En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.

Resumen

El ozono (O₃₎es un contaminante del aire criterio que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas. Se sabe que la exposición a O₃ induce inflamación pulmonar, pero se sabe poco con respecto a cómo la exposición altera los procesos importantes para la resolución de la inflamación. La efferocitasis es un proceso de resolución, mediante el que los macrófagos fagocytizan las células apoptóticas. El propósito de este protocolo es medir la eferocitis de los macrófagos alveolares después de la lesión pulmonar inducida por O₃y la inflamación. Se han descrito varios métodos para medir la eferocitosis; sin embargo, la mayoría requieren manipulaciones ex vivo. Aquí se describe en detalle un protocolo para medir la efistosis de macrófagos alveolares in vivo 24 h después de la exposición a O_3, que evita la manipulación ex vivo de los macrófagos y sirve como una técnica simple que se puede utilizar para perturbar con precisión las representaciones en este proceso de resolución. El protocolo es un método técnicamente no intensivo y relativamente barato que implica inhalación de O₃ de todo el cuerpo seguida de la aspiración orofaríngea de células apoptóticas (es decir, células T Jurkat) mientras está bajo anestesia general. La eferocitosis de macrófagos alveolares se mide entonces mediante la evaluación por microscopía de luz de macrófagos recogidos del lavado broncoalveolar (BAL). La eferocítis finalmente se mide calculando un índice efferocítico. Colectivamente, los métodos descritos cuantifican la actividad efferocí en el pulmón in vivo mientras que también sirven para analizar los efectos negativos para la salud de O₃ u otros insultos inhalados.

Introducción

El pulmón está constantemente expuesto a insultos ambientales, incluyendo partículas de aire, virus, bacterias y gases oxidantes que desencadenan inflamación pulmonar^1,2,3. Estos insultos pueden comprometer el intercambio de gas e inducir lesiones de tejido^{irreversibles 4,5}. Los macrófagos alveolares, que constituyen aproximadamente el 95% de las células inmunitarias que se encuentran en los pulmones murinos y humanos en la homeostasis, son reguladores críticos de la inflamación pulmonar después de los insultos ambientales^{1,2, 3,4,5}. Los macrófagos alveolares son esenciales durante la defensa del huésped al fagocica y eliminando patógenos. Recientemente, se ha demostrado que los macrófagos alveolares promueven la homeostasis tisular y la resolución de la inflamación a través de la eferocitosis^6,7. La efferocitasis es un proceso fagocítico en el que los macrófagos envuelven y eliminan las células apoptóticas^8,9,10. La eferocitosis también da lugar a la producción de mediadores (es decir, IL-10, TGF-, PGE₂y óxido nítrico) que aumentan aún más el proceso, lo que resulta en la resolución de la inflamación^{9,10,11 ,12,16,18}. Este proceso es necesario para prevenir la necrosis secundaria y promover la homeostasis tisular^12,13,14. Varios estudios han relacionado la insuficiencia efefitosis con diversas enfermedades pulmonares crónicas, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y fibrosis pulmonar idiopática^{8,9,15, 16,17}.

O₃ es un criterio contaminante del aire que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas^19,20,21. O₃ induce inflamación pulmonar y lesión y se sabe que afecta la fagocitosis de los patógenos bacterianos^22,23. Sin embargo, se desconoce si O₃ afecta a la eferocitosis de macrófagos alveolares. La investigación de alteraciones inducidas por O₃en la eferocitais de macrófagos alveolares proporcionará una visión potencial de cómo la exposición puede conducir a la incidencia y exacerbación de enfermedades pulmonares crónicas. A continuación se describe un método sencillo para evaluar la eferocítosis de macrófagos alveolares en los pulmones de ratones hembras después de la exposición aguda a O_3.

El método esbozado posee varias ventajas sobre otros protocolos de efferocittosis comúnmente utilizados en el campo al eliminar el uso de costosos colorantes fluorescentes, mediciones extensas de citometría de flujo y manipulación ex vivo de macrófagos alveolares^{24 ,25}. Además, este protocolo mide la eferocítis de macrófagos alveolares en el contexto del microambiente pulmonar, que puede influir en la función de los macrófagos.

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Protocolo

Todos los métodos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Este.

1. Ozono (O₃) y exposiciones al aire filtrado (Día 1)

1. Coloque un máximo de 12 hembras de ratones C57BL/6J, de 8 a 12 semanas de edad, en una jaula de acero (con 12 compartimentos separados) con tapas de malla de alambre en una cámara de exposición O_3.
2. Coloque el termómetro en la cámara de exposición con la jaula para registrar con precisión la temperatura y la humedad.
3. Encienda la luz ultravioleta (UV) que está conectada al aparato.
   NOTA: Flujo de aire regulado (>30 cambios de aire/h) con temperatura controlada (22-23 oC) y humedad relativa (45%-50%) se obtiene por el aparato O_3. O₃ es generado por el sistema en la cámara de exposición dirigiendo 100% de oxígeno a través de un generador de luz UV, luego mezclando con un suministro de aire filtrado.
4. Ajuste la concentración de O₃ a 1 ppm y registre regularmente O₃ niveles cada 10 min durante 3 h. Monitoree continuamente la temperatura y humedad del aire de la cámara, al igual que la concentración de O₃ con un fotómetro de luz UV.
   NOTA: Las exposiciones de aire filtradas se realizan en un aparato similar, con sólo un suministro de aire filtrado fluyendo a través de la cámara de exposición.
5. Devolver a los animales a sus respectivas jaulas con ropa de cama, alimentos y agua ad libitum después de 3 h de O₃/ exposición al aire filtrado.

2. Preparación de la línea celular Jurkat T (Día 2)

NOTA: Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en un armario de seguridad biológica de clase II.

1. Cultivo de células T Jurkat en 24 mL de medio de cultivo celular basal + 10% FBS + 5% penicilina/estreptomicina a 37 oC + 5% CO₂ (Tabla de material). Las células T de Jurkat son una línea celular de suspensión que se puede mantener a través del paso 1:6-1:8 en medios de cultivo precalentados cada 3 días. No te muevas.
2. Para preparar células apoptóticas, hazque crecer hasta un 90% de confluencia en cada matraz (que tarda 3-4 días en lograrse después del paso). Para este estudio, utilice células de cinco matraces T75 para obtener el número suficiente de células utilizadas en este protocolo.
   NOTA: Un matraz confluente contiene alrededor de 20-24 millones de células.
3. Pipetear las células (que es todo el matraz) de cada matraz (aproximadamente 24 ml) y transferir las células a un tubo cónico estéril de 50 ml utilizando una pipeta serológica. Utilice varios tubos cónicos para varios matraces.
4. Cuente las células mediante la eliminación de una alícuota de 11 ml de células del tubo cónico de 50 ml y mezcle con 11 ml de mancha azul de trippan y pipeta de 11 ol en diapositivas hemocitómetros.
5. Inserte la diapositiva en un contador de celdas automatizado y registre el número de celdas vivas para calcular el recuento total de celdas en cada matraz multiplicando el número de celdas vivas por 24, ya que cada matraz contiene 24 ml de medios.
6. Centrifugar la suspensión celular a 271 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) a las células de pellets.
7. Deseche el sobrenadante por aspiración y resuspenda el pellet celular en medios para obtener 3.0 x 10⁶ células por ml.
8. Aliquot 5 mL de células en platos de cultivo de tejido de 100 mm x 20 mm (se utilizarán aproximadamente nueve platos; la cantidad total de células en cada plato debe ser de 15 x 10⁶).
9. Utilice un plato para el control / no expuesto, y los platos restantes se expondrán a los rayos UV.
10. Ajuste el retitulador UV al nivel de energía correcto, pulse el botón de energía e introduzca "600" con la almohadilla numérica, que la máquina leerá como 600 j/cm² x 100.
    NOTA: Las unidades de energía del retitulador UV se encuentra en el valor de "J/cm² x 100"; por lo tanto, para lograr 60 milijoules/cm^2,convertir unidades para que coincidan con el retitulador UV.
11. Irradiar todos los platos con células, sin incluir el control, a 60 milijoules (mJ)/cm² utilizando el retivíador UV. Retire la cubierta superior de los platos de cultivo de tejido durante la exposición uv, ya que la luz UV no penetrará en la cubierta de plástico.
12. Incubar todos los platos en una incubadora de cultivo celular, incluido el control no expuesto, a 37oC a 5%_co2 durante 4 h.
13. Confirmar la apoptosis por citometría de flujo utilizando un kit de detección de ensayo de apoptosis que contiene annexin V y yoduro propidium (PI) (marcadores para apoptosis y necrosis, respectivamente) después de 4 h de incubación, según las instrucciones del fabricante^{26, 27}.
    NOTA: Irradiar las células T de Jurkat en el reticulante UV a un nivel de energía de 600 oJ/cm², después de una incubación de 4 h conducirá a que las células apoptoticas (tanto tempranas como tardías) tengan más fenotipo apoptotico temprano que el fenotipo apoptótico tardío. Esto hace que sea más fácil para los macrófagos alveolares reconocerlos y engullir ya que sus membranas no están comprometidas, a diferencia de las células apoptópicas tardías, lo que conduce a un índice efítico más alto y a imágenes más precisas de la eferocittosis de macrófagos alveolares en este estudio.
    1. Piscina 333 l (1 x 10⁶ células) de células T Jurkat de varios platos (ambos "sin UV" y "expuestos a los rayos UV") juntos para su uso para tubos de análisis de compensación.
    2. Aliquot 333 l de células T de Jurkat en una sola mancha no manchada, anexión En V, PI sola mancha, sin control UV, y 600 tubos de citometría de flujo etiquetados con uv expuestos a^UV.
    3. Tubos centrífugos a 188 x g durante 5 min en RT y decantar el sobrenadante.
    4. Lave las células resuponiendo en 500 ml de solución salina fría y 1x con fosfato(PBS).
    5. Células de centrífuga y pellet a 188 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
    6. Preparar 400 ml de 1 x tampón de unión por tubo de flujo diluyendo 10x tampón de unión con agua destilada mientras las células se centrifugan.
    7. Preparar el reactivo de incubación annexin V y PI (100 ml por muestra/tubo) según las instrucciones del fabricante.
    8. Decantar el sobrenadante después de la centrifugación y resuspender suavemente todos los tubos en 400 l de tampón de unión 1x, luego añadir 100 l de reactivo de incubación annexin V a cada tubo de muestra. Por último, añada 100 ml de tinción única annexin V y PI de una sola mancha a sus respectivos tubos, pero no añada nada más allá del búfer de unión 1x al tubo no manchado.
    9. Incubar tubos en la oscuridad durante 15 minutos a RT.
    10. Centrifugar todas las células a 188 x g durante 5 min en RT y sobrenadante decant.
    11. Resuspenda las células en 400 s de búfer de unión 1x y, a continuación, analice las muestras para la apoptosis por citometría de flujo. Recopile al menos 10.000 eventos por tubo para permitir una representación precisa de la tinción.
14. Combine todas las células irradiadas de los platos en un tubo cónico de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 271 x g durante 5 min a RT.
15. Deseche el sobrenadante del tubo por aspiración y resuspenda las células en 24 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y células de pellets por centrifugación a 271 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
16. Deseche el sobrenadante del tubo por aspiración y resuspenda las células en la cantidad de PBS utilizada para la dosificación de ratones aprobados por IACUC. La dosis utilizada es de entre 5-10 x 10⁶ células/50 L por ratón; por lo tanto, para 10 ratones, resuspender en 500 l (el número de células en cada dosis varía dependiendo de cuántas células se cultivan para la irradiación).
    NOTA: Maquillaje de al menos dos dosis adicionales para tener en cuenta cualquier líquido que pueda pegarse a los lados de la punta de la pipeta resultando en la pérdida de células.

3. Instilación orofaríngea murina de células apoptópicas (Día 2)

1. Preparar la dosificación del inóculo de células apoptóticas utilizando una pipeta P200 antes de anestesiar ratones para acelerar el procedimiento. Según las pautas institucionales, se utiliza un volumen de 50 l que contiene aproximadamente 5-10 x 10⁶ células para la instilación orofaríngea (o.p.) para asegurar los mejores resultados.
2. Anestetizar ratones en una cámara transparente con 2% de isoflurano a un caudal de 1 L/min o según las directrices institucionales. Anestesiar de uno a dos ratones a la vez; el número está determinado por el nivel de comodidad del experimentador. Observe el patrón respiratorio y confirme que las respiraciones profundas son visibles con recuentos de 2 a 3 s entre respiraciones. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
3. Coloque el ratón en una posición supina semi-recumbent. Utilice una cuerda quirúrgica atada entre clavijas en un tablero de lámina de acrílico con inclinación para suspender por los incisivos maxilares.
4. Usando un par de fórceps no-ridged contundentes, agarre ligeramente y tire de la lengua del ratón. Inculcar las células apoptóticas en la cavidad oral con una pipeta P200. La dosificación es exitosa cuando los ratones hacen un ruido crepitante 1–2 s después de administrar la dosis.
   NOTA: Tenga cuidado de evitar inducir traumatismos a la lengua o a la orofaringe antes de la instilación de células apoptóticas.
5. Con un dedo enguantado, bloquee suavemente la nariz hasta que el ratón se inhale mientras la lengua se retrae. Cubra la nariz hasta que no haya líquido visible en la cavidad oral y el ratón haya tomado dos o más inhalaciones.
   NOTA: Como los ratones son respiradores de nariz obligatorios, cubrir la nariz ayuda a asegurar que el ratón inhalará las células apoptoticas en los pulmones.
6. Retire el ratón de la placa de inoculación y devuélvalo a la jaula para permitir la recuperación de la anestesia. Coloque el ratón sobre su espalda para evitar que la ropa de cama o los escombros bloqueen las nares durante el revovery.
7. Espere 90 minutos después de que el ratón se recupere de la anestesia para permitir que los macrófagos alveolares envuelvan la afluencia de células apoptópicas después de que todos los ratones se hayan despertado de la anestesia. Típicamente, despertar después de la anestesia tomará 1-2 min, lo que no debe afectar el resultado /timing de la instilación.

4. Recolección y procesamiento de fluidos de lavado broncoalveolar (Día 2)

1. Euthanizar cada ratón según las pautas institucionales 90 min después de que el ratón se ha despertado de la anestesia de la dosificación con células apoptoticas. Aquí, se utiliza una inyección letal de ketamina y xilazina (90 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente) seguida de una excising del diafragma.
   NOTA: Este punto de tiempo permite tiempo suficiente para que los macrófagos alveolares perciban y envuelvan las células apoptópicas^38.
2. Pesar todos los ratones (g) en una báscula y registrar pesos. Utilice el peso corporal para calcular el volumen BAL (26,25 ml/kg de peso corporal).
3. Coloque ratones en la espalda y rocíe 70% de etanol para esterilizar la zona del pecho y el cuello.
4. Hacer un corte longitudinal de 2" justo debajo del esternón a lo largo de todo el lado ventral con tijeras quirúrgicas, y mientras sostiene el esternón con fórceps, cortar el diafragma para permitir que los pulmones caigan de nuevo en la cavidad torácica.
5. Corte lateralmente a lo largo de los lados de la caja torácica para permitir que los pulmones se expandan más al lavaging, luego doble la cavidad torácica hacia atrás con fórceps.
6. Hacer un corte vertical de 1" a lo largo de la vasculatura a través del cuello para exponer la tráquea.
7. Use dos fórceps para extraer músculo y tejido de la tráquea y exponerla. Evite el sangrado potencial adicional y cortar la tráquea, ya que está rodeada de vasculatura, músculos longitudinales y tejido conectivo.
8. Utilice una aguja para hacer una hendidura en la tráquea (aproximadamente un cuarto de la distancia hacia abajo de la cabeza) e inserte una cánula (18 G x 1,25") con una jeringa precargada con 1 PBS (26,25 ml/kg de peso corporal, 0,7-1,0 ml en un ratón C57Bl/6J de 8-10 semanas) Hea.
9. Empuje el volumen de PBS en los pulmones lentamente para permitir que los pulmones se inflan y luego, tire del volumen hacia fuera hacia la jeringa. Repita este proceso un total de 3 veces.
10. Recoja el líquido de lavado agrupado de cada ratón específico en un tubo de 15 ml.
11. Centrifugar el lavado broncoalveolar a 610 x g durante 6 min a 4 oC y recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y congelar a -80 oC. El pellet representa células del espacio broncoalveolar.
12. Retire los glóbulos rojos residuales en el líquido BAL recogido agregando 1 ml de tampón de lisis ACK RBC al pellet celular, luego vórtice bien y la leja durante 1 min sobre hielo. Después, agregue 4 ml de PBS para detener la reacción de lisis.
13. Células de pelet por centrifugación a 610 x g durante 6 min a 4oC y aspirar el sobrenadante con un aspirador de vacío.
14. Resuspenda las células en 1 ml de 1pbS + 10% FBS a cada tubo de muestra BAL. Cuente las células en un hemocitómetro para la cuantificación de las células del espacio aéreo total de cada muestra (sin trippan azul). Centrifugar 120 l de cada muestra en diapositivas a 56 x g durante 3 min, utilizando una aceleración media y una citocentrífuga. Seque los portaobjetos durante la noche.

5. Cálculo del índice efítico de macrófagos alveolares (Día 3)

1. Mancha las diapositivas con hematoxilina y eosina para permitir el cálculo de los recuentos de células feroces y diferenciales, con al menos 200 células contadas de cada diapositiva.
2. Vea diapositivas bajo un ajuste de campo brillante en un microscopio biológico (un objetivo de 20x o 40x funcionará mejor).
3. Calcular el índice efítico basado en la relación entre el número de macrófagos alveolares que fagocytosed apoptotic Jurkat T células a los macrófagos alveolares sin la acumulación de células apoptóticas de un total de 200 macrófagos en una diapositiva diferencial celular. Convierta la relación en un porcentaje para la entrada de datos. Utilice la siguiente ecuación:

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Resultados

Se sabe que la exposición a O₃ induce inflamación pulmonar y lesiones, y se requiere eferocitasis para mantener la homeostasis tisular. Los ratones hembra C57BL/6J fueron expuestos a aire filtrado (FA) o 1 ppm O₃ durante 3 h y necropsiados 24 h después de la exposición para examinar la inflamación pulmonar y lesiones. Los ratones o₃expuestos mostraron un aumento significativo de macrófagos y neutrófilos en el espacio aéreo en comparación con el gr...

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Discusión

La eferocitosis es un proceso antiinflamatorio en el que los macrófagos limpian las células apoptoticas y los desechos, así como producen múltiples mediadores antiinflamatorios^{9,10,11,12,16 ,18}. Múltiples modelos de efferocittosis han proporcionado información sobre cómo el macrófago es una célula crítica en la res...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC Kit	Trevigen	4830-250-K	The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells	ATCC	ATCC CRL-2899	The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.
Countess II Automated Cell Counter	Thermofisher	AMQAX1000	It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher	A78300003	Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermofisher	16140071	Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin	Thermofisher	9990706	Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative	Thermofisher	9990705	Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue	Thermofisher	9990707	Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermofisher	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	Cambridge Scientific	16659	The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer	Teledyne API	T400	The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator	Teledyne API	T703	Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.