Visualización de la morfología de los astrocitos usando la iontoforesis amarilla de Lucifer

Resumen

Los astrocitos son células morfológicamente complejas, ejemplificadas por sus múltiples procesos y territorios tupidos. Para analizar su elaborada morfología, presentamos un protocolo fiable para realizar la iontoforesis amarilla de Lucifer intracelular en tejido ligeramente fijo.

Resumen

Los astrocitos son componentes esenciales de los circuitos neuronales. Azulejon todo el sistema nervioso central (SNC) y están involucrados en una variedad de funciones, que incluyen aclaramiento de neurotransmisores, regulación iónica, modulación sináptica, apoyo metabólico a las neuronas, y regulación del flujo sanguíneo. Los astrocitos son células complejas que tienen un soma, varias ramas principales y numerosos procesos finos que contactan diversos elementos celulares dentro del neuropil. Para evaluar la morfología de los astrocitos, es necesario disponer de un método fiable y reproducible para visualizar su estructura. Reportamos un protocolo confiable para realizar la iontoforesis intracelular de astrocitos usando el tinte fluorescente amarillo Lucifer (LY) en tejido cerebral ligeramente fijo de ratones adultos. Este método tiene varias características que son útiles para caracterizar la morfología de los astrocitos. Permite la reconstrucción tridimensional de astrocitos individuales, lo que es útil para realizar análisis morfológicos sobre diferentes aspectos de su estructura. La inmunohistoquímica junto con la iontoforesis LY también se puede utilizar para entender la interacción de los astrocitos con diferentes componentes del sistema nervioso y para evaluar la expresión de proteínas dentro de los astrocitos etiquetados. Este protocolo se puede implementar en una variedad de modelos de ratón de trastornos del SNC para examinar rigurosamente la morfología de los astrocitos con microscopía ligera. La iontoforesis LY proporciona un enfoque experimental para evaluar la estructura de los astrocitos, especialmente en el contexto de lesiones o enfermedades en las que se propone que estas células se sometan a cambios morfológicos significativos.

Introducción

Los astrocitos son las células gliales más abundantes en el sistema nervioso central (SNC). Juegan papeles en la homeostasis iónial, regulación del flujo sanguíneo, formación de sinapsis, así como la eliminación, y la aceptación de neurotransmisores¹. La amplia gama de funciones astrocitos se refleja en su compleja estructura morfológica^2,3. Los astrocitos contienen varias ramas primarias y secundarias que se dividen en miles de ramitas y foliolos más finos que interactúan directamente con sinapsis, dendritas, axones, vasos sanguíneos y otras células gliales. La morfología de los astrocitos varía según las diferentes regiones cerebrales, lo que puede insinuar su capacidad para realizar sus funciones diferencialmente en los circuitos neuronales^4. Además, se sabe que los astrocitos alteran su morfología durante el desarrollo, durante las condiciones fisiológicas, y en múltiples estados de enfermedad^3,5,6.

Se necesita un método consistente y reproducible para resolver con precisión la complejidad de la morfología de los astrocitos. Tradicionalmente, la inmunohistoquímica se ha utilizado para visualizar astrocitos con el uso de marcadores de proteínas específicas de astrocitos o enriquecidos con astrocitos. Sin embargo, estos métodos revelan el patrón de expresión de proteínas en lugar de la estructura del astrocito. Los marcadores de uso común, como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la proteína de unión al calcio S100 (S100), no se expresan en todo el volumen celular y, por lo tanto, no resuelven la morfología completa⁷. Los enfoques genéticos para expresar las proteínas fluorescentes de forma omnipresente en los astrocitos (inyecciones virales o líneas de reporteros de ratones transgénicos) pueden identificar las ramas más finas y el territorio en general. Sin embargo, es difícil diferenciar los astrocitos individuales, y los análisis pueden ser sesgados por la población de astrocitos a los que apunta el promotor específico^8. La microscopía electrónica de sección serial se ha utilizado para revelar una imagen detallada de las interacciones de los procesos de astrocitos con sinapsis. Debido a los miles de procesos de astrocitos que contactan con sinapsis, actualmente no es posible reconstruir una célula entera con esta técnica^9,aunque se espera que esto cambie con el uso de enfoques de aprendizaje automático para el análisis de datos.

En este informe, nos centramos en un procedimiento para caracterizar los astrocitos de ratón utilizando la iontoforesis intracelular con el tinte amarillo Lucifer (LY), utilizando como ejemplo el radiatum de estrato CA1. El método se basa en trabajos pasados pioneros de Eric Bushong y Mark Ellisman^10,11. Los astrocitos de las rebanadas cerebrales ligeramente fijas se identifican por su forma distintiva de soma y se llenan de LY. A continuación, las células se imagee con microscopía confocal. Demostramos cómo la iontoforesis LY se puede utilizar para reconstruir astrocitos individuales y realizar análisis morfológicos detallados de sus procesos y territorio. Además, este método se puede aplicar junto con la inmunohistoquímica para identificar las relaciones espaciales y las interacciones entre astrocitos y neuronas, otras células gliales y vasculatura cerebral. Consideramos QUE LA iontoforesis LY es una herramienta muy adecuada para analizar la morfología en diferentes regiones cerebrales y modelos de ratón de condiciones saludables o de enfermedad^7,12,13.

Protocolo

Los experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller en la Universidad de California, Los Angeles. En todos los experimentos se utilizaron ratones adultos (6 a 8 semanas de edad) de género mixto.

1. Preparación de la solución

1. Solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)
   1. Preparar una solución ACSF fresca (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mM NaHCO₃, 11 mM D-glucosa, 1,25 mM Na₂HPO₄y 2 mM De CaCl₂) antes de cada experimento. Agregue MgCl₂ y CaCl₂ en el paso final. Disolver los componentes en agua desionizada de alta calidad.
   2. Incubar la solución ACSF a 35oC en un baño de agua y burbuja con 95% O₂/ 5% CO₂ durante al menos 30 min antes del experimento.
   3. Añadir 2% de clorhidrato de lidocaína para alcanzar una concentración final de 0,02% en ACSF (en 100 ml).
2. Solución fija
   1. Utilice 10% de fosfato tamponado de formalina.
3. Solución de tinte LY
   1. Prepare 1.5% LY solución de tinte disolviendo la sal de dilitio LY CH o LA sal de dipotásium LY CH en 5 mM KCl. Vortex a fondo. Un volumen de 1 ml es suficiente para varios experimentos.
   2. Centrífuga durante 10 min a 16.800 x g. A continuación, filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo nuevo. Las aliquots se pueden mantener a 4oC durante un máximo de 3 meses.
      NOTA: Es fundamental centrifugar y filtrar la solución de tinte para evitar la agregación de las partículas de tinte, que pueden obstruir el electrodo.

2. Perfusión transcardial del ratón y disección cerebral

1. Preparación de equipos y ratón para perfusión transcardial
   NOTA: Se pueden utilizar ratones C57/BL6 de ambos sexos. Se ha observado empíricamente que para que el método funcione de forma fiable, es importante que los ratones no sean mayores de 3 meses (6-8 semanas de edad es ideal). El protocolo de perfusión se describe a continuación. Se proporciona una referencia adicional para más detalles¹⁴.
   1. Tubo de perfusión transparente con solución ACSF para eliminar cualquier burbuja de aire en la línea. Configurar herramientas de cirugía en orden de uso (pinzas, tijeras curvas, contundentes, tijeras de iris).
   2. Profundamente anestesiar el ratón poniéndolo en una cámara de inducción de isoflurano, después de añadir 2 x 3 ml de isoflurano a la cámara. Permita que el anestésico surta efecto de 1 a 2 minutos. Asegúrese de que la respiración no se detenga.
   3. Prueba de reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo Proceda cuando el ratón no responde al estímulo del dolor y el reflejo está ausente. Asegure al animal en posición supina con la cabeza colocada en el cono respiratorio con un suministro de 5% de isoflurano en oxígeno y las extremidades y la cola pegadas dentro de una campana de humos químicos.
2. Perfusión transcardial
   1. Con pinzas, levante la piel debajo de la caja torácica. Haga una incisión de 5 x 6 cm con las tijeras curvas y contundentes a través de la piel para exponer la cavidad abdominal. Corte hacia arriba a través de la pared abdominal hasta que el hígado y el diafragma sean visibles.
   2. Mueva suavemente el hígado lejos del diagrama. Con tijeras de iris, haga una incisión lateral de 3 x 4 cm en el diafragma.
   3. Cortar a través de la caja torácica a lo largo de ambos lados del cuerpo para exponer la cavidad torácica. Tenga cuidado de no dañar el corazón y evitar los pulmones. Levante el esternón para exponer el corazón.
   4. Una vez que el corazón esté visible, inyectar 0,05 ml de solución de heparina sódica (1.000 USP por ml) en el ventrículo izquierdo como anticoagulante. A continuación, inserte la aguja de perfusión cuidadosamente en el ventrículo izquierdo. Asegúrese de que la aguja permanezca en el ventrículo y no atraviese otras cavidades cardíacas. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha con tijeras de iris.
   5. Perfunde con solución ACSF a una velocidad de aproximadamente 10 ml/min hasta que el líquido existente el cuerpo se despeje de la sangre (1 x 2 min).
   6. Cambie de la solución ACSF a la solución fijativa sin introducir burbujas de aire. Perpeto con solución fijativa durante 10 min a 10 x 20 ml/min.
      PRECAUCION: Tenga cuidado de que ninguna solución fijada esté drenando de la nariz. Esto indica que la aguja alcanzó el ventrículo derecho y el fijador está viajando a los pulmones en lugar de a través del circuito sistémico hasta el resto del cuerpo.
3. Disección del cerebro
   1. Retire la cabeza del ratón con tijeras y diseccione cuidadosamente el cerebro del ratón del cráneo. Colocar en solución fijativa durante 1,5 h a temperatura ambiente durante un corto período de post-fijación.
      NOTA: Una buena perfusión es necesaria para el éxito de la iontoforesis LY. El cerebro debe ser de color blanco y ausente de sangre en la vasculatura cerebral. El cuerpo y las extremidades deben aparecer rígidos.

3. Preparación de rebanadas

1. Preparación de rodajas de hipocampo
   1. Lavar el cerebro con 0,1 M de fosfato satina tamponada (PBS) a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, seque el cerebro con papel de filtro y retire la bombilla olfativa y el cerebelo con una cuchilla de afeitar afilada.
   2. Monte el cerebro en la bandeja de vibratome con pegamento de cianoacrilato y llene la bandeja con PBS a temperatura ambiente. Corte las secciones coronales del hipocampo de 110 m de espesor.
      NOTA: Ajuste el ajuste del vibratome para asegurarse de que las rodajas tengan el mismo grosor e incluso superficie. Para este experimento, se utilizó un ajuste de velocidad de 4,5 y un ajuste de frecuencia de 8, que son ajustes arbitrarios en el instrumento(Tabla de materiales). Es posible que los usuarios necesiten experimentar con la configuración de otros dispositivos.
   3. Recoger las secciones de la bandeja y colocar en un plato de PBS en el hielo.

4. Preparación de electrodos

1. Prepare un electrodo afilado con la resistencia adecuada.
   1. Utilice un electrodo de tubo de vidrio borosilicato con filamento (D.O. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Tire de un electrodo en un tirador de micropipeta(Tabla de materiales). Los electrodos ideales llenos de 1,5% LY en 5 mM KCl deben tener una resistencia de 200 M cuando se colocan en un baño de PBS.
      NOTA: El ajuste del tirador varía según el aparato (tipo de máquina utilizada y filamento del tirador). Un ajuste de calor más alto generalmente da puntas más largas y finas. Para el tirador de micropipetas utilizado en este experimento, los ajustes fueron: calor: 317, tirón: 90, velocidad: 70, y retardo: 70. Se utilizó un filamento tipo vaguada.
   2. Almacene los electrodos en un recipiente cerrado para evitar que el polvo entre en la punta. Mantenga los electrodos elevados desde la parte inferior de la caja para evitar que la punta se rompa.
2. Llene el electrodo con solución de tinte LY.
   1. Coloque un electrodo en posición vertical con la punta hacia abajo. Pipetear 1 x 2 l de solución LY en la parte posterior del electrodo y esperar 5 x 10 minutos para que la solución se mueva a la punta a través de la acción capilar.
   2. Fije suavemente el electrodo lleno en el soporte del electrodo conectado a un manipulador.
      NOTA: El cable de plata del soporte del electrodo debe estar en contacto con el LY dentro del electrodo. Ajuste el volumen de la solución LY si es necesario, dependiendo de la longitud del cable.

5. Llenar Astrocitos con Iontoforesis

1. Pruebe el electrodo.
   1. Coloque una rebanada cerebral suavemente en un plato inferior de vidrio lleno de 0.1 M PBS a temperatura ambiente. Sostenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon.
   2. Asegúrese de que el electrodo está conectado a una fuente de voltaje y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene la rebanada cerebral.
   3. Mueva el objetivo a la región cerebral de interés.
   4. Baje el electrodo en la solución. Debajo del campo brillante, muévalo al centro del campo de visión y examínelo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua 40x para asegurarse de que parezca claro y sin residuos ni burbujas. Si hay algo que obstruya la punta del electrodo, reemplácela por una nueva.
      NOTA: La obstrucción es una preocupación para el electrodo de 200 M. Con la centrifugación y filtración de la solución de tinte antes de cada experimento, esto no debería ser un problema frecuente. Sin embargo, debido a que la punta del electrodo es pequeña, el tejido a veces puede quedar atascado en la abertura. Los autores no han encontrado una manera de prevenir esto, pero se puede tratar fácilmente simplemente usando un nuevo electrodo.
   5. Observe la punta del electrodo bajo el microscopio de exploración láser confocal con el láser de 488 nm. A continuación, pruebe la eyección del tinte encendiendo el estimulador a 12 V. Tenga en cuenta una gran nube de tinte fluorescente alrededor de la punta del electrodo mientras el estimulador está encendido. Si no se expulsa ningún tinte o poco al estimulación de voltaje, reemplace el electrodo.
   6. Debajo del campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia la rebanada deteniéndose justo por encima de la superficie.
2. Llena la astrocitosis con iontoforesis.
   1. Identifique los astrocitos 40 a 50 m por debajo de la superficie de la rebanada con el contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC). Busque células con somatas alargados en forma ovalada de unos 10 m de diámetro. Una vez elegido un astrocito, muévalo al centro del campo de visión.
      NOTA: Una buena célula para la iontoforesis tiene bordes claros y definidos a su alrededor. No elija celdas demasiado cerca de la superficie del sector porque no se pueden rellenar completamente. Se necesita un poco de práctica durante unos días para poder identificar rutinariamente astrocitos para el llenado de tintes. Dependiendo del área cerebral utilizada para el experimento, el número de astrocitos puede variar. Esto puede afectar el tiempo necesario para identificar un astrocito antes de llenarlo.
   2. Baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido, hasta que esté en el mismo plano que el cuerpo celular.
      NOTA: Mueva el electrodo lentamente para evitar dañar el tejido.
   3. Una vez que el cuerpo celular del astrocito es claramente visible y esbozado, avance lentamente y suavemente el electrodo hacia adelante. Mueva el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para observar si el electrodo está dentro del soma.
      NOTA: La punta del electrodo debe estar dentro del cuerpo celular, y se debe observar una pequeña sangría en el soma. No mueva el electrodo más para evitar que la punta pase por la célula.
   4. Una vez que la punta del electrodo esté dentro de la célula, encienda el estimulador a 0,5 x 1 V y expulse continuamente la corriente a la célula. Con el microscopio confocal, observe el llenado de la célula. Aumente el zoom digital para ver los detalles de la celda y asegúrese de que la punta del electrodo sea visible dentro de la celda.
      NOTA: Reduzca el voltaje si parece que el tinte se está filtrando fuera de la célula o llenando otras células en las cercanías. Si parece que el tinte todavía se está filtrando fuera de la célula, extraiga el electrodo lentamente y encuentre otra célula. Es importante que el tinte no se filtre para tener una alta relación señal/fondo en la imagen final.
   5. Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos, apague el voltaje y retire suavemente la punta del electrodo de la célula.
3. Imagen de la celda llena.
   NOTA: Las imágenes se pueden realizar inmediatamente después del llenado o después de la tinción con inmunohistoquímica. Un objetivo con una apertura numérica más alta (NA) da como resultado una mejor resolución.
   1. Espere hasta que la celda vuelva a la forma original antes de la toma de imágenes (15-20 min) con un objetivo de 40x. Para crear una imagen de la celda, ajuste la configuración en la confocala para asegurarse de que las ramas y los procesos más finos aparecen definidos.
   2. Configure una pila z con un tamaño de paso de 0,3 m. Durante la toma de imágenes, mueva el objetivo hasta que no haya señal de la célula y establezca eso como la parte superior. A continuación, mueva el objetivo hacia abajo (centrándose a través de la celda) hasta que no haya señal, establezca eso como la parte inferior.
   3. Una vez completada la toma de imágenes, compruebe si el electrodo está en busca de eyección del tinte. Si aparece una nube de tinte grande, se puede utilizar para la siguiente rebanada. De lo contrario, sustitúyalo por un electrodo nuevo.
      NOTA: El llenado de un solo astrocito y la toma de imágenes tarda unos 45 minutos a 1 h. Para este experimento específico, fue posible obtener alrededor de 3 x 6 celdas por ratón. Si es necesario, se pueden etiquetar varias celdas en el mismo sector. Sin embargo, para distinguir los astrocitos individuales, asegúrese de mantener una distancia de aproximadamente 200 m entre las células.

6. Tinción con Inmunohistoquímica (Opcional)

1. Una vez realizada la toma de imágenes, coloque inmediatamente la rebanada en un 10% de formalina sobre hielo para conservarla para inmunohistoquímica. Mantenga las rebanadas cerebrales en la oscuridad y guárdelas durante la noche a 4 oC.
2. Lave las secciones cerebrales 3x en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico (es decir, Tritón X 100) durante 5 min cada uno. A continuación, incubar en una solución de bloqueo de 0,1 M PBS con un tensioactivo no iónico al 0,5% y un 10% de suero normal de cabra (NGS) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
3. Incubar las secciones con agitación en anticuerpos primarios diluidos en 0,1 M PBS con un tensioactivo no iónico al 0,5% y un 5% de NGS durante 2 días a 4oC.
   NOTA: Debido al grosor de las rodajas cerebrales, el período de incubación de los anticuerpos primarios debe extenderse para una mejor penetración y la concentración de anticuerpos puede aumentar. En este experimento, se utilizó una dilución 1:500 para anticuerpos anti GFAP y se utilizó una dilución 1:500 para anticuerpos antiaquaporina-4.
4. Lavar las secciones 3x en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico durante 10 min cada una y luego incubar con anticuerpos secundarios diluidos en 0.1 M PBS con 0.5% tensioactivo no iónico y 10% NGS para 6 h a temperatura ambiente.
   NOTA: No elija un anticuerpo secundario excitado por 488 nm, que es la longitud de onda utilizada para visualizar el tinte LY. En este experimento, se utilizó una dilución de 1:1,000 para Alexa Fluor 546 cabra anti-pollo IgG (H+L) y Alexa Fluor 647 cabra anticonejo IgG (H+L).
5. Enjuague las secciones 3x en 0.1 M PBS durante 10 min cada una. A continuación, monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio en soportes de montaje adecuados para la fluorescencia. Selle las diapositivas. Celdas de imagen con un tamaño de paso de 0,3 m.

Resultados

Los datos reportados en este estudio provienen de 7 a 12 células de 4 ratones en cada experimento. Los datos medios se indican en los paneles de figuras cuando proceda.

Para evaluar la morfología de los astrocitos, realizamos iontoforesis intracelular utilizando el tinte LY para rellenar los astrocitos en el estrato radiatón CA1, que se resume en la Figura 1. La Figura 2 representa un astrocito representativo y su elaborada estructura morfológ...

Discusión

El método descrito en este artículo describe una manera de visualizar la morfología de los astrocitos utilizando la iontoforesis intracelular del tinte LY en rebanadas cerebrales ligeramente fijas. Hay varios factores críticos destacados en este protocolo que contribuyen al éxito de la iontoforesis LY y la reconstrucción morfológica de las células. Un factor es la calidad y reproducibilidad de las imágenes, que se determina en gran medida por la edad del ratón y el resultado de la perfusión. En este estudio, u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher	SF 100-20	An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall	4692	An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody	Novus Biologicals	NBP1-87679	A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody	Abcam	ab4674	A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac mice	Taconic Stock	B6	A similar alternative can be used
Calcium Chloride	Sigma	21108	An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	A similar alternative can be used
D-glucose	Sigma	G7528	An identical alternative can be used
Disodium Phosphate	Sigma	255793	An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97	Sutter	P-97	A similar alternative can be used
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		A similar alternative can be used
Isofluorane	Henry Schein Animal Health	29404	An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)	Clipper	1050035	An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt	Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass	Thermo Scientific	24X60-1	An identical alternative can be used
Microscope Slides	Fisher	12-544-2	An identical alternative can be used
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	An identical alternative can be used
Objective lens (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	A similar alternative can be used
Objective lens (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL	VWR	VWRVE404	An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	A similar alternative can be used
Potassium Chloride	Sigma	P3911	An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	An identical alternative can be used
Sodium Chloride	Sigma	S5886	An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010	World precision instruments	Omnical 2010	A similar alternative can be used
Triton X 100	Sigma	T8787	An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	A similar alternative can be used