Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Zusammenfassung

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Zusammenfassung

Astrozyten sind wesentliche Bestandteile neuronaler Schaltkreise. Sie kacheln das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) und sind an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt, die Neurotransmitter Clearance, Ionenregulierung, synaptische Modulation, metabolische Unterstützung für Neuronen, und Blutflussregulierung gehören. Astrozyten sind komplexe Zellen, die ein Soma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche feine Prozesse haben, die verschiedene zelluläre Elemente innerhalb des Neuropils kontaktieren. Um die Morphologie von Astrozyten zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zu haben, um ihre Struktur zu visualisieren. Wir berichten über ein zuverlässiges Protokoll zur intrazellulären Iontophorese von Astrozyten mit fluoreszierendem Luzifergelb (LY) Farbstoff in leicht fixiertem Hirngewebe von erwachsenen Mäusen. Diese Methode hat mehrere Funktionen, die nützlich sind, um Astrozytenmorphologie zu charakterisieren. Es ermöglicht eine dreidimensionale Rekonstruktion einzelner Astrozyten, die nützlich ist, um morphologische Analysen zu verschiedenen Aspekten ihrer Struktur durchzuführen. Die Immunhistochemie kann zusammen mit der LY-Iontophorese auch genutzt werden, um die Wechselwirkung von Astrozyten mit verschiedenen Komponenten des Nervensystems zu verstehen und die Expression von Proteinen innerhalb der markierten Astrozyten zu bewerten. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Mausmodellen von ZNS-Störungen implementiert werden, um die Astrozytenmorphologie mit Lichtmikroskopie streng zu untersuchen. Die LY-Iontophorese bietet einen experimentellen Ansatz zur Bewertung der Astrozytenstruktur, insbesondere im Zusammenhang mit Verletzungen oder Krankheiten, bei denen diese Zellen signifikante morphologische Veränderungen erfahren sollen.

Einleitung

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Sie spielen Rollen in Ionenhomöostase, Blutflussregulation, Synapse-Bildung sowie Elimination, und Neurotransmitter Aufnahme¹. Das breite Spektrum der Astrozytenfunktionen spiegelt sich in ihrer komplexen morphologischen Struktur^2,3wider. Astrozyten enthalten mehrere primäre und sekundäre Zweige, die sich in Tausende von feineren Zweigen und Flugblättern teilen, die direkt mit Synapsen, Dendriten, Axonen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen interagieren. Astrozytenmorphologie variiert zwischen verschiedenen Hirnregionen, was auf ihre Fähigkeit hindeuten kann, ihre Funktionen differenziell in neuronalen Schaltkreisen auszuführen⁴. Darüber hinaus sind Astrozyten dafür bekannt, ihre Morphologie während der Entwicklung, während physiologischer Bedingungen und in mehreren Krankheitszuständen^3,5,6zu verändern.

Eine konsistente, reproduzierbare Methode ist erforderlich, um die Komplexität der Astrozytenmorphologie genau aufzulösen. Traditionell wurde die Immunhistochemie verwendet, um Astrozyten mit der Verwendung von astrozytenspezifischen oder astrozytenangereicherten Proteinmarkern zu visualisieren. Diese Methoden zeigen jedoch eher das Muster der Proteinexpression als die Struktur der Astrozyten. Die häufig verwendeten Marker, wie z.B. glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 Calciumbindungsprotein (S100), drücken nicht im gesamten Zellvolumen aus und lösen somit keine vollständige Morphologie⁷. Genetische Ansätze zur Expressfluoreszenzproteine in Astrozyten (virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien) können die feineren Zweige und das gesamte Territorium identifizieren. Es ist jedoch schwierig, einzelne Astrozyten zu unterscheiden, und Analysen können durch die Astrozytenpopulation verzerrt werden, die vom spezifischen Promotor angestrebt wird⁸. Serial section electron microscopy wurde verwendet, um ein detailliertes Bild der Wechselwirkungen von Astrozytenprozessen mit Synapsen zu enthüllen. Aufgrund der Tausenden von Astrozytenprozessen, die synapses kontaktieren, ist es derzeit nicht möglich, eine ganze Zelle mit dieser Technik⁹zu rekonstruieren, obwohl dies sich mit dem Einsatz von Machine Learning-Ansätzen für die Datenanalyse ändern dürfte.

In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Mausastrozyten mit intrazellulärer Iontophorese mit Luzifergelb (LY) Farbstoff, am Beispiel des CA1-Stratum-Radiatums. Die Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten von Eric Bushong und Mark Ellisman^10,11. Astrozyten aus leicht fixierten Hirnscheiben werden durch ihre unverwechselbare Soma-Form identifiziert und mit LY gefüllt. Die Zellen werden dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wir zeigen, wie LY-Iontophorese verwendet werden kann, um einzelne Astrozyten zu rekonstruieren und detaillierte morphologische Analysen ihrer Prozesse und gebiete durchzuführen. Auch kann diese Methode in Verbindung mit der Immunhistochemie angewendet werden, um räumliche Beziehungen und Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen, anderen Gliazellen und Gehirnvaskulatur zu identifizieren. Wir betrachten LY Iontophorese als ein sehr geeignetes Werkzeug, um Morphologie in verschiedenen Hirnregionen und Mausmodelle von gesunden oder Krankheitszuständen^7,12,13zu analysieren.

Protokoll

Die Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Animal Research Committee der Kanzlerin an der University of California, Los Angeles, genehmigt. Erwachsene Mäuse (6-8 Wochen alt) mit gemischtem Geschlecht wurden in allen Experimenten verwendet.

1. Lösungsvorbereitung

1. Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Lösung
   1. Bereiten Sie frische ACSF-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mM NaHCO₃, 11 mM D-Glucose, 1,25 mM Na₂HPO₄und 2 mM CaCl₂) vor jedem Experiment vor. Fügen Sie im letzten Schritt MgCl₂ und CaCl₂ hinzu. Lösen Sie die Komponenten in hochwertigem entionisiertem Wasser auf.
   2. Inkubieren Sie die ACSF-Lösung bei 35 °C in einem Wasserbad und Blasen mit 95%_O2/ 5%_CO2 für mindestens 30 min vor dem Experiment.
   3. Fügen Sie 2% Lidocainhydrochlorid hinzu, um eine Endkonzentration von 0,02% in ACSF (in 100 ml) zu erreichen.
2. Fixative Lösung
   1. Verwenden Sie 10% formalin gepuffertes Phosphat.
3. LY Farbstofflösung
   1. 1,5% LY-Farbstofflösung vorbereiten, indem Sie LY CH Dilithiumsalz oder LY CH Dikaliumsalz in 5 mM KCl. Vortex gründlich auflösen. Für mehrere Experimente reicht ein Volumen von 1 ml aus.
   2. Zentrifuge für 10 min bei 16.800 x g. Filtern Sie dann den Überstand mit einem 0,2-m-Spritzenfilter in ein neues Rohr. Aliquots können bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Farbstofflösung zentrifugieren und filtern, um eine Aggregation der Farbstoffpartikel zu verhindern, die die Elektrode verstopfen können.

2. Maus transkardiale Perfusion und Gehirndissektion

1. Vorbereitung von Geräten und Maus für die transkardiale Perfusion
   HINWEIS: C57/BL6-Mäuse beiderlei Geschlechts können verwendet werden. Es wurde empirisch beobachtet, dass es für eine zuverlässige Arbeit der Methode wichtig ist, dass die Mäuse nicht älter als 3 Monate sind (6-8 Wochen alt ist ideal). Das Perfusionsprotokoll wird unten beschrieben. Eine zusätzliche Referenz ist für weitere Details¹⁴angegeben.
   1. Klare Perfusionsschläuche mit ACSF-Lösung, um Luftblasen in der Leitung zu entfernen. Einrichten von Operationswerkzeugen in der Reihenfolge der Anwendung (Pinzette, gekrümmte, stumpfe Schere, Irisschere).
   2. Die Maus tief anästhesieren, indem sie sie in eine Isofluran-Induktionskammer legt, nachdem man der Kammer 2 x 3 ml Isofluran hinzugefügt hat. Lassen Sie 1 x 2 min für anästhetische Wirkung wirksam werden. Stellen Sie sicher, dass die Atmung nicht aufhört.
   3. Testen Sie auf Zehenkneifreflex. Fahren Sie fort, wenn die Maus nicht auf Schmerzreize reagiert und der Reflex fehlt. Sichern Sie das Tier in der Rückenlage mit dem Kopf in den Atemkegel mit einer Zufuhr von 5% Isofluran in Sauerstoff und die Gliedmaßen und Schwanz in einer chemischen Rauchhaube verklebt.
2. Transkardiale Perfusion
   1. Mit einer Pinzette die Haut unter dem Rippenkäfig heben. Machen Sie einen 5 x 6 cm Schnitt mit der gekrümmten, stumpfen Schere durch die Haut, um die Bauchhöhle freizulegen. Schneiden Sie nach oben durch die Bauchwand, bis Leber und Zwerchfell sichtbar sind.
   2. Bewegen Sie die Leber vorsichtig vom Diagramm weg. Mit einer Irisschere einen seitlichen Einschnitt in der Membran von 3 x 4 cm machen.
   3. Schneiden Sie durch den Rippenkäfig entlang der beiden Seiten des Körpers, um die Brusthöhle freizulegen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schädigen und die Lunge zu vermeiden. Heben Sie das Brustbein nach oben, um das Herz freizulegen.
   4. Sobald das Herz sichtbar ist, injizieren Sie 0,05 ml Heparin-Natriumlösung (1.000 USP pro ml) als Antikoagulans in den linken Ventrikel. Dann perfusion Nadel vorsichtig in den linken Ventrikel einfügen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel im Ventrikel verbleibt und nicht in andere Herzkammern durchdringt. Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Atrium mit Irisschere.
   5. Durchdringen Sie mit ACSF-Lösung mit einer Rate von ca. 10 ml/min, bis die flüssigkeitserhaltende Flüssigkeit von Blut gereinigt wird (1 x 2 min).
   6. Wechseln Sie von der ACSF-Lösung zur fixativen Lösung, ohne Luftblasen einzuführen. Perfuse mit fixativer Lösung für 10 min bei 10 x 20 ml/min.
      ACHTUNG: Achten Sie darauf, dass keine fixative Lösung aus der Nase abfließt. Dies deutet darauf hin, dass die Nadel den rechten Ventrikel erreicht hat und das Fixativ in die Lunge und nicht durch den systemischen Kreislauf zum Rest des Körpers wandert.
3. Zerlegung des Gehirns
   1. Entfernen Sie den Kopf der Maus mit einer Schere und sezieren Sie vorsichtig das Maushirn aus dem Schädel. In fixative Lösung für 1,5 h bei Raumtemperatur für eine kurze Nachfixierungszeit platzieren.
      HINWEIS: Eine gute Perfusion ist für eine erfolgreiche LY-Iontophorese notwendig. Gehirn sollte weiß gefärbt sein und fehlt Blut in Gehirn Vaskulatur. Körper und Gliedmaßen sollten steif erscheinen.

3. Scheibenvorbereitung

1. Zubereitung von Hippocampusscheiben
   1. Waschen Sie das Gehirn mit 0,1 M Phosphat gepufferte Saline (PBS) bei Raumtemperatur für 5 min. Dann trocknen Sie das Gehirn mit Filterpapier aus und entfernen Sie die Olfaktor-Lampe und Kleinhirn mit einer scharfen Rasierklinge.
   2. Montieren Sie das Gehirn auf dem Vibram-Tablett mit Cyanoacrylatkleber und füllen Sie das Fach mit PBS bei Raumtemperatur. Schneiden Sie hippocampale koronale Abschnitte von 110 m Dicke.
      HINWEIS: Passen Sie die Einstellung des Vibratom an, um sicherzustellen, dass die Scheiben die gleiche Dicke und gleichmäßige Oberfläche haben. Für dieses Experiment wurden eine Geschwindigkeitseinstellung von 4,5 und eine Frequenzeinstellung von 8 verwendet, die beliebige Einstellungen auf dem Instrument sind (Tabelle der Materialien). Benutzer müssen möglicherweise mit den Einstellungen auf anderen Geräten experimentieren.
   3. Sammeln Sie die Abschnitte aus dem Tablett und legen Sie in einer Schüssel von PBS auf Eis.

4. Elektrodenvorbereitung

1. Bereiten Sie eine scharfe Elektrode mit entsprechendem Widerstand vor.
   1. Verwenden Sie eine Borosilikatglas-Einfasselektrode mit Filament (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm). Ziehen Sie eine Elektrode auf einem Mikropipette-Puller (Tisch der Materialien). Ideale Elektroden, die mit 1,5% LY in 5 mM KCl gefüllt sind, sollten einen Widerstand von 200 M a haben, wenn sie in ein PBS-Bad gelegt werden.
      HINWEIS: Die Pullereinstellung variiert je nach Gerät (Typ der verwendeten Maschine und Puller-Filament). Eine höhere Wärmeeinstellung gibt in der Regel längere und feinere Spitzen. Für den mikropipette Puller, der in diesem Experiment verwendet wurde, waren die Einstellungen: Hitze: 317, Ziehen: 90, Geschwindigkeit: 70 und Verzögerung: 70. Es wurde ein Trog-Filament verwendet.
   2. Elektroden in einem geschlossenen Behälter aufbewahren, um zu verhindern, dass Staub in die Spitze gelangt. Halten Sie Elektroden von der Unterseite der Box erhöht, um zu verhindern, dass die Spitze bricht.
2. Füllen Sie die Elektrode mit LY Farbstofflösung.
   1. Platzieren Sie eine Elektrode in vertikaler Position mit der Spitze nach unten. Pipette 1-2 l LY-Lösung in die Rückseite der Elektrode und warten Sie 5 x 10 min, bis die Lösung über Kapillarwirkung zur Spitze bewegt wird.
   2. Sichern Sie die gefüllte Elektrode vorsichtig im Elektrodenhalter, der mit einem Manipulator verbunden ist.
      HINWEIS: Der Silberdraht des Elektrodenhalters muss mit dem LY innerhalb der Elektrode in Kontakt sein. Passen Sie die Lautstärke der LY-Lösung bei Bedarf an, abhängig von der Drahtlänge.

5. Füllen von Astrozyten mit Iontophorese

1. Testen Sie die Elektrode.
   1. Legen Sie eine Gehirnscheibe vorsichtig in eine Glasbodenschale, gefüllt mit 0,1 M PBS bei Raumtemperatur. Halten Sie die Scheibe mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode mit einer Spannungsquelle verbunden ist, und legen Sie die Bodenelektrode in das Bad, das die Gehirnscheibe enthält.
   3. Verschieben Sie das Ziel in die Voninteressee des Gehirns.
   4. Senken Sie die Elektrode in die Lösung. Unter dem hellen Feld, bewegen Sie es in die Mitte des Sichtfeldes und untersuchen Sie es sorgfältig mit der 40x Wasser-Immersion-Linse, um sicherzustellen, dass es klar und ohne Schmutz oder Blasen erscheint. Wenn es etwas gibt, das die Elektrodenspitze verstopft, ersetzen Sie sie durch eine neue.
      HINWEIS: Verstopfung ist ein Problem für die 200-M-Elektrode. Bei Zentrifugierung und Filtration der Farbstofflösung vor jedem Experiment sollte dies kein häufiges Problem sein. Da die Spitze der Elektrode jedoch klein ist, kann Gewebe manchmal in der Öffnung stecken bleiben. Die Autoren haben keinen Weg gefunden, dies zu verhindern, aber es kann leicht durch die Verwendung einer neuen Elektrode behandelt werden.
   5. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit dem 488 nm Laser. Dann testen Sie den Farbstoffauswurf, indem Sie den Stimulator bei 12 V einschalten. Beachten Sie eine große fluoreszierende Farbwolke um die Spitze der Elektrode, während der Stimulator eingeschaltet ist. Wenn bei der Spannungsstimulation kein oder weniger Farbstoff ausgeworfen wird, ersetzen Sie die Elektrode.
   6. Unter dem hellen Feld, senken Sie langsam die Elektrode in Richtung der Scheibe, die knapp über der Oberfläche anhält.
2. Füllen Sie Astrozyten mit Iontophorese.
   1. Identifizieren Sie Astrozyten 40 x 50 m unter der Schnittfläche mit dem Infrarot-Differentialinterferenzkontrast (IR-DIC). Suchen Sie nach Zellen mit langgestreckter, ovaler Somata mit einem Durchmesser von ca. 10 m. Sobald ein Astrozyten ausgewählt wurde, verschieben Sie es in die Mitte des Sichtfeldes.
      HINWEIS: Eine gute Zelle für die Iontophorese hat klare, definierte Grenzen um sie herum. Wählen Sie Zellen nicht zu nah an der Oberfläche des Slices aus, da sie nicht vollständig gefüllt werden können. Es dauert einige Übung über ein paar Tage, um in der Lage zu sein, routinemäßig Astrozyten für die Färberei zu identifizieren. Je nach dem für das Experiment verwendeten Hirnbereich kann die Anzahl der Astrozyten variieren. Dies kann sich auf die Zeit auswirken, die benötigt wird, um eine Astrozyten vor dem Füllen zu identifizieren.
   2. Senken Sie langsam die Elektrodenspitze in die Scheibe, navigieren sie durch das Gewebe, bis sie sich auf der gleichen Ebene wie der Zellkörper befindet.
      HINWEIS: Bewegen Sie die Elektrode langsam, um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden.
   3. Sobald der Zellkörper der Astrozyten deutlich sichtbar und umrissen ist, bringen Sie die Elektrode langsam und sanft voran. Bewegen Sie die Elektrode, bis die Spitze das Soma der Zelle aufspießt. Bewegen Sie den Fokus des Objektivs langsam nach oben und unten, um zu beachten, ob sich die Elektrode im Inneren des Soma befindet.
      HINWEIS: Die Elektrodenspitze muss sich im Zellkörper befinden, und es sollte eine kleine Einbuchtung des Soma beobachtet werden. Bewegen Sie die Elektrode nicht weiter, um zu vermeiden, dass die Spitze durch die Zelle geht.
   4. Sobald sich die Elektrodenspitze innerhalb der Zelle befindet, schalten Sie den Stimulator bei 0,5 bis 1 V ein und leiten kontinuierlich Strom in die Zelle aus. Beobachten Sie mit dem konfokalen Mikroskop die Zellfüllung. Erhöhen Sie den digitalen Zoom, um die Details der Zelle zu sehen, und stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode innerhalb der Zelle sichtbar ist.
      HINWEIS: Senken Sie die Spannung, wenn es scheint, dass Farbstoff aus der Zelle austritt oder andere Zellen in der Nähe füllt. Wenn es scheint, dass Farbstoff immer noch aus der Zelle austritt, ziehen Sie die Elektrode langsam heraus und finden Sie eine andere Zelle. Es ist wichtig, dass der Farbstoff nicht austritt, um ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis im endgültigen Bild zu haben.
   5. Warten Sie ca. 15 min, bis die feineren Zweige und Prozesse definiert erscheinen, schalten Sie die Spannung aus und ziehen Sie die Elektrodenspitze vorsichtig aus der Zelle.
3. Bild der gefüllten Zelle.
   HINWEIS: Die Bildgebung kann unmittelbar nach dem Füllen oder nach der Färbung mit Derimmunhistochemie durchgeführt werden. Ein Ziel mit einer höheren numerischen Blende (NA) führt zu einer besseren Auflösung.
   1. Warten Sie, bis die Zelle zur ursprünglichen Form zurückkehrt, bevor Sie sich (15-20 min) mit 40-fachem Objektiv abbilden. Um die Zelle abzubilden, passen Sie die Einstellung auf dem Konfokland an, um sicherzustellen, dass die feineren Verzweigungen und Prozesse definiert erscheinen.
   2. Richten Sie einen Z-Stack mit einer Schrittgröße von 0,3 m ein. Bewegen Sie das Objektiv während der Bildgebung so lange, bis kein Signal von der Zelle gegeben ist, und legen Sie es als Oberseite fest. Dann bewegen Sie das Ziel nach unten (Fokussierung durch die Zelle), bis es kein Signal gibt, stellen Sie das als unten.
   3. Überprüfen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Elektrode auf Farbstoffauswurf. Wenn eine große Farbstoffwolke erscheint, kann sie für das nächste Segment verwendet werden. Andernfalls ersetzen Sie es durch eine neue Elektrode.
      HINWEIS: Die Farbfüllung einer einzelnen Astrozyten- und Bildgebung dauert etwa 45 min bis 1 h. Für dieses spezifische Experiment war es möglich, etwa 3-6 Zellen pro Maus zu erhalten. Bei Bedarf können mehrere Zellen auf demselben Slice beschriftet werden. Um jedoch einzelne Astrozyten zu unterscheiden, achten Sie darauf, einen Abstand von etwa 200 m zwischen den Zellen zu halten.

6. Färbung mit Immunhistochemie (optional)

1. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie die Scheibe sofort in 10% Formalin auf Eis, um für die Immunhistochemie zu erhalten. Gehirnscheiben im Dunkeln aufbewahren und über Nacht bei 4 °C lagern.
2. Waschen Sie Hirnabschnitte 3x in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid (d. h. Triton X 100) für jeweils 5 min. Dann in einer Blockierlösung von 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 10% normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung inkubieren.
3. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Rührung in primären Antikörpern, die in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 5% NGS für 2 Tage bei 4 °C verdünnt werden.
   HINWEIS: Aufgrund der Dicke der Gehirnscheiben muss die Inkubationszeit der primären Antikörper für eine bessere Penetration verlängert und die Antikörperkonzentration erhöht werden. In diesem Experiment wurde eine Verdünnung von 1:500 für Anti-GFAP-Antikörper und eine 1:500-Verdünnung für Anti-Aquaporin-4-Antikörper verwendet.
4. Waschen Sie die Abschnitte 3x in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid für jeweils 10 min und inkubieren Sie dann mit sekundären Antikörpern, die in 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid und 10% NGS für 6 h bei Raumtemperatur verdünnt werden.
   HINWEIS: Wählen Sie keinen sekundären Antikörper, der von 488 nm angeregt wird, was der Wellenlänge entspricht, die zur Visualisierung des LY-Farbstoffs verwendet wird. In diesem Experiment wurde eine 1:1.000 Verdünnung für Alexa Fluor 546 Ziegenanti-Huhn IgG (H+L) und Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) verwendet.
5. Spülen Sie die Abschnitte 3x in 0,1 M PBS für je 10 min. Dann montieren Sie die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias in Montagemedien, die für die Fluoreszenz geeignet sind. Siegel gleitet. Bildzellen mit einer Schrittgröße von 0,3 m.

Ergebnisse

Die in dieser Studie berichteten Daten stammen aus 7 bis 12 Zellen von 4 Mäusen in jedem Experiment. Die durchschnittlichen Daten werden gegebenenfalls in den Abbildungspanels gemeldet.

Um die Astrozytenmorphologie zu bewerten, führten wir eine intrazelluläre Iontophorese mit LY-Farbstoff durch, um Astrozyten im CA1-Stratum-Radiatum zu füllen, die in Abbildung 1zusammengefasst ist. Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Astrozyten und ihre aus...

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode beschreibt eine Möglichkeit, die Astrozytenmorphologie mit intrazellulärer Iontophorese von LY-Farbstoff in leicht fixierten Gehirnscheiben zu visualisieren. Es gibt mehrere kritische Faktoren, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, die zu einer erfolgreichen LY-Iontophorese und morphologischen Rekonstruktion der Zellen beitragen. Ein Faktor ist die Qualität und Reproduzierbarkeit der Bilder, die weitgehend durch das Alter der Maus und das Ergebnis der Perfusion bestim...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher	SF 100-20	An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall	4692	An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody	Novus Biologicals	NBP1-87679	A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody	Abcam	ab4674	A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac mice	Taconic Stock	B6	A similar alternative can be used
Calcium Chloride	Sigma	21108	An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	A similar alternative can be used
D-glucose	Sigma	G7528	An identical alternative can be used
Disodium Phosphate	Sigma	255793	An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97	Sutter	P-97	A similar alternative can be used
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		A similar alternative can be used
Isofluorane	Henry Schein Animal Health	29404	An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)	Clipper	1050035	An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt	Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass	Thermo Scientific	24X60-1	An identical alternative can be used
Microscope Slides	Fisher	12-544-2	An identical alternative can be used
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	An identical alternative can be used
Objective lens (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	A similar alternative can be used
Objective lens (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL	VWR	VWRVE404	An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	A similar alternative can be used
Potassium Chloride	Sigma	P3911	An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	An identical alternative can be used
Sodium Chloride	Sigma	S5886	An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010	World precision instruments	Omnical 2010	A similar alternative can be used
Triton X 100	Sigma	T8787	An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	A similar alternative can be used