Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis

Riepilogo

Gli astrociti sono cellule morfologicamente complesse, esemplificate dai loro molteplici processi e territori cespugliosi. Per analizzare la loro morfologia elaborata, presentiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoforesi gialla di Lucifero intracellulare in tessuto leggermente fissato.

Abstract

Gli astrociti sono componenti essenziali dei circuiti neurali. Tile tutto il sistema nervoso centrale (CNS) e sono coinvolti in una varietà di funzioni, che includono l'autorizzazione del neurotrasmettitore, regolazione iosse, modulazione sinaptica, supporto metabolico ai neuroni, e regolazione del flusso sanguigno. Gli astrociti sono cellule complesse che hanno un soma, diversi rami principali e numerosi processi fini che contattano diversi elementi cellulari all'interno del neuropil. Per valutare la morfologia degli astrociti, è necessario disporre di un metodo affidabile e riproducibile per visualizzare la loro struttura. Riportiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoresi intracellulare di astrociti utilizzando colorante giallo Lucifero fluorescente (LY) nel tessuto cerebrale leggermente fissato da topi adulti. Questo metodo ha diverse caratteristiche che sono utili per caratterizzare la morfologia degli astrociti. Permette la ricostruzione tridimensionale dei singoli astrociti, utile per eseguire analisi morfologiche su diversi aspetti della loro struttura. L'immunohistochimica insieme alla iontoforesi LY può anche essere utilizzata per comprendere l'interazione degli astrociti con diversi componenti del sistema nervoso e per valutare l'espressione delle proteine all'interno degli astrociti etichettati. Questo protocollo può essere implementato in una varietà di modelli murini di disturbi del SNC per esaminare rigorosamente la morfologia degli astrociti con microscopia leggera. LY iontohoresis fornisce un approccio sperimentale per valutare la struttura degli astrociti, soprattutto nel contesto di lesioni o malattie in cui queste cellule sono proposte per subire cambiamenti morfologici significativi.

Introduzione

Gli astrociti sono le cellule gliali più abbondanti nel sistema nervoso centrale (SNC). Essi svolgono ruoli in omeostasi iogeno, regolazione del flusso sanguigno, formazione di sinapsi così come l'eliminazione, e l'assorbimento del neurotrasmettitore¹. L'ampia gamma di funzioni astrocite si riflette nella loro complessa struttura morfologica^2,3. Gli astrociti contengono diversi rami primari e secondari che si dividono in migliaia di ramifici e volantini più sottili che interagiscono direttamente con sinapsi, dendriti, assoni, vasi sanguigni e altre cellule gliali. La morfologia degli astrociti varia tra diverse regioni del cervello, che possono suggerire la loro capacità di svolgere le loro funzioni in modo differenziale nei circuiti neuronali⁴. Inoltre, gli astrociti sono noti per alterare la loro morfologia durante lo sviluppo, durante le condizioni fisiologiche, e in più stati di malattia^3,5,6.

È necessario un metodo coerente e riproducibile per risolvere con precisione la complessità della morfologia degli astrociti. Tradizionalmente, l'immunohistochimica è stata utilizzata per visualizzare gli astrociti con l'uso di marcatori proteici specifici o arricchiti di astrociti. Tuttavia, questi metodi rivelano il modello di espressione proteica piuttosto che la struttura dell'astrocito. I marcatori comunemente usati, come la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la proteina legante del calcio S100 , non esprimono nell'intero volume cellulare e quindi non risolvono la morfologia completa⁷. Gli approcci genetici per esprimere onnipresenti proteine fluorescenti negli astrociti (iniezioni virali o linee di segnalazione di topi transgenici) possono identificare i rami più fini e il territorio generale. Tuttavia, è difficile distinguere gli astrociti individuali e le analisi possono essere di parte dalla popolazione di astrociti presa di mira dal promotore specifico⁸. La microscopia elettronica della sezione seriale è stata utilizzata per rivelare un quadro dettagliato delle interazioni dei processi astrociti con le sinapsi. A causa delle migliaia di processi astrociti che contattano le sinapsi, attualmente non è possibile ricostruire un'intera cella con questa tecnica⁹, anche se questo dovrebbe cambiare con l'uso di approcci di apprendimento automatico per l'analisi dei dati.

In questo rapporto, ci concentriamo su una procedura per caratterizzare gli astrociti del topo utilizzando la iontoresi intracellulare con colorante giallo Lucifero (LY), usando il radiato strato CA1 come esempio. Il metodo si basa sul lavoro passato pionieristico di Eric Bushong e Mark Ellisman^10,11. Gli astrociti da fette di cervello leggermente fissate sono identificati dalla loro caratteristica forma di soma e riempiti con LY. Le cellule vengono poi immagini con microscopia confocale. Dimostriamo come la iontoresi LY possa essere usata per ricostruire singoli astrociti ed eseguire analisi morfologiche dettagliate dei loro processi e territori. Inoltre, questo metodo può essere applicato in combinazione con l'immunostochimica per identificare le relazioni spaziali e le interazioni tra astrociti e neuroni, altre cellule gliali e vascolatura cerebrale. Consideriamo LY iontoresis uno strumento molto adatto per analizzare la morfologia in diverse regioni del cervello e modelli murini di condizioni sane o malattie^7,12,13.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dal Chancellor's Animal Research Committee presso l'Università della California, Los Angeles. In tutti gli esperimenti sono stati usati topi adulti (6-8 settimane) di genere misto.

1. Preparazione della soluzione

1. Soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)
   1. Preparare una nuova soluzione ACSF (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mM NaHCO₃, 11 mM D-glucose, 1,25 mM Na₂HPO₄e 2 mM CaCl₂) prima di ogni esperimento. Aggiungere MgCl₂ e CaCl₂ nel passaggio finale. Sciogliere i componenti in acqua deionizzata di alta qualità.
   2. Incubare la soluzione ACSF a 35 gradi centigradi in un bagno d'acqua e bolla con 95% O₂/ 5% CO₂ per almeno 30 min prima dell'esperimento.
   3. Aggiungere il 2% di cloruro di lidocaina per raggiungere una concentrazione finale dello 0,02% in ACSF (in 100 mL).
2. Soluzione fixative
   1. Utilizzare il 10% di formalina tamponata per fosfato.
3. LY soluzione di tinri
   1. Preparare la soluzione di tintura LY all'1,5% sciogliendo accuratamente il sale di lithioum LY CH o il sale dipotassio LY CH in 5 mM di KCl. Un volume di 1 mL è sufficiente per diversi esperimenti.
   2. Centrifuga per 10 min a 16.800 x g. Quindi, filtrare il supernatante con un filtro di siringa di 0,2 m in un nuovo tubo. Gli aliquote possono essere mantenuti a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
      NOT: È fondamentale centrifugare e filtrare la soluzione di tintura per impedire l'aggregazione delle particelle di tintura, che possono intasare l'elettrodo.

2. Perfusione transcardiale del topo e dissezione cerebrale

1. Preparazione di attrezzature e mouse per la perfusione transcardiale
   NOTA: possono essere utilizzati topi C57/BL6 di entrambi i sessi. È stato osservato empiricamente che per il metodo per funzionare in modo affidabile, è importante che i topi non sono più vecchi di 3 mesi (6-8 settimane è l'ideale). Il protocollo di perfusione è descritto di seguito. Un riferimento aggiuntivo è fornito per maggiori dettagli¹⁴.
   1. Pulire i tubi perfusione con soluzione ACSF per rimuovere eventuali bolle d'aria nella linea. Impostare strumenti di chirurgia in ordine di utilizzo (pinzette, forbici curve e smussate, forbici iride).
   2. Anazita profondamente il topo mettendolo in una camera di induzione dell'isoflurano, dopo aver aggiunto alla camera 2-3 mL di isoflurane. Lasciare agire con un'anestesia di 1/2 min. Assicurarsi che la respirazione non si fermi.
   3. Test per il riflesso del pizzico delle dita dei pizzicai. Procedere quando il mouse non risponde allo stimolo del dolore e il riflesso è assente. Fissare l'animale in posizione supina con la testa posta nel cono respiratorio con una fornitura di 5% di isoflurane in ossigeno e gli arti e la coda attaccati all'interno di un cappuccio di fumi chimici.
2. Perfusione transcardiale
   1. Utilizzando una pinzetta, sollevare la pelle sotto gabbia toracica. Fai un'incisione di 5-6 cm con le forbici curve e smussate attraverso la pelle per esporre la cavità addominale. Tagliare verso l'alto attraverso la parete addominale fino a quando il fegato e il diaframma sono visibili.
   2. Allontanare delicatamente il fegato dal diagramma. Con le forbici da bagno, fai un'incisione laterale di 3,4 cm nel diaframma.
   3. Tagliare la gabbia toracica lungo entrambi i lati del corpo per esporre la cavità toracica. Fare attenzione a non danneggiare il cuore ed evitare i polmoni. Sollevare lo sterno per esporre il cuore.
   4. Una volta che il cuore è visibile, iniettare 0,05 mL di soluzione di sodio di eparina (1.000 USP per mL) nel ventricolo sinistro come anticoagulante. Quindi, inserire l'ago perfusione con attenzione nel ventricolo sinistro. Assicurarsi che l'ago rimanga nel ventricolo e non perforare attraverso altre camere cardiache. Fare una piccola incisione nell'atrio destro con le forbici dell'iride.
   5. Perfuso con soluzione ACSF ad una velocità di circa 10 mL/min fino a quando il fluido esistente il corpo viene eliminato dal sangue (1/2 min).
   6. Passa dalla soluzione ACSF alla soluzione fixative senza introdurre bolle d'aria. Perfuse con soluzione fissativa per 10 min a 10,20 mL/min.
      ATTENZIONE: Fare attenzione che nessuna soluzione fissativa sta drenando dal naso. Ciò indica che l'ago ha raggiunto il ventricolo destro e il fissativo sta viaggiando verso i polmoni piuttosto che attraverso il circuito sistemico al resto del corpo.
3. Dissezione del cervello
   1. Rimuovere la testa del mouse con le forbici e sezionare con attenzione il cervello del topo dal cranio. Mettere in soluzione fissativa per 1,5 h a temperatura ambiente per un breve periodo di post-fissazione.
      NOT: Una buona perfusione è necessaria per il successo della iontoforesi LY. Il cervello dovrebbe essere di colore bianco e assente di sangue nella vascolatura cerebrale. Il corpo e gli arti dovrebbero apparire rigidi.

3. Preparazione delle fette

1. Preparazione di fette di ippocampali
   1. Lavare il cervello con una salina tampone di fosfato da 0,1 M (PBS) a temperatura ambiente per 5 min. Quindi, asciugare il cervello con carta da filtro e rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto con una lama affilata.
   2. Montare il cervello sul vassoio vibratome utilizzando colla cianoacrile e riempire il vassoio con PBS a temperatura ambiente. Tagliare le sezioni coronali dell'ippocampo di 110 m di spessore.
      NOT: Regolare l'impostazione del vibratoma per assicurarsi che le sezioni abbiano lo stesso spessore e la stessa superficie uniforme. Per questo esperimento, sono state utilizzate un'impostazione di velocità di 4.5 e un'impostazione di frequenza di 8, che sono impostazioni arbitrarie sullo strumento (Tabella dei materiali). Gli utenti potrebbero dover sperimentare le impostazioni su altri dispositivi.
   3. Raccogliere le sezioni dal vassoio e metterle in un piatto di PBS sul ghiaccio.

4. Preparazione dell'elettrodo

1. Preparare un elettrodo affilato con la resistenza appropriata.
   1. Utilizzare un elettrodo a canna singola di vetro borosilicate con filamento (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Tirare un elettrodo su un tiratore di micropipette (Tabella dei materiali). Gli elettrodi ideali riempiti con 1,5% LY in 5 mM KCl dovrebbero avere una resistenza di 200 M, quando vengono messi in un bagno di PBS.
      NOT: L'impostazione dell'azionamento varia a seconda dell'apparato (tipo di macchina utilizzata e filamento per l'estraimento). Un'impostazione di calore più alta di solito dà punte più lunghe e più fini. Per l'eseguitore micropipette utilizzato in questo esperimento, le impostazioni erano: calore: 317, trazione: 90, velocità: 70 e ritardo: 70. È stato utilizzato un filamento di tipo trogolo.
   2. Conservare gli elettrodi in un contenitore chiuso per evitare che la polvere entri nella punta. Mantenere gli elettrodi elevati dal fondo della scatola per evitare che la punta si rompa.
2. Riempire l'elettrodo con la soluzione di tinri LY.
   1. Posizionare un elettrodo in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso. La pipetta si trasforma nella parte posteriore dell'elettrodo e attendere 5-10 minuti perché la soluzione si sposti verso la punta tramite un'azione capillare.
   2. Fissare delicatamente l'elettrodo riempito nel supporto dell'elettrodo collegato a un manipolatore.
      NOT: Il filo d'argento del supporto dell'elettrodo deve essere a contatto con la LY all'interno dell'elettrodo. Regolare il volume della soluzione LY, se necessario, a seconda della lunghezza del filo.

5. Riempimento astrociti con iontoforesi

1. Testare l'elettrodo.
   1. Mettere una fetta di cervello delicatamente in un piatto di fondo di vetro riempito con 0,1 M PBS a temperatura ambiente. Tenere la fetta in posizione con un'arpa di platino con corde di nylon.
   2. Assicurarsi che l'elettrodo sia collegato a una fonte di tensione e posizionare l'elettrodo di terra nella vasca contenente la fetta del cervello.
   3. Spostare l'obiettivo nella regione del cervello di interesse.
   4. Abbassare l'elettrodo nella soluzione. Sotto il campo luminoso, spostarlo al centro del campo visivo ed esaminarlo attentamente con la lente di immersione dell'acqua 40x per assicurarsi che sembri chiara e senza detriti o bolle. Se c'è qualcosa che intasa la punta dell'elettrodo, sostituirla con una nuova.
      NOT: Il clogging è una preoccupazione per l'elettrodo da 200 M. Con la centrifugazione e la filtrazione della soluzione di tinri prima di ogni esperimento, questo non dovrebbe essere un problema frequente. Tuttavia, poiché la punta dell'elettrodo è piccola, il tessuto a volte può rimanere bloccato nell'apertura. Gli autori non hanno trovato un modo per prevenire questo, ma può essere facilmente affrontato semplicemente utilizzando un nuovo elettrodo.
   5. Osservare la punta dell'elettrodo al microscopio confocale a scansione laser con il laser da 488 nm. Quindi, prova l'espulsione del die accendendo lo stimolatore a 12 V. Notare una grande nuvola di tintura fluorescente intorno alla punta dell'elettrodo mentre lo stimolatore è acceso. Se il tintura non viene espulso dopo la stimolazione della tensione, sostituire l'elettrodo.
   6. Sotto il campo luminoso, abbassare lentamente l'elettrodo verso la fetta fermandosi appena sopra la superficie.
2. Riempire l'astrocito con iontoforesi.
   1. Identificare gli astrociti 40-50 m sotto la superficie della fetta con il contrasto di interferenza differenziale infrarosso (IR-DIC). Cercare le cellule con somata allungata a forma ovale di circa 10 m di diametro. Una volta scelto un astrocito, spostarlo al centro del campo visivo.
      NOT: Una buona cellula per la iontoforesi ha bordi chiari e definiti intorno ad esso. Non scegliere le celle troppo vicine alla superficie della sezione perché non possono essere completamente riempite. Ci vuole un po 'di pratica nel corso di un paio di giorni per essere in grado di identificare regolarmente gli astrociti per il riempimento di tinture. A seconda dell'area del cervello utilizzata per l'esperimento, il numero di astrociti può variare. Questo può influenzare il tempo necessario per identificare un astrocito prima del riempimento.
   2. Abbassare lentamente la punta dell'elettrodo nella fetta, navigando attraverso il tessuto, fino a quando non è sullo stesso piano del corpo cellulare.
      NOT: Spostare l'elettrodo lentamente per evitare di danneggiare il tessuto.
   3. Una volta che il corpo cellulare dell'astrocite è chiaramente visibile e delineato, lentamente e delicatamente far avanzare l'elettrodo in avanti. Spostare l'elettrodo fino a quando la punta impala il soma della cellula. Spostare lentamente la messa a fuoco dell'obiettivo su e giù per notare se l'elettrodo è all'interno del soma.
      NOT: La punta dell'elettrodo deve essere all'interno del corpo cellulare e deve essere osservata una piccola rientranza sul soma. Non spostare ulteriormente l'elettrodo per evitare che la punta attraversi la cellula.
   4. Una volta che la punta dell'elettrodo è all'interno della cellula, accendere lo stimolatore a 0,5-1 V ed espellere continuamente la corrente nella cellula. Usando il microscopio confocale, osserva il riempimento della cellula. Aumentare lo zoom digitale per vedere i dettagli della cella e assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia visibile all'interno della cella.
      NOT: Abbassare la tensione se sembra che il colore fuoriesca dalla cella o riempialtre celle nelle vicinanze. Se sembra che il colorante stia ancora fuoriuscita dalla cellula, estrarre l'elettrodo lentamente e trovare un'altra cellula. È importante che il colore non perda per avere un alto rapporto segnale/ sfondo nell'immagine finale.
   5. Attendere circa 15 minuti fino a quando i rami e i processi più fini appaiono definiti, spegnere la tensione e ritirare delicatamente la punta dell'elettrodo dalla cella.
3. Immagine della cella riempita.
   NOTA: L'imaging può essere eseguito immediatamente dopo il riempimento o la colorazione con immunohistochimica. Un obiettivo con un'apertura numerica più alta (NA) si traduce in una migliore risoluzione.
   1. Attendere fino a quando la cella ritorna alla forma originale prima di imaging (15-20 min) con obiettivo 40x. Per creare un'immagine della cella, regolare l'impostazione sul confocale per assicurarsi che i rami e i processi più fini appaiano definiti.
   2. Impostare uno z-stack con una dimensione di passo di 0,3 m. Durante l'imaging, spostare l'obiettivo fino a quando non c'è alcun segnale dalla cella e impostarlo come la parte superiore. Quindi, spostare l'obiettivo verso il basso (concentrandosi attraverso la cella) fino a quando non c'è segnale, impostare che come il fondo.
   3. Una volta completata l'imaging, controllare l'elettrodo per l'espulsione del tinri. Se viene visualizzata una nuvola di tinri di grandi dimensioni, può essere utilizzata per la sezione successiva. In caso contrario, sostituirlo con un nuovo elettrodo.
      NOT: Il riempimento della tinga di un singolo astrocite e l'imaging richiede circa 45 min a 1 h. Per questo esperimento specifico, è stato possibile ottenere circa 3/6 celle per mouse. Se necessario, più celle possono essere etichettate sulla stessa sezione. Tuttavia, per distinguere i singoli astrociti, assicurarsi di mantenere una distanza di circa 200 m tra le cellule.

6. Colorazione con Immunoistochimica (Facoltativo)

1. Una volta terminata l'imaging, posizionare immediatamente la fetta in formalina del 10% sul ghiaccio da conservare per l'immunohistochimica. Conservare le fette di cervello al buio e conservarle durante la notte a 4 gradi centigradi.
2. Lavare le sezioni cerebrali 3x in 0,1 M PBS con 0,5% di surfactant nonionico (cioè Triton X 100) per 5 min ciascuno. Quindi incubare in una soluzione di blocco di 0,1 M PBS con 0.5% surfactant nonionico e 10% siero di capra normale (NGS) per 1 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
3. Incubare le sezioni con agitazione negli anticorpi primari diluiti in 0,1 M PBS con 0,5% di surfactant nonionico e 5% NGS per 2 giorni a 4 gradi centigradi.
   NOT: A causa dello spessore delle fette cerebrali, il periodo di incubazione degli anticorpi primari deve essere esteso per una migliore penetrazione e la concentrazione di anticorpi può essere aumentata. In questo esperimento, è stata utilizzata una diluizione 1:500 per gli anticorpi anti-GFAP e una diluizione 1:500 è stata utilizzata per anticorpi antiacquaporina-4.
4. Lavare le sezioni 3x in 0,1 M PBS con 0,5% di surfactant nonionico per 10 min ciascuna e poi incubare con anticorpi secondari diluiti in 0,1 M PBS con surfactant nonionico dello 0,5% e 10% NGS per 6 h a temperatura ambiente.
   NOT: Non scegliere un anticorpo secondario eccitato da 488 nm, che è la lunghezza d'onda utilizzata per visualizzare il tincolo LY. In questo esperimento, una diluizione 1:1,000 è stata usata per Alexa Fluor 546 capra anti-pollo IgG (H-L) e Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (H-L).
5. Risciacquare le sezioni 3x in 0,1 M PBS per 10 min ciascuna. Quindi montare le sezioni su vetrini al microscopio in vetro in supporti di montaggio adatti per la fluorescenza. Sigillare le diapositive. Celle dell'immagine con una dimensione di 0,3 m.

Risultati

I dati riportati in questo studio provengono da cellule 7/12 da 4 topi in ogni esperimento. I dati medi sono riportati nei pannelli figura, se del caso.

Per valutare la morfologia degli astrociti, abbiamo eseguito la iontoresi intracellulare usando il tinrito LY per riempire gli astrociti nel radiato dello strato CA1, che è riassunto nella Figura 1. Figura 2 raffigura un astrocito rappresentativo e la sua struttura morfologica elaborata. La cella...

Discussione

Il metodo descritto in questo documento descrive un modo per visualizzare la morfologia degli astrociti utilizzando l'iontoresi intracellulare di LY dye in fette cerebrali leggermente fissate. Ci sono diversi fattori critici evidenziati in questo protocollo che contribuiscono al successo della iontoforesi LY e alla ricostruzione morfologica delle cellule. Un fattore è la qualità e la riproducibilità delle immagini, che è determinata in gran parte dall'età del topo e dal risultato della perfusione. In questo studio, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher	SF 100-20	An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall	4692	An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody	Novus Biologicals	NBP1-87679	A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody	Abcam	ab4674	A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac mice	Taconic Stock	B6	A similar alternative can be used
Calcium Chloride	Sigma	21108	An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	A similar alternative can be used
D-glucose	Sigma	G7528	An identical alternative can be used
Disodium Phosphate	Sigma	255793	An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97	Sutter	P-97	A similar alternative can be used
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		A similar alternative can be used
Isofluorane	Henry Schein Animal Health	29404	An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)	Clipper	1050035	An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt	Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass	Thermo Scientific	24X60-1	An identical alternative can be used
Microscope Slides	Fisher	12-544-2	An identical alternative can be used
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	An identical alternative can be used
Objective lens (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	A similar alternative can be used
Objective lens (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL	VWR	VWRVE404	An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	A similar alternative can be used
Potassium Chloride	Sigma	P3911	An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	An identical alternative can be used
Sodium Chloride	Sigma	S5886	An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010	World precision instruments	Omnical 2010	A similar alternative can be used
Triton X 100	Sigma	T8787	An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	A similar alternative can be used