정맥을 해부하여 좌심실 심방 개구부를 넓히. 압력 센서에 연결된 라텍스 풍선을 삽입합니다. 육안 검사를 통해 풍선이 심실 내부에 완전히 배치되었는지 확인하십시오. 끝 확장기 압력 (EDP)가 15mmHg로 설정 될 때까지 천천히 식염수로 풍선을 채웁니다. EDP를 일정하게 유지하기 위해 필요에 따라 조정합니다(미리 결정된 생리적 EDP). EDP는 각 조사자의 실험 목표에 따라 조정할 수 있습니다.
4. 심장의 앞쪽에 진도 전극을 삽입하십시오 (우심실 유출 관). 관상 동맥 혈관에 구멍을 뚫지마십시오. 일단 자발적인 박동이 관찰되면, 분당 300 비트에서 진도를 시작합니다. 필수 전압은 실험과 쥐 균주 사이에서 다를 수 있습니다.
5. 안정화 10분 후, 지속적인 혈관 내 압력 측정 기록을 시작합니다. 이 순간은 1시간 동안 지속되는 재조정 및 평가 단계(시간 0)의 시작으로 간주됩니다(그림 2). 재조정은 연장될 수 있지만, 모든 마음속에 는 시간 의존적인 수축이 예상됩니다.
6. 재조정이 시작되면 기준관상 유량 평가 및 생화학 분석을 위해 심장 정맥에서 5 분 동안 심장 유출물을 수집합니다. 트로포닌 T의 경우 15분마다 반복합니다(0, 15, 30, 45, 60분). 수집 시간의 개별화가 필요한 다른 분석 (그림2).

5. 경험의 끝

1. 랑엔도르프 장치에서 하트를 제거합니다.
2. 직선 높은 탄소 강철 블레이드 (마이크로 토메 블레이드 또는 이와 유사한)를 사용하여 심장의 염기를 제거하십시오 (대동맥 및 폐 동맥 포함).
3. 오른쪽 심실이 아래를 향하면 1-2mm 두께의 가로 심실 슬라이드를 잘라냅니다. 한 대표 섹션 (일반적으로 세 번째)에서 우심실을 절제하고 좌심실을 동결시면 됩니다. 이 샘플은 생화학 분석에 사용할 수 있습니다.
4. 37°C에서 10분 동안 상업적인 인산완충액 염수 pH 7.4에서 5% 2,3,5-트리페닐-테트라졸륨 염화물에 나머지 부분을 담급니다. 실행 가능한 조직은 붉은 벽돌로 칠해 있습니다.
5. 인산완충식염수 pH 7.4로 2회 세척하고 밤새 4°C에서 10% 포르말린으로 고정합니다. 인산염 완충 식염수 pH 7.4로 두 번 씻고 각 슬라이스를 물에 잠겼습니다.
6. 각 슬라이드마다 여분의 액체와 무게를 빼냅니다. 양쪽의 디지털 컬러 이미지를 가져 가라. 평면 도수 분석을 사용하여 경색 크기를 계산하고 슬라이스 및 총 심실 중량에 대해 정확합니다. 시간이 지남에 따라 착색이 희미해집니다. 가능한 한 빨리 사진을 찍어야합니다.

6. 데이터 분석

1. 동물당 새 파일에 모든 압력 데이터를 저장합니다.
2. 압력 해석의 경우 시간점당 최소 200회 압력 사이클을 선택합니다. 분석은 전용 소프트웨어(예: LabChart)를 사용하여 오프라인(실험 완료 후)을 수행할 수 있습니다. 사용 가능한 일반적인 심장 혈관 매개 변수는 다음과 같습니다 : 최대 생성 압력, 끝 확장기 압력, +dP / dt (압력 곡선의 업 스트로크 동안 가파른 경사, 심실 수축 능력의 지표), -dP / dt (동안 가장 가파른 경사) 압력 곡선의 다운 스트로크, 심실 이완 용량의 지표) 다른 사람의 사이에서.
   참고: 트로포닌 분석의 경우 재관류시 트로포닌 방출이 증가할 것으로 예상됩니다. EVHP 시스템에서 1시간 의 재관류 후, 트로포닌 수준은 기준선으로 감소할 수 있으며, 이러한 샘플의 수집 및 취급시 신중한 타이밍의 필요성을 강조합니다.

결과

퇴출 후, 혈압은 예측 가능한 패턴으로급격히 감소합니다(그림 3). 예상 사망 시간은 5분 미만입니다.

그림 4는 WIT의 0, 10 및 15분 후 재조정이 시작될 때의 평균 압력/시간 곡선을 보여줍니다. 수축 기능은 시간이 지남에 따라 향상됩니다. WIT의 짧은 기간을 사용하면 수축이 정상으로 돌아갈 수 있으며 형태학적 손상은 감지할 수 없?...

토론

여기에 제시 된 프로토콜은 심장 기능 회복, 조직 손상 및 기증자의 회복을 개선하기 위해 사후 컨디셔닝 심장 보호 제의 사용을 평가 할 수있는 기회를 제공하는 심장 DCD의 간단하고 편리하고 다양한 모델을 소개합니다. 그렇지 않으면 이식을 위해 버려진 마음. Ex vivo 심장 관류 시스템(EVHP) 시스템은 심장 기능을 평가하기 위한 플랫폼을 제공하고 컨디셔닝 후 약리작용제로 보충된 수정 된 솔루?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride. 1 L bag	Baxter		Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system.
14 G 2" I.V catheter	Jelco	4098	To act as endotracheal tube.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Milipore-Sigma	T8877	Vital coloration
22 G 1" I.V catheter	BD	383532	I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization
Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr	Skalar	50-3147	Additional forceps for tissue manipulation
Alm Self-retaining retractor 4x4 Teeth Blunt 2-3/4"	Skalar	22-9027	Tissue retractor used to maintain the chest open.
Bridge amp	ADinstruments	FE221	Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement
Calcium chloride	Milipore-Sigma	C1016	CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution
D-(+)-Glucose	Milipore-Sigma	G8270	D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution
DIN(8) to Disposable BP Transducer	ADinstruments	MLAC06	Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer
Disposable BP Transducer (stopcock)	ADinstruments	MLT0670	Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement
dPBS	Gibco	14190-144	Electrolyte solution without calcium or magnesium.
Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4"	Skalar	66-2740	Additional forceps for tissue manipulation
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Milipore-Sigma	HT501128	Fixative solution
Heating Pad	Sunbean	756-CN
Heparin sodium 1,000 UI/mL	Sandoz		For systemic anticoagulation
Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0%	Fisher scientific	A144-500	Diluted 1:1 for pH correction
Ketamine	Bimeda		Anesthetic. 100 mg/mL
LabChart	ADinstruments		Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled
Left ventricle pressure balloon	Radnoti	170404	In latex. Size 4.
Lidocaine HCl 2% solution	AstraZeneca		Antiarrhythmic for the cardioplegic solution
Magnesium Chloride ACS	ACP Chemicals	M-0460	MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution
Micro pressure sensor	Radnoti	159905	Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon
Pacemaker	Biotronik	Reliaty	Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm.
pH bench top meter	Fisher scientific	AE150
Physiological monitor	Kent Scientific	Physiosuite	For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure
Plasma-Lyte A	Baxter		Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia
Potassium Chloride	Milipore-Sigma	P4504	KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution
Potassium Chloride 2 meq/ml	Hospira		Part of the cardioplegic solution
PowerLab 8/30 Polygraph	ADinstruments		Electronic polygraph
Silk 2-0	Ethicon	A305H	Suture material for Langendorff apparatus
Silk 5-0	Ethicon	A302H	Suture material for carotid
Small animal anesthesia workstation	Hallowell EMC	000A2770	Small animal ventilator
Sodium bicarbonate	Milipore-Sigma	S5761	NaHCO3 ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Chloride	Milipore-Sigma	S7653	NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution
Sodium Hydroxide pellets	ACP chemicals	S3700	Diluted to 5 N (10 g in 50 mL) for pH correction
Sodium phosphate monobasic	Milipore-Sigma	S0751	NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution
Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2"	Skalar	22-1240	Small scisors for atria and cava vein opening
Tissue slicer blades	Thomas scientific	6727C18	Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol
Tuberculin safety syringe with needle 25 G 5/8"	CardinalHealth	8881511235	For heparin injection
Veterinary General Surgery Set	Skalar	98-1275	Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps
Veterinary Micro Set	Skalar	98-1311	Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening
Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system	Radnoti	120101BEZ	Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock
Xylazine	Bayer		Sedative. 20 mg/mL