Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Özet

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Özet

Astrositler nöral devrelerin temel bileşenleridir. Onlar tüm merkezi sinir sistemi döşeme (CNS) ve nörotransmitter temizliği, iyon regülasyonu, sinaptik modülasyon, nöronlar için metabolik destek ve kan akımı düzenleme dahil fonksiyonları, çeşitli katılır. Astrositler bir soma olan karmaşık hücrelerdir, birkaç ana dalları, ve nöropil içinde çeşitli hücresel elementlertemas çok sayıda ince süreçler. Astrositlerin morfolojisini değerlendirmek için yapılarını görselleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme sahip olmak gerekir. Erişkin farelerden hafifçe sabitlenmiş beyin dokusunda floresan Lucifer sarısı (LY) boya kullanarak astrositlerin hücre içi iyontoforezini gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol sıyoruz. Bu yöntem, astrosit morfolojisi karakterize etmek için yararlı olan çeşitli özelliklere sahiptir. Bu, yapılarının farklı yönleri üzerinde morfolojik analizler yapmak için yararlı olan bireysel astrositlerin üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Ly iyontoforezi ile birlikte immünohistokimya, astrositlerin sinir sisteminin farklı bileşenleriyle etkileşimini anlamak ve etiketli astrositler içindeki proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, ışık mikroskobu ile astrosit morfolojisini titizlikle incelemek için CNS bozukluklarının çeşitli fare modellerinde uygulanabilir. LY iontoforezi, astrosit yapısını değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım sağlar, özellikle bu hücrelerin önemli morfolojik değişikliklere uğraması önerildiği yaralanma veya hastalık bağlamında.

Giriş

Astrositler merkezi sinir sistemindeki en bol glial hücrelerdir (CNS). Onlar iyon homeostazı rol oynamak, kan akımı düzenleme, sinaps oluşumu yanı sıra eleme, ve nörotransmitter alımı¹. Astrosit fonksiyonlarıgeniş bir yelpazede karmaşık morfolojik yapısı^{2yansıtılır ,3}. Astrositler, sinapslar, dendritler, akslar, kan damarları ve diğer glial hücrelerle doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal ve broşüre ayrılan birkaç birincil ve ikincil dal içerir. Astrosit morfolojisi farklı beyin bölgeleri arasında değişir, hangi nöronal devrelerde farklı işlevlerini gerçekleştirmek için yeteneklerini ipucu olabilir⁴. Ayrıca, astrositler gelişim sırasında morfolojisini değiştirmek için bilinen, fizyolojik koşullar sırasında, ve birden fazla hastalık devletler^{de 3,5,6}.

Astrosit morfolojisinin karmaşıklığını doğru bir şekilde çözmek için tutarlı, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Geleneksel olarak, immünohistokimya astrosit spesifik veya astrosit zenginleştirilmiş protein belirteçleri kullanımı ile astrosit görselleştirmek için kullanılmıştır. Ancak bu yöntemler astrositin yapısından çok protein ekspresyonunun paternini ortaya koymaktadır. Glial fibrillary asidik protein (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) gibi yaygın olarak kullanılan belirteçler tüm hücre hacminde ifade etmez ve böylece tam morfolojiyi çözemez⁷. Floresan proteinleri astrositlerde (viral enjeksiyonlar veya transgenik fare muhabiri çizgileri) her yerde ifade etmek için genetik yaklaşımlar ince dalları ve genel bölgeyi belirleyebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek zordur ve analizler özel organizatör⁸tarafından hedeflenen astrosit popülasyonu tarafından önyargılı olabilir. Seri kesit elektron mikroskobu sinapslar ile astrosit süreçlerin etkileşimleri ayrıntılı bir resim ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Sinapslarla temas eden binlerce astrosit süreci nedeniyle, şu anda bu teknik⁹ile tüm hücreyi yeniden yapılandırmak mümkün değildir , ancak bu veri analizi için makine öğrenme yaklaşımlarının kullanımı ile değişmesi beklenmektedir.

Bu raporda, fare astrositlerini Lucifer sarısı (LY) boya ile hücre içi iyontoforez kullanarak, CA1 stratum radiatum'u örnek olarak kullanarak karakterize eden bir prosedüre odaklanıyoruz. Yöntem Eric Bushong ve Mark Ellisman^10,11tarafından öncü geçmiş çalışmaları dayanmaktadır. Hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinden gelen astrositler kendine özgü soma şekilleri ile tanımlanır ve LY ile doldurulur. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenir. LY iyontoforezinin tek tek astrositleri yeniden yapılandırmak ve süreçlerinin ve bölgelerinin ayrıntılı morfolojik analizlerini yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem astrositler ve nöronlar, diğer glial hücreler ve beyin vaskülatür arasındaki mekansal ilişkileri ve etkileşimleri belirlemek için immünohistokimya ile birlikte uygulanabilir. LY iyontoforezinin farklı beyin bölgelerinde morfolojiyi ve sağlıklı veya hastalık lı hastalık lı fare modellerini analiz etmek için çok uygun bir araç olduğunu düşünüyoruz^7,12,13.

Protokol

Bu çalışmada hayvan deneyleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüsü Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Rektör Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneylerde karışık cinsiyetli yetişkin fareler (6−8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Çözüm Hazırlama

1. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi
   1. Her deneyden önce taze ACSF çözeltisi (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mM NaHCO₃, 11 mM D-glikoz, 1,25 mM Na₂HPO₄ve 2 mM CaCl₂₎hazırlayın. Son adımda MgCl₂ ve CaCl_2'yi ekleyin. Bileşenleri yüksek kaliteli deiyonize suda çözün.
   2. ACSF çözeltisini 35 °C'de bir su banyosunda ve köpükle %95 O₂/ %5 CO_2'yi deneyden önce en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   3. ACSF'de (100 mL) %0.02'lik son konsantrasyona ulaşmak için %2 lidokain hidroklorür ekleyin.
2. Fiksatif çözüm
   1. Tamponlu fosfatın %10 formalinkullanın.
3. LY boya çözeltisi
   1. 5 mM KCl. Girdap'ta LY CH dilithium tuzu veya LY CH dipotasyum tuzu eriterek %1,5 LY boya çözeltisi hazırlayın. 1 mL'lik bir hacim çeşitli deneyler için yeterlidir.
   2. 16.800 x g10 dk için santrifüj . Daha sonra, 0,2 μm şırınga filtresi ile yeni bir tüp içine supernatant filtre. Aliquots 3 aya kadar 4 °C'de tutulabilir.
      NOT: Boya parçacıklarının toplanmasını önlemek için boya çözeltisini santrifüj etmek ve filtrelemek çok önemlidir, bu da elektrotu tıkayabilir.

2. Fare Transkardiyal Perfüzyon ve Beyin Diseksiyonu

1. Transkardiyal perfüzyon için ekipman ve fare hazırlanması
   NOT: Her iki cinsin C57/BL6 fareleri kullanılabilir. Yöntemin güvenilir bir şekilde çalışabilmek için farelerin 3 aydan daha yaşlı olmamasının önemli olduğu deneysel olarak gözlenmiştir (6−8 haftalık idealdir). Perfüzyon protokolü aşağıda açıklanmıştır. Ek bir başvuru daha fazla bilgi için sağlanır¹⁴.
   1. Hattaki hava kabarcıklarını temizlemek için ACSF çözeltisi ile perfüzyon borularını temizleyin. Kullanım sırasına göre cerrahi aletler (cımbız, kavisli, künt makas, iris makas) ayarlayın.
   2. Odaya 2−3 mL izofluran ekledikten sonra fareyi bir izofluran indüksiyon odasına koyarak derinden anestezi edin. Anestezinin etkili olması için 1−2 dk bekleyin. Nefes almanın durmadığından emin olun.
   3. Ayak sıkışmarefleksi için test edin. Fare ağrı uyarıcıya yanıt vermiyorsa ve refleks olmadığında devam edin. Oksijen ve bacaklarda% 5 izofluran kaynağı ile nefes koni yerleştirilen kafa ile supine pozisyonda hayvan güvenli ve kuyruk kimyasal bir duman başlık içinde bantlanmış.
2. Transkardiyal perfüzyon
   1. Cımbız kullanarak, göğüs kafesi altında deri kaldırın. Karın boşluğuortaya çıkarmak için deri yoluyla kavisli, künt makas ile 5−6 cm'lik bir kesi yapın. Karaciğer ve diyafram görünür olana kadar karın duvarından yukarı doğru kesin.
   2. Karaciğeri yavaşça diyagramdan uzaklaştırın. Iris makas ile diyaframda 3−4 cm lateral kesi yapın.
   3. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için vücudun her iki tarafı boyunca göğüs kafesi ile kesin. Kalbe zarar vermemeye ve akciğerlerden uzak durmaya dikkat edin. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kaldır.
   4. Kalp görünür olduğunda, bir antikoagülan olarak sol ventrikül içine 0.05 mL heparin sodyum çözeltisi (mL başına 1.000 USP) enjekte. Daha sonra perfüzyon iğnesini dikkatlice sol ventriküle takın. İğnenin ventrikülde kaldığından ve diğer kalp odalarına delmediğinden emin olun. Iris makas ile sağ atriyumda küçük bir kesi yapın.
   5. Acsf çözeltisi ile vücut mevcut sıvı kantemizlenir kadar yaklaşık 10 mL /dk oranında perfuse (1−2 dk).
   6. Herhangi bir hava kabarcığı sunmadan ACSF çözümünden fiksatif çözüme geçin. 10−20 mL/dk'da 10 dakika boyunca fiksatif solüsyon ile perfuse.
      DİkKAT: Burundan fiksatif bir çözüm süzülmüş olduğuna dikkat edin. Bu iğne sağ ventrikül ulaştı ve fiksatif yerine vücudun geri kalanına sistemik devre yoluyla akciğerlere seyahat olduğunu gösterir.
3. Beynin diseksiyonu
   1. Makasla farenin başını çıkarın ve farebeynini kafatasından dikkatlice inceleyin. Kısa bir fiksasyon sonrası süre için oda sıcaklığında 1,5 saat için fiksatif çözelti yerleştirin.
      NOT: Başarılı LY iyontoforezi için iyi bir perfüzyon gereklidir. Beyin beyaz renkli olmalı ve beyin vaskülatürde kan yok. Vücut ve uzuvlar sert görünmelidir.

3. Dilim Hazırlama

1. Hipokampal dilimlerin hazırlanması
   1. 5 dakika oda sıcaklığında 0,1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile beyni yıkayın. Sonra, filtre kağıdı ile beyin kuru ve koku ampul ve beyincik keskin bir jilet ile çıkarın.
   2. Beyni cyanoakrilat tutkal kullanarak vibratom tepsisine monte edin ve tepsiyi oda sıcaklığında PBS ile doldurun. 110 μm kalınlığında hipokampal koronal kesitler kesin.
      NOT: Dilimlerin aynı kalınlığa ve eşit yüzeye sahip olduğundan emin olmak için vibratomun ayarını ayarlayın. Bu deney için, cihazüzerinde rasgele ayarlar olan 4,5 hız ayarı ve 8 frekans ayarı kullanılmıştır(Malzeme Tablosu). Kullanıcıların diğer aygıtlarda ayarları denemeleri gerekebilir.
   3. Tepsiden bölümleri toplayın ve buz üzerinde PBS bir çanak yerleştirin.

4. Elektrot Hazırlama

1. Uygun direnç ile keskin bir elektrot hazırlayın.
   1. Filamentli borosilikat cam tek namlulu elektrot kullanın (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm). Bir mikropipet çekmece(Malzeme Tablosu)üzerinde bir elektrot çekin. 5 mM KCl'de %1,5 LY ile doldurulmuş ideal elektrotlar, PBS banyosuna yerleştirildiğinde 200 MΩ direnç olmalıdır.
      NOT: Çekmece ayarı cihaza (kullanılan makine nin tipi ve çekmece filamenti) bağlı olarak değişir. Daha yüksek bir ısı ayarı genellikle daha uzun ve ince ipuçları verir. Bu deneyde kullanılan mikropipet çekmecesi için ayarlar: ısı: 317, çekme: 90, hız: 70 ve gecikme: 70. Yalak tipi bir filament kullanıldı.
   2. Tozun uca girmesini önlemek için elektrotları kapalı bir kapta saklayın. Ucun kırılmasını önlemek için elektrotları kutunun altından yüksek tutun.
2. Elektrotly boya çözeltisi ile doldurun.
   1. Ucu aşağıya bakacak şekilde bir elektrotu dikey konuma getirin. Pipet 1−2 μL LY çözeltisi elektrotun arkasına ve çözeltinin kılcal hareket le ucuna taşınması için 5−10 dk bekleyin.
   2. Bir manipülatöre bağlı elektrot tutucudaki dolu elektrotun yerini yavaşça sabitle.
      NOT: Elektrot tutucunun gümüş telinin elektrot içindeki LY ile temas etmesi gerekir. Tel uzunluğuna bağlı olarak gerekirse LY çözeltisinin hacmini ayarlayın.

5. Astrositleri İontoforez ile Doldurmak

1. Elektrot testi yapın.
   1. Oda sıcaklığında 0,1 M PBS ile dolu cam bir alt çanak içine yavaşça bir beyin dilimi yerleştirin. Naylon dizeleri ile platin bir arp ile yerinde dilim tutun.
   2. Elektrotun bir voltaj kaynağına bağlı olduğundan emin olun ve zemin elektrodu beyin dilimini içeren banyoya yerleştirin.
   3. Hedefi ilgi nin beyin bölgesine taşıyın.
   4. Elektrot çözeltiye indirin. Parlak alanın altında, görüş alanının merkezine taşıyın ve net ve enkaz veya kabarcıklar olmadan görünmesini sağlamak için 40x su daldırma lens ile dikkatle inceleyin. Elektrot ucunu tıkayan bir şey varsa, yenisiyle değiştirin.
      NOT: Tıkanma 200 MΩ elektrot için bir endişe kaynağıdır. Her deneyden önce boya çözeltisinin santrifüj ve filtrasyonu ile bu sık karşılaşılan bir sorun olmamalıdır. Ancak, elektrotucu küçük olduğundan, doku bazen açılışsıkışmış olabilir. Yazarlar bunu önlemek için bir yol bulamadık, ama kolayca sadece yeni bir elektrot kullanarak ele alınabilir.
   5. 488 nm lazer ile confocal lazer tarama mikroskobu altında elektrot ucu gözlemleyin. Daha sonra, 12 V.'de uyarıcıyı açarak boya çıkarma test edin. Voltaj stimülasyonu üzerine hiçbir veya az boya çıkarılırsa elektrot değiştirin.
   6. Parlak alanın altında, elektrodu yavaşça yüzeyin hemen üzerinde duran dilime doğru indirin.
2. Astrositi iyontoforezle doldurun.
   1. İnfra-kırmızı diferansiyel girişim kontrastı (IR-DIC) ile dilim yüzeyinin 40−50 m altında astrositleri tanımlayın. Çapı yaklaşık 10 μm uzamış, oval şekilli somata ile hücreleri arayın. Bir astrosit seçildikten sonra, görüş alanının merkezine taşıyın.
      NOT: İontoforez için iyi bir hücrenin etrafında açık ve tanımlanmış sınırlar vardır. Tamamen doldurulamadıkları için dilimin yüzeyine çok yakın hücreleri seçmeyin. Bu rutin boya dolgu için astrositler belirlemek edebilmek için birkaç gün içinde bazı uygulama alır. Deney için kullanılan beyin bölgesine bağlı olarak, astrosit lerin sayısı değişebilir. Bu, doldurmadan önce bir astrositi tanımlamak için gereken zamanı etkileyebilir.
   2. Hücre gövdesi ile aynı düzlemde olana kadar, yavaşça doku da gezinme, dilim içine elektrot ucu indirin.
      NOT: Dokuzarar önlemek için yavaş yavaş elektrot hareket ettirin.
   3. Bir kez astrosit hücre gövdesi açıkça görünür ve özetlenen, yavaş yavaş ve yavaşça ileri elektrot ilerlemek. Ucu hücrenin soma impales kadar elektrot taşıyın. Elektrot soma içinde olup olmadığını not etmek için objektif odak yavaş yavaş yukarı ve aşağı hareket ettirin.
      NOT: Elektrot ucu hücre gövdesiiçinde olmalı ve soma üzerinde küçük bir girintinasyon gözlenmelidir. İpucunun hücreden geçmesinden kaçınmak için elektrotun daha fazla hareket ettirin.
   4. Elektrot ucu hücrenin içine girdikten sonra , ~0,5−1 V'deki uyarıcıyı açın ve sürekli olarak hücreye akım fırlatın. Konfokal mikroskobu kullanarak hücrenin dolmasını izleyin. Hücrenin ayrıntılarını görmek için dijital yakınlaştırmayı artırın ve elektrotun ucunun hücre içinde görünür olduğundan emin olun.
      NOT: Boyanın hücreden sızdığı veya çevredeki diğer hücreleri doldurduğu görülürse voltajı düşürün. Eğer boya hala hücreden dışarı sızıyor gibi görünüyorsa, elektrot yavaş yavaş dışarı çekin ve başka bir hücre bulmak. Boyanın son görüntüde yüksek sinyal/arka plan oranına sahip olması için sızdırmaması önemlidir.
   5. İnce dallar ve süreçler tanımlı görünene kadar yaklaşık 15 dakika bekleyin, voltajı kapatın ve elektrot ucunu hücreden yavaşça çekin.
3. Dolu hücreyi görüntüle.
   NOT: Görüntüleme, immünohistokimya ile boyandıktan hemen sonra veya sonra yapılabilir. Daha yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip bir hedef daha iyi çözünürlük sağlar.
   1. 40x hedefiyle görüntülemeden önce hücrenin orijinal forma dönmesini bekleyin (15−20 dk). Hücreyi görüntülemek için, daha ince dalların ve işlemlerin tanımlı göründüğünden emin olmak için konfokal üzerindeki ayarı ayarlayın.
   2. Adım boyutu 0,3 μm olan bir z yığını ayarlayın. Görüntüleme sırasında, hücreden sinyal gelene kadar hedefi hareket ettirin ve bunu üst olarak ayarlayın. Daha sonra, hiçbir sinyal olana kadar (hücre üzerinden odaklanarak) aşağı objektif taşıyın, alt olarak ayarlayın.
   3. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, boya ejeksiyonu için elektrot kontrol edin. Büyük bir boyama bulutu görünürse, bir sonraki dilim için kullanılabilir. Aksi takdirde, yeni bir elektrot ile değiştirin.
      NOT: Tek bir astrosit ve görüntüleme nin boya dolgusu yaklaşık 45 dakika ile 1 saat arasında sürer. Bu özel deney için fare başına yaklaşık 3−6 hücre elde etmek mümkündür. Gerekirse, birden çok hücre aynı dilimüzerinde etiketlenebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek için, hücreler arasında yaklaşık 200 μm mesafe tutmak emin olun.

6. İmmünohistokimya ile Boyama (İsteğe Bağlı)

1. Görüntüleme yapıldıktan sonra, hemen immünohistokimya için korumak için buz üzerinde% 10 formalin dilim yerleştirin. Beyin dilimlerini karanlıkta tutun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
2. 0,1 M PBS'de beyin kesitlerini %0,5 noniyonik yüzey aktif maddeyle (yani Triton X 100) 5 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra 0.1 M PBS'lik bir bloklama çözeltisinde %0.5 noniyonik yüzey aktif madde ve %10 normal keçi serumu (NGS) ile oda sıcaklığında hafif ajitasyon la 1 saat kuluçkaya yatırın.
3. 0,1 M PBS'de seyreltilmiş primer antikorlarda ajitasyon içeren kesitleri %0,5 noniyonik yüzey aktif madde ve %5 NGS ile 4 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
   NOT: Beyin dilimlerinin kalınlığı nedeniyle, primer antikorların kuluçka süresinin daha iyi penetrasyon için uzatılması ve antikor konsantrasyonunun arttırılması gerekir. Bu deneyde anti GFAP antikoriçin 1:500 seyreltme, anti aquaporin-4 antikor için 1:500 seyreltme kullanılmıştır.
4. Bölümleri 0,1 M PBS'de 10'ar dakika boyunca %0,5 niyonik yüzey aktif madde ile yıkayın ve 0,1 M PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlar ile %0,5 noniyonik yüzey aktif madde ve oda sıcaklığında 6 saat için %10 NGS ile kuluçkaya yatırın.
   NOT: LY boyasını görselleştirmek için kullanılan dalga boyu olan 488 nm ile heyecanlanan ikincil bir antikor seçmeyin. Bu deneyde, 1:1.000 seyreltme Alexa Fluor 546 keçi anti-tavuk IgG (H +L) ve Alexa Fluor 647 keçi anti-tavşan IgG (H +L) için kullanılmıştır.
5. Her biri 10 dakika boyunca 0,1 M PBS'de 3x kesitleri durulayın. Daha sonra bölümleri floresan için uygun montaj ortamlarında cam mikroskop slaytlarına monte edin. Slaytları mühürleyin. 0,3 μm adım boyutundaki görüntü hücreleri.

Sonuçlar

Bu çalışmada bildirilen veriler her deneyde 4 fareden 7−12 hücreden elde edilebistir. Ortalama veriler, uygun olduğu durumlarda şekil panellerinde raporlanır.

Astrosit morfolojisini değerlendirmek için, Şekil 1'deözetlenen CA1 stratum radyatumdaki astrositleri doldurmak için LY boyası kullanarak hücre içi iyontoforez uyguladık. Şekil 2 temsili bir astrositi ve ayrıntılı morfolojik yapısını betimlemektedir. Hücre 488 nm la...

Tartışmalar

Bu yazıda özetlenen yöntem, hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinde LY boyasının hücre içi iontoforezini kullanarak astrosit morfolojisini görselleştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokolde vurgulanan ve başarılı LY iyontoforezine ve hücrelerin morfolojik rekonstrüksiyonuna katkıda bulunan birçok kritik faktör bulunmaktadır. Bir faktör kalitesi ve büyük ölçüde farenin yaşı ve perfüzyon sonucu tarafından belirlenir görüntülerin çoğaltılabilirlik vardır. Bu çalışmada 6−8 ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher	SF 100-20	An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall	4692	An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody	Novus Biologicals	NBP1-87679	A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody	Abcam	ab4674	A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac mice	Taconic Stock	B6	A similar alternative can be used
Calcium Chloride	Sigma	21108	An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	A similar alternative can be used
D-glucose	Sigma	G7528	An identical alternative can be used
Disodium Phosphate	Sigma	255793	An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97	Sutter	P-97	A similar alternative can be used
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		A similar alternative can be used
Isofluorane	Henry Schein Animal Health	29404	An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)	Clipper	1050035	An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt	Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass	Thermo Scientific	24X60-1	An identical alternative can be used
Microscope Slides	Fisher	12-544-2	An identical alternative can be used
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	An identical alternative can be used
Objective lens (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	A similar alternative can be used
Objective lens (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL	VWR	VWRVE404	An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	A similar alternative can be used
Potassium Chloride	Sigma	P3911	An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	An identical alternative can be used
Sodium Chloride	Sigma	S5886	An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010	World precision instruments	Omnical 2010	A similar alternative can be used
Triton X 100	Sigma	T8787	An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	A similar alternative can be used