オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

要約

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。

要約

オ_ゾン(O3)は、慢性肺疾患の発生率を悪化させ、増加させる基準である。O₃暴露は肺炎症を誘発することが知られているが、暴露が炎症の解決に重要なプロセスをどのように変化させるかについてはほとんど知られていない。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞を食細胞化する分解能プロセスである。このプロトコルの目的は、O3誘発性肺損傷および炎症に続く肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定することである。エフェロサイトアシスを測定するためのいくつかの方法が記載されています。ただし、ほとんどの場合、ex vivo 操作が必要です。ここでは詳細に説明するO₃暴露後の生体内肺胞マクロファージエフェロサイトシス24hで測定するプロトコルであり、マクロファージの排外操作を回避し、摂動を正確に表現するために使用できる簡単な技術として機能する。この解決プロセス。このプロトコルは、_全身O3吸入に続いて、全身麻酔下でアポトーシス細胞(すなわち、Jurkat T細胞)の口腔咽頭吸引を伴う技術的に非集中的で比較的安価な方法である。次いで、気管支アルフェオール(BAL)洗浄剤から採取したマクロファージの光顕微鏡検査評価により、肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定する。エフェロサイトシスは、最終的に発泡性指数を計算することによって測定される。概説された方法は、生体内の肺における発泡性活性を定量化する一方で、O3または他の吸入された侮辱の負の健康影響を分析するのに役立つ。

概要

肺は常に肺の炎症を引き起こす空気微粒子、ウイルス、細菌、および酸化性ガスを含む環境侮辱^{にさらされている1、2、3。}これらの侮辱は、ガス交換を危険にさらし、不可逆的な組織^損傷4、5を誘発することができます。恒常性におけるマウスおよびヒト肺に見られる免疫細胞の約95%を構成する肺胞マクロファージは、環境^{侮辱1、2後の肺炎症の重要な調節薬である。3,4,5}.肺胞マクロファージは、病原体を食器化および排除することにより宿主防御中に不可欠である。最近、肺胞マクロファージは、組織恒常性および発泡細胞^症6、7を介した炎症の解決を促進することが示されている。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス^{細胞8、9、10}を巻き込み、排除する食細胞プロセスである。エフェロサイトーシスはまた、プロセスをさらに増強するメディエーター(すなわち、IL-10、TGF-β、PGE2、および一酸化窒素)の産生をもたらし、炎症9、10、11の解決をもたらす ^,12,16,18.このプロセスは、二次壊死を予防し、組織恒常性を促進するために必要です^12,13,14.いくつかの研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および特発性肺線維^{症8、9、15}を含む様々な慢性肺疾患と損なわれた肺細胞症をリンクしています。 ^16、17.

O3は、慢性肺^{疾患19、20、21}の発生率を悪化させ、増加させる基準大気汚染物質である。O3は肺炎症および損傷を誘発し、細菌病原^体22,23の肺胞マクロファージ性細胞症を損なう知られている。しかし、O3が肺胞マクロファージエフェロサイトーシスを損なうかどうかは不明である。O_3-誘導性の肺マクロファージエフェロサイトーシスの改変を調べると、暴露が慢性肺疾患の発生率および悪化につながる方法についての潜在的な洞察を提供する。以下に説明する_急性O3曝露後の雌マウスの肺における肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価する簡単な方法である。

概説された方法は、高価な蛍光色素、広範なフローサイトメトリー測定、および肺胞マクロファージ24の外生操作の使用を排除することにより、この分野で一般的に使用される他のエフェロサイトーシスプロトコルに対していくつかの利点を有する。 ^、25.さらに、このプロトコルは、マクロファージ機能に影響を与える可能性のある肺微小環境のコンテキストで肺胞マクロファージエフェロサイトシスを測定します。

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プロトコル

すべての方法は、イーストカロライナ大学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. オ_ゾン(O3)とろ過空気暴露(1日目)

1. 最大12匹のメスC57BL/6Jマウス(生後8~12週齢)を、金網蓋付きのスチールケージ(12個の別々のコンパートメント付き)に入れ、O3露光室に入れます。
2. 温度と湿度を正確に記録するために、ケージと露出室に温度計を置きます。
3. 装置に取り付けられている酸素と紫外線(UV)光をオンにします。
   注:制御された温度(22-23 °C)および相対湿度(45%-50%)との調節された気流(>30空気変化/h)O3装置によって得られる。_O3は、UV光発生器を介して100%酸素を指示し、濾過された空気供給と混合することによって、露光室内のシステムによって生成されます。
4. O₃濃度を1ppmに調整し、定期的に3時間毎に10分ごとにO3_レベルを記録し、紫外線光量計_でO3濃度と同様に、チャンバー空気の温度と湿度を継続的に監視します。
   注:ろ過された空気の露出は、露出室を流れるろ過された空気供給だけを使用して、同様の装置で行われます。
5. O₃/ろ過された空気暴露の3時間後に寝具、食べ物、水のアドリビタムとそれぞれのケージに動物を返します。

2. ユルカットT細胞株の調製(2日目)

注:すべての手順は、クラスIIの生物学的安全キャビネットで行われるべきです。

1. 基底細胞培地培地24mLにおけるジュルカットT細胞+10%FBS+5%ペニシリン/ストレプトマイシン37°C+5%CO2(材料表)。Jurkat T細胞は、3日ごとに予温められた培養培地に1:6-1:8を通過して維持することができる懸濁細胞株である。揺らさないで
2. アポトーシス細胞を調製するには、各フラスコで90%の合流性に成長させる(通過後3〜4日かかります)。この研究では、5つのT75フラスコの細胞を使用して、このプロトコルで使用される十分な数の細胞を得る。
   注:コンフルエントフラスコには約20〜2400万個の細胞が含まれています。
3. 各フラスコ(約24mL)からピペットアップセル(フラスコ全体)を上げ、血清ピペットを用いて無菌50mL円錐管に細胞を移します。複数のフラスコには複数の円錐管を使用します。
4. 50 mL円錐管から細胞の11 μLアリコートを除去して細胞を数え、11 μLのトリパンブルーステインとピペット11μLをヘモサイトメータースライドに混ぜます。
5. 自動セル カウンタにスライドを挿入し、各フラスコに 24 mL のメディアが含まれているため、ライブ セルの総数を 24 で乗算して、各フラスコの合計セル数を計算します。
6. 細胞懸濁液を室温(RT)で5分間271xgでペレット細胞に遠心分離する。
7. 吸引によって上清を廃棄し、培養中の細胞ペレットを再懸濁し、mL当たり3.0 x 10^6細胞を得る。
8. 100mm x 20mm組織培養皿中の細胞のアリコート5 mL(約9皿が使用され、各皿の細胞の総量は〜15 x 10⁶⁾である必要があります。
9. コントロール/露出なしの1つの料理を使用し、残りの料理は紫外線にさらされます。
10. UVクロスリンカーを正しいエネルギーレベルに設定し、エネルギーボタンを押し、マシンが600 μJ/cm² x 100として読み取る数字パッドを使用して「600」と入力します。
    注:UV架リンカーエネルギーユニットはμJ/cm² x 100です。したがって、60ミリジュール/cm²を達成するために、UV架リンカーに一致するように単位を変換します。
11. UV架化機を使用して、60ミリジュール(mJ)/cm²で、コントロールを含まない細胞ですべての料理を照射します。紫外線がプラスチックカバーに浸透しないので、紫外線暴露中に組織培養皿の上部カバーを取り外します。
12. 非露光制御を含む細胞培養インキュベーター内のすべての料理を、5%CO₂で4時間37°Cでインキュベートします。
13. インキュベーションの4時間後にアネキシンVとヨウ化プロピジウム(PI)を含むアポトーシスアッセイ検出キットを用いたフローサイトメトリーによるアポトーシスを確認し、メーカーの^指示26に従って、²⁷.
    注:600 μJ/cm²のエネルギーレベルでUVクロスリンカーにJurkat T細胞を照射すると、4時間インキュベーションに続くと、後期アポトーシス表現型よりも早期アポトーシス表現型を有するアポトーシス(早期および後期の両方)細胞の≥75%が導き起こされます。これにより、肺胞マクロファージは、後期アポトーシス細胞とは異なり、それらを認識し、その膜が妥協されないので巻き込むのが容易になり、この研究では、より高い発泡性指数と肺胞マクロファーゲフェゲエフェロサイト症のより正確なイメージングにつながります。
    1. 複数の料理からジュルカットT細胞のプール333 μL(1 x 10⁶細胞)を一緒に補償分析チューブに使用します。
    2. 無染色、アネキシンV単一染色、PI単一染色、UVコントロールなし、および600 μJ/cm² UV露光標識流量細胞メトリーチューブ中のJurkat T細胞のAliquot 333 μL。
    3. RTで5分間188 x gの遠心管および上清をデカントする。
    4. 500μLの冷たい、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で再中断して細胞を洗浄します。
    5. 遠心分離機とペレット細胞はRTで188 x gで5分間、遠心分離後に上清を廃棄する。
    6. 細胞が遠心分離している間に蒸留水で10x結合バッファーを希釈することにより、フローチューブあたりの1x結合バッファーの400 μLを調製します。
    7. 製造元の指示に従って、アネキシンVおよびPIインキュベーション試薬(サンプル/チューブあたり100μL)を準備します。
    8. 遠心分離後に上清をデカントし、1x結合バッファーの400 μLですべてのチューブを穏やかに再中断し、各サンプルチューブに100 μLの附属Vインキュベーション試薬を追加します。最後に、それぞれのチューブに100 μLのアネキシンV単一染色とPI単一染色を追加しますが、1x結合バッファーを超えて汚れていないチューブに何も追加しないでください。
    9. RTで15分間暗闇の中でチューブをインキュベートします。
    10. RTおよびデカント上清で5分間188 x gですべての細胞を遠心分離する。
    11. 1x結合バッファーの400 μLで細胞を再中断し、フローサイトメトリーによってアポトーシスのサンプルを分析します。染色の正確な表現を可能にするために、チューブごとに少なくとも10,000のイベントを収集します。
14. 皿から照射されたすべての照射された細胞を50 mL円錐管およびペレット細胞に271 x gの遠心分離によってRTで5分間結合する。
15. 吸引によってチューブから上清を廃棄し、室温で5分間271 x gの遠心分離により無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)およびペレット細胞の24mLで細胞を再懸濁する。
16. 吸引によってチューブから上清を廃棄し、IACUCによって承認されたマウスの剤用に使用されるPBSの量で細胞を再懸濁する。使用される用量は、マウスあたり5-10 x 10⁶細胞/50 μLの間です。したがって、10匹のマウスについて、500μLで再中断する(各用量の細胞数は、照射のために培養される細胞の数によって異なる)。
    注:細胞の損失をもたらすピペット先端の側面に固執する可能性のある液体を説明するために、少なくとも2つの追加用量をメイクアップ。

3. アポトーシス細胞のマウスオリンパ管刺激(2日目)

1. 手順を促進するためにマウスを麻酔する前にP200ピペットを使用してアポトーシス細胞の剤の接種を準備する。制度ガイドラインに通じ、約5-10 x 10⁶細胞を含む50μLの体積を、最良の結果を確実にするために、眼咽頭(o.p.)の浸入に利用します。
2. 2%のイソルランを有する透明なチャンバー内のマウスを1 L/minの流量で、または制度ガイドラインに基づいた。一度に1~2匹のマウスを麻酔する。数は実験者の慰めのレベルによって決まる。呼吸パターンを観察し、深呼吸が呼吸間の2〜3のカウントで見であることを確認します。つま先のピンチに対する応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
3. マウスを半リカンベントのスポイン位置に配置します。上顎切開器によって中断するために傾斜したアクリルシートボード上のペグの間に結ばれた外科糸を使用する。
4. 鈍い非隆起のペアを使用して、軽くつかんで、マウスの舌を引っ張ります。P200ピペットを使用して口腔内にアポトーシス細胞を注入します。投与量を与える後、マウスがクラックノイズ1-2sを作るとき、投与は成功する。
   注:アポトーシス細胞の浸透前に舌または口腔咽頭のいずれかに外傷を誘発しないように注意してください。
5. 手袋をした指で、舌が引き込まれる間、マウスが吸い込むまで鼻をそっとブロックします。口腔に液体が見えなくなるまで鼻を覆い、マウスは2回以上吸入した。
   注:マウスは鼻呼吸を義務付けているので、鼻を覆う場合、マウスが肺にアポトーシス細胞を吸入することを確実にするのに役立ちます。
6. 接種ボードからマウスを取り出し、麻酔からの回復を可能にするためにケージに戻します。取り消し中に寝具や破片がナレを塞ぐのを防ぐために、マウスを背中に置きます。
7. マウスが麻酔から回復してから90分待って、すべてのマウスが麻酔から目覚めた後、肺胞マクロファージがアポトーシス細胞の流入を巻き込むことを可能にする。通常、麻酔後の目覚めは1-2分かかりますが、これは着着込の結果/タイミングに影響を与えるべきではありません。

4. 気管支体洗浄液の回収と処理(2日目)

1. 組織ガイドラインごとに各マウスを安楽死させる 90 分後にマウスがアポトーシス細胞を用いることを麻酔から目覚めた後に.ここで、ケタミンとキシラジンの致死的注射(それぞれ90mg/kgおよび10mg/kg)を使用し、その後に横隔膜を取り除く。
   注:この時点では、肺胞マクロファージがアポトーシス^細胞38を感知し、巻き込むのに十分な時間を可能にする。
2. すべてのマウス(g)をスケールで計量し、体重を記録する。本体重量を使用して BAL 体積 (26.25 mL/kg 体重) を計算します。
3. マウスを背中に置き、70%のエタノールをスプレーして胸部と頸部を殺菌します。
4. 外科はさみで腹部側全体に沿って胸骨のすぐ下に2"縦方向のカットを行い、鉗子で胸骨を保持しながら、肺が胸腔に戻るように横隔膜をニック。
5. 肋骨ケージの側面に沿って横に切断して、肺が溶岩を開くときに膨張する余地を増やしてから、胸腔を鉗子で折りたたみます。
6. 気管を露出させるために首を通して血管に沿って1"垂直カットを作ります。
7. 気管から筋肉や組織を引っ張り出し、それを露出させるために2つの鉗子を使用してください。血管系、縦筋、結合組織に囲まれているため、追加の潜在的な出血や気管の切断は避けてください。
8. 針を使って気管(頭部から約4分の1の距離)を作り、1x PBS(体重26.25mL/kg、体重約0.7-1.0mL)をあらかじめ装填したカニューレ(18G x 1.25インチ)を8-10週齢のメスC5Bに挿入します。ヘア。
9. PBSの体積をゆっくりと肺に押し込み、肺が膨張し、そのボリュームを注射器に引き戻します。このプロセスを合計 3 回繰り返します。
10. 15 mLチューブ内の各特定のマウスからプールされた洗浄液を収集します。
11. 気管支藻胞洗浄を610 x gで6分間4°Cで遠心分離し、上清を1.5mLチューブに集め、-80°Cで凍結します。ペレットは気管支肺胞空間からの細胞を表す。
12. 収集したBAL液中の残留赤血球を細胞ペレットに1mLのACK RBCリシスバッファーを加えて除去し、その後、よく渦を加え、氷上で1分間lyseします。その後、4mLのPBSを添加してリシス反応を止める。
13. ペレット細胞を4°Cで6分間610xgで遠心分離し、真空吸引器で上清を吸引する。
14. 各BALサンプルチューブに1x PBS + 10% FBSの1 mLで細胞を再中断します。各サンプルからの総空域細胞の定量のためにヘモサイトメーター上の細胞を数えます(トリパンブルーはありません)。各サンプルの遠心分離機 120 μL は、中程度の加速度とサイトセントリフュージを使用して、56 x gのスライドに 3 分間使用します。スライドを一晩乾かします。

5. 肺胞マクロファージ発血指数の計算(3日目)

1. ヘマトキシリンとエオシンでスライドを染色し、各スライドから少なくとも200個の細胞を数え、発泡細胞数と差動細胞数の両方を計算できるようにします。
2. 生体顕微鏡で明視野設定の下でスライドを表示します(20倍または40倍の目的が最適です)。
3. 細胞差スライド上の合計200個のマクロファージからアポトーシス細胞取り込みなしでアポトーシスのJurkat T細胞を肺胞マクロファージにファゴサイトスを投与した肺胞マクロファージの数の比率に基づいて、発泡性指数を計算する。比率をデータ入力のパーセンテージに変換します。次の式を使用します。

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結果

_O3暴露は肺の炎症および傷害を誘発することが知られており、組織恒常性を維持するためにはエフェロサイトーシスが必要である。C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppm_O3を3時間曝露し、24時間曝露後に肺炎症および損傷を調べた。_O3-露出マウスは、FA対照群と比較して空域におけるマクロファージおよび好中球の有意な増加を示した(

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ディスカッション

エフェロサイトーシスは、マクロファージがアポトーシス細胞や破片をクリアし、複数の抗炎症メディエーター9、10、11、12、16を産生する抗炎症プロセスです。 ^、18.エフェロサイトシスの複数のモデルは、マクロファージが^炎症6?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V-FITC Kit	Trevigen	4830-250-K	The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells	ATCC	ATCC CRL-2899	The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.
Countess II Automated Cell Counter	Thermofisher	AMQAX1000	It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher	A78300003	Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermofisher	16140071	Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin	Thermofisher	9990706	Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative	Thermofisher	9990705	Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue	Thermofisher	9990707	Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermofisher	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	Cambridge Scientific	16659	The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer	Teledyne API	T400	The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator	Teledyne API	T703	Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.