JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Астроциты являются морфологически сложными клетками, о чем свидетельствует их многочисленные процессы и густые территории. Для анализа их сложной морфологии мы представляем надежный протокол для выполнения внутриклеточного люцифера желтого ионтофореза в слегка фиксированной ткани.

Аннотация

Астроциты являются важнейшими компонентами нейронных цепей. Они плитки всей центральной нервной системы (ЦНС) и участвуют в различных функций, которые включают нейромедиатор зазор, ионная регуляция, синаптической модуляции, метаболической поддержки нейронов, и регулирование кровотока. Астроциты являются сложными клетками, которые имеют сома, несколько крупных ветвей, и многочисленные тонкие процессы, которые контактируют с различными клеточными элементами в нейропиле. Для того, чтобы оценить морфологию астроцитов, необходимо иметь надежный и воспроизводимый метод визуализации их структуры. Мы сообщаем о надежном протоколе для выполнения внутриклеточного ионтофореза астроцитов с использованием флуоресцентного желтого (LY) красителя Люцифера в слегка фиксированной ткани мозга от взрослых мышей. Этот метод имеет несколько особенностей, которые полезны для характеристики морфологии астроцитов. Это позволяет трехмерную реконструкцию отдельных астроцитов, что полезно для проведения морфологического анализа по различным аспектам их структуры. Иммуногистохимия вместе с ионтофорусом LY также может быть использована для понимания взаимодействия астроцитов с различными компонентами нервной системы и для оценки экспрессии белков в обозначенных астроцитах. Этот протокол может быть реализован в различных моделях мыши расстройств ЦНС для тщательного изучения морфологии астроцитов с помощью световой микроскопии. Ионтофорез LY обеспечивает экспериментальный подход к оценке структуры астроцитов, особенно в контексте травмы или болезни, где эти клетки предлагается претерпеть значительные морфологические изменения.

Введение

Астроциты являются наиболее распространенными глиальными клетками в центральной нервной системе (ЦНС). Они играют роль в ионного гомеостаза, регуляции кровотока, формирования синапсов, а также ликвидации, и поглощение нейромедиатора1. Широкий спектр функций астроцитов отражается в их сложной морфологической структуре2,3. Астроциты содержат несколько первичных и вторичных ветвей, которые делятся на тысячи тонких ветвей и листовок, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами, дендритами, аксонами, кровеносными сосудами и другими глиальными клетками. Морфология астроцитов варьируется в разных областях мозга, что может намекать на их способность выполнять свои функции дифференцированным в нейронных цепях4. Кроме того, астроциты, как известно, изменить свою морфологию во время развития, во время физиологических условий, и в нескольких состояниях болезни3,5,6.

Для точного решения сложности морфологии астроцитов необходим последовательный, воспроизводимый метод. Традиционно, иммуногистохимия была использована для визуализации астроцитов с использованием астроцитов конкретных или астроцитов обогащенных маркеров белка. Тем не менее, эти методы показывают структуру экспрессии белка, а не структуру астроцитов. Широко используемые маркеры, такие как глиальный фибриллюкислый кислотный белок (GFAP) и S100 кальций связывающий белок (S100), не выражаются во всем объеме клеток и, таким образом, не разрешают полную морфологию7. Генетические подходы к экспрессу флуоресцентных белков повсеместно в астроцитах (вирусные инъекции или трансгенные линии репортера мыши) могут определить более тонкие ветви и общую территорию. Тем не менее, трудно дифференцировать отдельные астроциты, и анализы могут быть предвзятыми по популяции астроцитов, мишенью для конкретногопромоутера 8. Для выявления детальной картины взаимодействия астроцитных процессов с синапсами используется серийная электронная микроскопия. Из-за тысяч астроцитов процессов контакта синапсов, в настоящее время не представляется возможным реконструировать всю ячейку с этой техникой9, хотя это, как ожидается, изменится с использованием машинного обучения подходов для анализа данных.

В этом отчете мы сосредоточиваемся на процедуре характеристики астроцитов мыши с использованием внутриклеточного ионтофорасиса с желтым (LY) красителем Люцифера, используя радиат слоя CA1 в качестве примера. Метод основан на новаторской прошлой работе Эрикbus и Марк Эллисман10,11. Астроциты из слегка фиксированных ломтиков мозга идентифицируются по их отличительной форме сомы и заполнены LY. Клетки затем изображены с конфокальной микроскопией. Мы демонстрируем, как ионтофорес LY может быть использован для реконструкции отдельных астроцитов и проведения детального морфологического анализа их процессов и территории. Кроме того, этот метод может быть применен в сочетании с иммуногистохимии для выявления пространственных связей и взаимодействий между астроцитами и нейронами, другими глиальными клетками и сосудами мозга. Мы считаем, LY ионтофорез, чтобы быть очень подходящим инструментом для анализа морфологии в различных областях мозга и мыши модели здоровых или заболеваний условия7,12,13.

протокол

Эксперименты на животных в этом исследовании были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по исследованиям животных канцлера в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес. Взрослые мыши (от 6 до 8 недель) смешанного пола использовались во всех экспериментах.

1. Подготовка решения

  1. Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) решение
    1. Приготовьте свежий раствор ACSF (135 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 14,7 мМ NaHCO3, 11 мМ D-глюкоза, 1,25 мМ Na2HPO4, и 2 мМ CaCl2) перед каждым экспериментом. Добавьте MgCl2 и CaCl2 на заключительном этапе. Растворите компоненты в высококачественной деионизированной воде.
    2. Инкубировать раствор ACSF при 35 градусах Цельсия в водяной бане и пузырь с 95% O2/ 5% CO2, по крайней мере 30 минут до эксперимента.
    3. Добавьте 2% гидрохлорид лидокаина, чтобы достичь конечной концентрации 0,02% в ACSF (в 100 мл).
  2. Исправление решения
    1. Используйте 10% формалина буферизированного фосфата.
  3. LY раствор красителя
    1. Приготовьте 1,5% LY растворить растворительную соль дилития LY CH или соль диполотия LY CH в 5 мМ KCl. Vortex тщательно. Объем 1 мл достаточен для нескольких экспериментов.
    2. Центрифуга в течение 10 мин при 16800 х г. Затем отфильтруйте супернатант фильтром шприца 0,2 мкм в новую трубку. Aliquots может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение 3 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно центрифуги и фильтровать раствор красителя для предотвращения агрегации частиц красителя, которые могут засорить электрод.

2. Мышь Транскардиальной перфузии и рассечения мозга

  1. Подготовка оборудования и мыши для перфузии транскардиала
    ПРИМЕЧАНИЕ:     C57/BL6 мышей любого пола могут быть использованы. Было эмпирически отмечено, что для метода, чтобы работать надежно, важно, чтобы мыши не старше 3 месяцев (6-8 недель является идеальным). Протокол перфузии описан ниже. Дополнительная ссылка предоставляется для более подробной информации14.
    1. Очистить перфузионные трубки с раствором ACSF, чтобы удалить любые пузырьки воздуха в линии. Настройка хирургических инструментов в порядке использования (пинцет, изогнутые, тупые ножницы, ножницы радужной оболочки глаза).
    2. Глубоко обезопаживайте мышь, поместив ее в изофлуранскую индукционную камеру, после добавления в камеру 2,3 мл изофлюрани. Разрешить 1'2 мин для анестезии, чтобы ввести в действие. Убедитесь, что дыхание не прекращается.
    3. Тест для ногой щепотку рефлекс. Продолжить, когда мышь не реагирует на боль стимул и рефлекс отсутствует. Безопасные животных в положении на спине с головой помещены в дыхательный конус с поставкой 5% изофруран в кислороде и конечностей и хвоста лентой вниз внутри химического дыма капот.
  2. Транскардиейная перфузия
    1. Используя пинцет, поднимите кожу под грудную клетку. Сделайте разрез на 5–6 см с помощью изогнутых, тупых ножниц через кожу, чтобы разоблачить брюшную полость. Вырезать вверх через брюшную стенку, пока печень и диафрагма видны.
    2. Аккуратно отодвинете печень от диаграммы. С ножницами радужной оболочки, сделать 3'4 см боковой разрез в диафрагме.
    3. Вырезать через грудную клетку вдоль обеих сторон тела, чтобы разоблачить грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не повредить сердце и избежать легких. Поднимите грудину, чтобы разоблачить сердце.
    4. Как только сердце видно, вводят 0,05 мл раствора натрия гепарина (1000 USP на мл) в левый желудочек в качестве антикоагулянта. Затем вставьте перфузионную иглу тщательно в левый желудочек. Убедитесь, что игла остается в желудочке и не прокалывается в другие камеры сердца. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии ножницами радужной оболочки.
    5. Пронизываете раствор ACSF со скоростью около 10 мл/мин до тех пор, пока существующая жидкость не очищается от крови (1–2 мин).
    6. Переход от решения ACSF к фиксаторному решению без введения пузырьков воздуха. Perfuse с фиксаторным решением в течение 10 мин на 10'20 мл/ мин.
      ПРЕДЕКТО: Позаботьтесь о том, чтобы ни одно фиксаторное решение не вытекает из носа. Это указывает на то, что игла достигла правого желудочка и фиксатор едет в легкие, а не через системную цепь к остальной части тела.
  3. Рассечение мозга
    1. Снимите голову мыши ножницами и тщательно вскрывайте мозг мыши из черепа. Поместите в фиксаторный раствор на 1,5 ч при комнатной температуре в течение короткого периода после фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая перфузия необходима для успешного ионтофореза. Мозг должен быть белого цвета и отсутствие крови в сосуды мозга. Тело и конечности должны казаться жесткими.

3. Подготовка фрагмента

  1. Приготовление гиппокампа ломтиками
    1. Вымойте мозг с 0,1 М фосфат буферного солима (PBS) при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем высушите мозг фильтровальной бумагой и удалите обонятельную луковицу и мозжечок острым лезвием бритвы.
    2. Установите мозг на подносе вибратома с помощью клея цианоакрилат а также заполните лоток PBS при комнатной температуре. Вырезать гиппокампа корональных секций толщиной 110 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте настройки вибратом, чтобы убедиться, что ломтики имеют такую же толщину и даже поверхность. Для этого эксперимента были использованы настройка скорости 4,5 и частота 8, которые являются произвольными настройками на инструменте(Таблица материалов). Пользователям может потребоваться поэкспериментировать с настройками на других устройствах.
    3. Соберите секции из лотка и поместите в блюдо PBS на льду.

4. Подготовка электрода

  1. Приготовьте острый электрод с соответствующим сопротивлением.
    1. Используйте боросиликатное стекло одноствольного электрода с нитью (O.D. 1.0 мм, I.D. 0.58 мм). Потяните электрод на выдвижной микропайпет(Таблица материалов). Идеальные электроды, заполненные 1,5% LY в 5 мМ KCl должны иметь сопротивление 200 МЗ при попадании в ванну PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка пуля варьируется в зависимости от используемого аппарата (тип используемой машины и нити шкива). Более высокая настройка тепла обычно дает больше и тоньше советы. Для микропипов, используемых в этом эксперименте, настройки были: тепло: 317, тянуть: 90, скорость: 70, и задержка: 70. Использовалась нить типа корыта.
    2. Храните электроды в закрытом контейнере, чтобы предотвратить попадание пыли на кончик. Держите электроды поднятые из нижней части коробки, чтобы предотвратить кончик от разрушения.
  2. Заполните электрод раствором LY красителя.
    1. Поместите электрод в вертикальное положение с кончиком, обращенным вниз. Pipette 1'2 л РАСТВОРа LY в заднюю часть электрода и ждать 5-10 минут для решения, чтобы перейти к кончику через капиллярное действие.
    2. Аккуратно закрепите заполненный электрод в держателе электрода, подключенном к манипулятору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряный провод держателя электрода должен быть в контакте с LY внутри электрода. При необходимости отрегулируйте громкость решения LY в зависимости от длины провода.

5. Заполнение астроцитов ионтофорезом

  1. Проверьте электрод.
    1. Поместите ломтик мозга осторожно в стеклянную нижнюю тарелку, наполненную 0,1 М ПБС при комнатной температуре. Держите ломтик на месте с платиновой арфой с нейлоновыми струнами.
    2. Убедитесь, что электрод подключен к источнику напряжения и поместите молотый электрод в ванну, содержащую срез мозга.
    3. Переместите цель в область мозга, интересуемую.
    4. Опустите электрод в раствор. Под ярким полем, переместить его в центр поля зрения и тщательно изучить его с 40-x объектив погружения воды, чтобы убедиться, что он появляется ясно и без мусора или пузырьков. Если есть что-то засорение наконечник электрода, замените его на новый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Засорение является проблемой для 200 МЗ электрод. При центрифугации и фильтрации раствора красителя перед каждым экспериментом, это не должно быть частой проблемой. Однако, поскольку кончик электрода небольшой, ткани иногда могут застрять в открытии. Авторы не нашли способ предотвратить это, но это можно легко решить, просто используя новый электрод.
    5. Наблюдайте за кончиком электрода под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом с помощью лазера 488 нм. Затем, тест красителя выброса, включив стимулятор на 12 V. Обратите внимание на большой флуоресцентный краситель облако вокруг кончика электрода в то время как стимулятор на. Если нет или мало красителя выбрасывается на стимуляцию напряжения, заменить электрод.
    6. Под ярким полем медленно опустите электрод к срезу, останавливаясь чуть выше поверхности.
  2. Заполните астроцит ионтофорусом.
    1. Определите астроциты на 40–50 мкм ниже поверхности среза с контрастом инфракрасного дифференциального интерференции (IR-DIC). Ищите клетки с удлиненные, овальной формы соматы около 10 мкм в диаметре. Как только астроцит выбран, переместите его в центр поля зрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая ячейка для ионтофорасиса имеет четкие, определенные границы вокруг него. Не выбирайте ячейки слишком близко к поверхности среза, потому что они не могут быть полностью заполнены. Это занимает некоторую практику в течение нескольких дней, чтобы иметь возможность регулярно определить астроцитов для заполнения красителя. В зависимости от области мозга, используемой для эксперимента, количество астроцитов может варьироваться. Это может повлиять на время, необходимое для идентификации астроцитов перед заполнением.
    2. Медленно опустите наконечник электрода в срез, перемещаясь по ткани, пока он не находится на той же плоскости, что и тело клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещение электрода медленно, чтобы избежать повреждения ткани.
    3. После того, как тело клетки астроцита хорошо видно и очерчены, медленно и осторожно продвигайте электрод вперед. Перемещение электрода до кончика пронзает сомы клетки. Перемещение фокус аминь медленно вверх и вниз, чтобы отметить, если электрод находится внутри сомы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник электрода должен находиться внутри клеточного тела, и следует наблюдать небольшой отступ на соме. Не двигайте электрод дальше, чтобы избежать кончика, проходящего через клетку.
    4. Как только наконечник электрода находится внутри клетки, включите стимулятор при 0,5-1 В и непрерывно выбрасываем ток в клетку. Используя конфокальный микроскоп, наблюдайте, как клетка заполняет. Увеличьте цифровой зум, чтобы увидеть детали ячейки и убедитесь, что кончик электрода виден внутри клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя напряжение, если кажется, что краситель просачивается из клетки или заполнения других клеток в непосредственной близости. Если окажется, что краситель все еще вытекает из клетки, вытащите электрод медленно и найдите другую клетку. Важно, чтобы краситель не протекал, чтобы иметь высокое соотношение сигнала/фона на конечном изображении.
    5. Подождите около 15 минут, пока не определятся более тонкие ветви и процессы, выключите напряжение и аккуратно выдвините наконечник электрода из клетки.
  3. Изображение заполненной ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Визуализация может быть выполнена сразу после заполнения или после окрашивания с иммуногистохимией. Цель с более высокой численной диафрагмой (NA) приводит к лучшему разрешению.
    1. Подождите, пока ячейка вернется в исходную форму, прежде чем изображение (15–20 мин) с 40-x целью. Чтобы изображение ячейки, настроить настройки на confocal, чтобы убедиться, что тонкие ветви и процессы появляются определены.
    2. Навлажь z-стек с размером шага 0,3 мкм. Во время визуализации, переместить цель, пока нет сигнала от клетки и установить, что в качестве верхней. Затем переместите цель вниз (фокусировка через ячейку) до тех пор, пока не будет сигнала, установите это как дно.
    3. После завершения изображения проверьте электрод на выброс красителя. Если появляется большое облако красителя, его можно использовать для следующего среза. В противном случае замените его новым электродом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краска заполнения одного астроцита и изображения занимает около 45 мин до 1 ч. Для этого конкретного эксперимента, можно было получить около 3'6 ячеек на мышь. При необходимости несколько ячеек могут быть помечены на одном и том же срезе. Однако, чтобы отличить отдельные астроциты, не забудьте держать расстояние около 200 мкм между клетками.

6. Окрашивание иммуногистохимией (необязательно)

  1. Как только изображение сделано, немедленно поместите ломтик в 10% формалин на льду, чтобы сохранить для иммуногистохимии. Держите ломтики мозга в темноте и хранить на ночь при 4 градусах Цельсия.
  2. Вымойте мозг разделы 3x в 0,1 M PBS с 0,5% неионический сурфактант (т.е., Тритон X 100) в течение 5 мин каждый. Затем инкубировать в блокирующий раствор 0,1 М PBS с 0,5% неионическим сурфактантом и 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) на 1 ч при комнатной температуре с нежным возбуждением.
  3. Инкубировать секции с возбуждением первичных антител, разбавленных в 0,1 М ПБС с 0,5% неионическим сурфактантом и 5% NGS в течение 2 дней при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за толщины ломтиков мозга, инкубационный период первичных антител необходимо расширить для лучшего проникновения и концентрация антител может быть увеличена. В этом эксперименте, 1:500 разбавления был использован для антиGFAP антитела и 1:500 разбавления был использован для антитела антиквопорин-4.
  4. Вымойте разделы 3x в 0,1 M PBS с 0,5% неионический сурфактант на 10 мин каждый, а затем инкубировать вторичными антителами, разбавленными в 0,1 М PBS с 0,5% неионический сурфактант и 10% NGS для 6 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбирайте вторичное антитело возбужденных 488 нм, который длина волны используется для визуализации LY красителя. В этом эксперименте, 1:1,000 разбавления был использован для Alexa Fluor 546 коза анти-курица IgG (H'L) и Alexa Fluor 647 коза анти-кролик IgG (H'L).
  5. Промыть секции 3x в 0,1 М PBS за 10 минут каждый. Затем смонтировать разделы на стеклянных слайдах микроскопа в монтажных носителях, подходящих для флуоресценции. Уплотнить слайды. Ячейки изображения размером 0,3 мкм.

Результаты

Данные, представленные в этом исследовании, от 7 до 12 клеток от 4 мышей в каждом эксперименте. Средние данные регистрируются в группах цифр, где это уместно.

Для оценки морфологии астроцитов мы провели внутриклеточный ионтофорус с помощью LY красителя для заполнения астроц...

Обсуждение

Метод, изложенный в настоящей статье, описывает способ визуализации морфологии астроцитов с помощью внутриклеточного ионтофореза ЛАЙ-красителя в слегка фиксированных ломтиках мозга. Есть несколько критических факторов, отмеченных в этом протоколе, которые способствуют успешной ион?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят г-жу Сото, д-ра Yu и д-ра Октко за рекомендации, а также за комментарии к тексту. Эта работа поддерживается NS060677.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered Formalin PhosphateFisherSF 100-20An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor MembranePall4692An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pelletWPIEP2A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)Thermo ScientificA-11040A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)Thermo ScientificA27040A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibodyNovus BiologicalsNBP1-87679A similar alternative can be used
Anti GFAP antibodyAbcamab4674A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filamentWorld precision instruments1B150F-4
C57BL/6NTac miceTaconic StockB6A similar alternative can be used
Calcium ChlorideSigma21108An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscopeOlympusFV1000MPEA similar alternative can be used
D-glucoseSigmaG7528An identical alternative can be used
Disodium PhosphateSigma255793An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97SutterP-97A similar alternative can be used
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)Sagent Pharmaceuticals400-10An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)Bitplane Inc.A similar alternative can be used
IsofluoraneHenry Schein Animal Health29404An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)Clipper1050035An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium saltSigmaL0259
Lucifer Yellow CH dipotassium saltSigmaL0144
Magnesium ChlorideSigmaM8266An identical alternative can be used
Microscope Cover GlassThermo Scientific24X60-1An identical alternative can be used
Microscope SlidesFisher12-544-2An identical alternative can be used
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000An identical alternative can be used
Objective lens (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWA similar alternative can be used
Objective lens (60x)OlympusPlanAPO 60XA similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mLVWRVWRVE404An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200A similar alternative can be used
Potassium ChlorideSigmaP3911An identical alternative can be used
Sodium BicarbonateSigmaS5761An identical alternative can be used
Sodium ChlorideSigmaS5886An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010World precision instrumentsOmnical 2010A similar alternative can be used
Triton X 100SigmaT8787An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000Pelco100-SA similar alternative can be used

Ссылки

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

15143D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены