Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

Resumo

Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Resumo

Os astrócitos são componentes essenciais dos circuitos neurais. Eles telha todo o sistema nervoso central (CNS) e estão envolvidos em uma variedade de funções, que incluem o afastamento do neurotransmissor, regulação de íons, modulação sináptica, suporte metabólico para neurônios, e regulação do fluxo sanguíneo. Os astrócitos são células complexas que têm um soma, vários ramos principais, e inúmeros processos finos que contatam diversos elementos celulares dentro do neuropil. A fim de avaliar a morfologia dos astrócitos, é necessário ter um método confiável e reprodutível para visualizar sua estrutura. Nós relatamos um protocolo de confiança para executar o iontoforese intracelular dos astrócitos usando a tintura fluorescente do amarelo de Lúcifer (ly) no tecido levemente fixo do cérebro dos ratos adultos. Este método tem diversas características que são úteis caracterizar a morfologia do astrocyte. Permite a reconstrução tridimensional de astrócitos individuais, o que é útil para realizar análises morfológicas em diferentes aspectos de sua estrutura. Immunohistochemistry junto com o iontoforese de ly pode igualmente ser utilizado para compreender a interação dos astrócitos com componentes diferentes do sistema nervoso e para avaliar a expressão das proteínas dentro dos astrócitos etiquetados. Este protocolo pode ser executado em uma variedade de modelos do rato de desordens do CNS para examinar rigorosa a morfologia do astrocyte com microscopia de luz. A iontoforese de LY fornece uma aproximação experimental para avaliar a estrutura do astrocyte, especial no contexto da lesão ou da doença onde estas pilhas são propor para submeter-se a mudanças morfológicas significativas.

Introdução

Os astrócitos são as células gliais mais abundantes no sistema nervoso central (SNC). Jogam papéis na homeostase do íon, na regulação do fluxo sanguíneo, na formação do sinapse assim como na eliminação, e na captação¹do neurotransmissor. A vasta gama de funções do astrocyte é refletida em sua estrutura morfológica complexa^2,3. Os astrócitos contêm vários ramos primários e secundários que se dividem em milhares de branchlets e folhetos mais finos que interagem diretamente com sinapses, dendritos, axônios, vasos sanguíneos e outras células gliais. A morfologia do astrocyte varia em diferentes regiões cerebrais, o que pode sugerir sua capacidade de desempenhar suas funções diferencialmente em circuitos neuronais⁴. Além disso, os astrócitos são conhecidos por alterarem sua morfologia durante o desenvolvimento, durante as condições fisiológicas, e em múltiplos estados de doença^3,5,6.

Um método consistente, reprodutível é necessário para resolver com precisão a complexidade da morfologia do astrocyte. Tradicionalmente, a imunohistoquímica tem sido usada para visualizar os astrócitos com o uso de marcadores de proteínas enriquecidos astrocícitos ou astrocícitos. No entanto, esses métodos revelam o padrão de expressão protéica em vez da estrutura do astrocícito. Os marcadores comumente usados, como a proteína ácida fibrilhante glial (GFAP) e a proteína de ligação de cálcio S100 β (S100β), não expressam em todo o volume celular e, portanto, não resolvem a morfologia completa⁷. Abordagens genéticas para expressar proteínas fluorescentes onipresente em astrócitos (injeções virais ou linhas de repórter transgênica do mouse) podem identificar os ramos mais finos e o território geral. No entanto, é difícil diferenciar os astrócitos individuais, e as análises podem ser tendenciosas pela população de astrocícitos direcionada pelo promotor específico⁸. A microscopia de elétron da seção de série foi usada para revelar um retrato detalhado das interações de processos do astrocyte com sinapses. Devido aos milhares de processos de astrocyte em contato com sinapses, atualmente não é possível reconstruir uma célula inteira com essa técnica⁹, embora isso seja esperado para mudar com o uso de abordagens de aprendizado de máquina para análise de dados.

Neste relato, focamos em um procedimento para caracterizar astrócitos de camundongo usando iontoforese intracelular com corante amarelo de Lúcifer (LY), usando o radiatum de estrato CA1 como exemplo. O método é baseado no trabalho pioneiro passado por Eric Bushong e Mark Ellisman^10,11. Os astrocytes de fatias levemente fixas do cérebro são identificados por sua forma distintiva do soma e enchido com o LY. As células são então imaged com microscopia confocal. Nós demonstramos como a iontoforese de ly pode ser usada para reconstruir astrócitos individuais e para executar análises morfológicas detalhadas de seus processos e território. Também, este método pode ser aplicado conjuntamente com immunohistochemistry para identificar relações espaciais e interações entre astrócitos e neurônios, outras pilhas glial, e vasculature do cérebro. Consideramos que a iontoforese é uma ferramenta muito adequada para analisar a morfologia em diferentes regiões cerebrais e modelos de camundongo de condições saudáveis ou de doença^7,12,13.

Protocolo

Os experimentos com animais neste estudo foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de pesquisa animal do Chanceler da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Camundongos adultos (6 − 8 semanas de idade) de gênero misto foram utilizados em todos os experimentos.

1. preparação da solução

1. Solução de fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF)
   1. Prepare uma solução ACSF fresca (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mm NaHCO₃, 11 mm D-glucose, 1,25 mm na₂HPO₄e 2 mm CAcl₂) antes de cada experimento. Adicione MgCl₂ e CAcl₂ na etapa final. Dissolva os componentes em água deionizada de alta qualidade.
   2. Incubar a solução de ACSF em 35 ° c em um banho de água e em uma bolha com 95% O₂/5% co₂ para pelo menos 30 minutos antes do experimento.
   3. Adicione 2% de cloridrato de lidocaína para atingir uma concentração final de 0, 2% em ACSF (em 100 mL).
2. Solução fixativa
   1. Use 10% de fosfato de formalina tamponada.
3. Solução de corante LY
   1. Prepare 1,5% LY corante solução dissolvendo LY CH dilithium sal ou LY CH sal dipotássico em 5 mM KCl. Vortex completamente. Um volume de 1 mL é suficiente para vários experimentos.
   2. Centrifugador por 10 min a 16.800 x g. Em seguida, filtre o sobrenadante com um filtro de seringa de 0,2 μm em um novo tubo. As alíquotas podem ser mantidas a 4 ° c por até 3 meses.
      Nota: É fundamental para centrifugar e filtrar a solução corante para evitar a agregação das partículas de corante, que pode entupir o eletrodo.

2. perfusão do rato Transcardial e dissecção cerebral

1. Preparação de equipamentos e mouse para perfusão perfusão
   Nota: C57/BL6 camundongos de qualquer sexo pode ser usado. Tem sido empiricamente observado que para o método para trabalhar de forma confiável, é importante que os camundongos não são mais velhos do que 3 meses (6 − 8 semanas de idade é ideal). O protocolo de perfusão é descrito abaixo. Uma referência adicional é fornecida para mais detalhes¹⁴.
   1. Limpe a tubulação da perfusão com a solução de ACSF para remover todas as bolhas de ar na linha. Configurar ferramentas de cirurgia em ordem de uso (pinças, curvas, tesoura sem corte, tesouras da íris).
   2. Anestesie profundamente o rato colocando-o em uma câmara da indução do isoflurano, após ter adicionado 2 − 3 ml do isoflurano à câmara. Permita 1 − 2 minutos para que o anestésico tome o efeito. Assegure-se de que a respiração não pare.
   3. Teste para o reflexo da pitada do dedo do pé. Proceder quando o mouse não responde ao estímulo da dor e o reflexo está ausente. Fixe o animal na posição supina com a cabeça colocada no cone respiratório com um suprimento de isoflurano a 5% em oxigênio e os membros e a cauda gravados dentro de uma capa de fumaça química.
2. Perfusão transcardial
   1. Usando pinças, levante a pele abaixo da caixa torácica. Faça uma incisão de 5 − 6 cm com a tesoura curvada, sem corte através da pele para expor a cavidade abdominal. Corte para cima através da parede abdominal até que o fígado e o diafragma estejam visíveis.
   2. Mova suavemente o fígado para longe do diagrama. Com tesouras da íris, faça uma incisão lateral de 3 − 4 cm no diafragma.
   3. Cortar através da caixa torácica ao longo dos dois lados do corpo para expor a cavidade torácica. Tenha cuidado para não danificar o coração e evitar os pulmões. Levante o esterno para expor o coração.
   4. Uma vez que o coração é visível, injete 0, 5 mL de solução de sódio de heparina (1.000 USP por mL) no ventrículo esquerdo como um anticoagulante. Em seguida, insira a agulha de perfusão cuidadosamente no ventrículo esquerdo. Certifique-se de que a agulha permaneça no ventrículo e não perfure através de outras câmaras cardíacas. Faça uma pequena incisão no átrio direito com tesouras de íris.
   5. Perfuse com solução de ACSF em uma taxa de aproximadamente 10 mL/min até que o líquido existente o corpo esteja cancelado do sangue (1 − 2 minutos).
   6. Mude da solução de ACSF à solução fixador sem introduzir nenhumas bolhas de ar. Perfuse com solução fixativa por 10 min a 10 − 20 mL/min.
      Atenção: Tome cuidado para que nenhuma solução fixativa esteja drenando do nariz. Isso indica que a agulha atingiu o ventrículo direito e o fixador está viajando para os pulmões, em vez de através do circuito sistêmico para o resto do corpo.
3. Dissecção do cérebro
   1. Retire a cabeça do rato com uma tesoura e cuidadosamente dissecar o cérebro do rato do crânio. Coloc na solução fixador para 1,5 h na temperatura ambiente para um período curto da borne-fixação.
      Nota: Uma boa perfusão é necessária para A iontoforese bem sucedida de LY. O cérebro deve ser de cor branca e ausente de sangue na vasculatura cerebral. Corpo e membros devem aparecer duros.

3. preparação da fatia

1. Preparação de fatias do hippocampal
   1. Lave o cérebro com 0,1 M de fosfato salina tamponada (PBS) à temperatura ambiente por 5 min. Em seguida, seque o cérebro com papel de filtro e retire o bulbo olfatório e cerebelo com uma lâmina afiada.
   2. Monte o cérebro na bandeja do usando cola de cianoacrilato e encha a bandeja com PBS à temperatura ambiente. Corte as secções coronais hipocampais de 110 μm de espessura.
      Nota: Ajuste o ajuste do do para certificar-se de que as fatias têm a mesma espessura e mesmo superfície. Para este experimento, utilizou-se um ajuste de velocidade de 4,5 e um ajuste de frequência de 8, que são configurações arbitrárias no instrumento (tabela de materiais). Os usuários podem precisar experimentar as configurações em outros dispositivos.
   3. Colete as seções da bandeja e coloque em um prato de PBS no gelo.

4. preparação do eletrodo

1. Prepare um eletrodo afiado com resistência adequada.
   1. Use um vidro de borosilicato único eletrodo de barril com filamento (O.D. 1,0 mm, identificação 0,58 mm). Puxe um eletrodo em um extrator de micropipeta (tabela de materiais). Os eletrodos ideais preenchidos com 1,5% LY em KCl de 5 mM devem ter uma resistência de 200 MΩ quando colocados em um banho de PBS.
      Nota: O ajuste do extrator varia dependendo do aparelho (tipo de máquina usada e filamento do extrator). Um ajuste mais elevado do calor dá geralmente umas pontas mais longas e mais finas. Para o extrator de micropipeta usado neste experimento, as configurações foram: calor: 317, puxar: 90, velocidade: 70, e atraso: 70. Utilizou-se um filamento tipo calha.
   2. Armazene os eletrodos em um recipiente fechado para evitar que a poeira entre na ponta. Mantenha os eletrodos elevados da parte inferior da caixa para evitar que a ponta se quebra.
2. Encha o eletrodo com a solução de corante LY.
   1. Coloque um eletrodo na posição vertical com a ponta virada para baixo. Pipete 1 − 2 μL de solução LY na parte de trás do eléctrodo e aguarde 5 − 10 min para que a solução se desloque para a ponta através de uma acção capilar.
   2. Fixe delicadamente o elétrodo enchido no suporte do elétrodo conectado a um manipulador.
      Nota: O fio de prata do suporte do elétrodo precisa de estar no contato com o LY dentro do elétrodo. Ajuste o volume da solução LY, se necessário, dependendo do comprimento do fio.

5. enchimento de astrócitos com iontoforese

1. Teste o eletrodo.
   1. Coloc uma fatia do cérebro delicadamente em um prato inferior de vidro enchido com o PBS de 0,1 M na temperatura ambiente. Segure a fatia no lugar com uma harpa de platina com cordas de nylon.
   2. Assegure-se de que o elétrodo esteja conectado a uma fonte da tensão e coloc o elétrodo à terra no banho que contem a fatia do cérebro.
   3. Mova o objetivo para a região cerebral de interesse.
   4. Abaixe o eletrodo na solução. o campo brilhante, movê-lo para o centro do campo de visão e examiná-lo cuidadosamente com a lente de imersão 40x água para garantir que ele parece claro e sem detritos ou bolhas. Se houver algo entupimento da ponta do eletrodo, substitua-o por um novo.
      Nota: Entupimento é uma preocupação para o 200 MΩ eletrodo. Com a centrifugação e filtração da solução corante antes de cada experimento, este não deve ser um problema frequente. Entretanto, porque a ponta do elétrodo é pequena, o tecido pode às vezes ficar furado na abertura. Os autores não encontraram uma maneira de evitar isso, mas pode ser facilmente tratada por simplesmente usando um novo eletrodo.
   5. Observe a ponta do eletrodo o microscópio de varredura de laser confocal com o laser de 488 nm. Então, teste a ejeção da tintura girando sobre o estimulador em 12 V. Anote uma grande nuvem fluorescente da tintura em torno da ponta do elétrodo quando o estimulador estiver sobre. Se nenhum ou pouco corante é ejetado em cima da estimulação da tensão, substitua o elétrodo.
   6. o campo luminoso, abaixe lentamente o eletrodo em direção à fatia parando logo acima da superfície.
2. Encha o astrocyte com iontoforese.
   1. Identifique os astrócitos 40 − 50 μm abaixo da superfície da fatia com o contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC). Procure células com SOMATA alongada, oval em forma de cerca de 10 μm de diâmetro. Uma vez que um astrocyte é escolhido, movê-lo para o centro do campo de visão.
      Nota: Uma boa célula para iontoforese tem bordas claras e definidas em torno dele. Não escolha células muito próximas à superfície da fatia porque elas não podem ser completamente preenchidas. Toma alguma prática sobre alguns dias para poder identificar rotineiramente astrócitos para o enchimento da tintura. Dependendo da área cerebral usada para o experimento, o número de astrócitos pode variar. Isto pode afetar o tempo necessário para identificar um astrocyte antes de encher.
   2. Abaixe lentamente a ponta do elétrodo na fatia, navegando através do tecido, até que esteja no mesmo plano que o corpo da pilha.
      Nota: Mova o eletrodo lentamente para evitar danificar o tecido.
   3. Uma vez que o corpo da célula do astrocyte é claramente visível e delineado, lentamente e gentilmente avançar o eletrodo para a frente. Mova o elétrodo até que a ponta empales o soma da pilha. Mova o foco do objetivo lentamente para cima e para baixo para notar se o eletrodo está dentro do soma.
      Nota: A ponta do eletrodo deve estar dentro do corpo da célula, e um pequeno recuo no soma deve ser observado. Não mova o elétrodo mais adicional para evitar a ponta que atravessa a pilha.
   4. Uma vez que a ponta do elétrodo está dentro da pilha, gire sobre o estimulador em ~ 0.5 − 1 V e ejetar continuamente a corrente na pilha. Usando o microscópio confocal, observe o preenchimento da célula. Aumente o zoom digital para ver os detalhes da célula e certifique-se de que a ponta do eletrodo é visível dentro da célula.
      Nota: Abaixe a tensão se parece que o corante está vazando para fora da célula ou enchendo outras células na vizinhança. Se parece que a tintura ainda está vazando para fora da célula, puxe o eletrodo para fora lentamente e encontrar outra célula. É importante que o corante não vaze para ter uma alta relação sinal/fundo na imagem final.
   5. Aguarde cerca de 15 min até que as ramificações e os processos mais finos apareçam definidos, desligue a voltagem e retire suavemente a ponta do eletrodo da célula.
3. Imagem da célula preenchida.
   Nota: a imagem latente pode ser executada imediatamente depois de encher ou de seguir manchar com immunohistochemistry. Um objetivo com maior abertura numérica (NA) resulta em melhor resolução.
   1. Aguarde até que a célula retorne ao formulário original antes da imagem (15 − 20 min) com o objetivo de 40x. Para fazer a imagem da célula, ajuste a configuração no confocal para certificar-se de que as ramificações e os processos mais finos apareçam definidos.
   2. Configure uma pilha z com um tamanho de passo de 0,3 μm. Quando a imagem latente, mova o objetivo até que não haja nenhum sinal da pilha e o ajuste que como a parte superior. Então, mova o objetivo para baixo (focalizando através da pilha) até que não haja nenhum sinal, ajuste isso como a parte inferior.
   3. Depois que a imagem latente é completa, verific o elétrodo para a ejeção da tintura. Se uma grande nuvem de corante aparecer, ela pode ser usada para a próxima fatia. Caso contrário, substitua-o por um novo eletrodo.
      Nota: O enchimento da tintura de um único astrocyte e de imagem toma aproximadamente 45 minutos a 1 h. Para este experimento específico, foi possível obter cerca de 3 − 6 células por mouse. Se necessário, várias células podem ser rotuladas na mesma fatia. No entanto, para distinguir astrócitos individuais, certifique-se de manter uma distância de cerca de 200 μm entre as células.

6. coloração com immunohistochemistry (opcional)

1. Uma vez que a imagem é feita, imediatamente coloque a fatia em formalina 10% no gelo para preservar para immunohistochemistry. Mantenha as fatias cerebrais no escuro e armazene durante a noite a 4 ° c.
2. Lave as secções do cérebro 3x em 0,1 M PBS com 0,5% de surfactante não iônico (i.e., Triton X 100) durante 5 min cada. Em seguida, incubar em uma solução de bloqueio de 0,1 M PBS com 0,5% surfactante não iônico e 10% de soro de cabra normal (NGS) por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave.
3. Incubar as seções com agitação em anticorpos primários diluídos em PBS 0,1 M com surfactante 0,5% não iônico e 5% NGS por 2 dias a 4 ° c.
   Nota: Por causa da espessura das fatias do cérebro, o período de incubação dos anticorpos preliminares precisa de ser prolongado para a melhor penetração e a concentração do anticorpo pode ser aumentada. Neste experimento, foi utilizada uma diluição de 1:500 para o anticorpo anti GFAP e foi utilizada uma diluição de 1:500 para o anticorpo anti aquaporina-4.
4. Lave as secções 3x em 0,1 M PBS com 0,5% de surfactante não iônico durante 10 min cada e, em seguida, incubar com anticorpos secundários diluídos em 0,1 M PBS com um surfactante não iônico de 0,5% e 10% de NGS para 6 h à temperatura ambiente.
   Nota: Não escolha um anticorpo secundário excitado por 488 nm, que é o comprimento de onda usado para visualizar o corante LY. Neste experimento, foi utilizada uma diluição de 1:1000 para Alexa fluor 546 goat anti-frango IgG (H + L) e Alexa fluor 647 goat anti-Rabbit IgG (H + L).
5. Enxague as secções 3x em 0,1 M PBS durante 10 min cada. Em seguida, monte as secções em lâminas de microscópio de vidro em suportes de montagem adequados para fluorescência. Slides de vedação. Células de imagem em um tamanho de etapa de 0,3 μm.

Resultados

Os dados relatados neste estudo são de 7 − 12 células de 4 camundongos em cada experimento. Os dados médios são relatados nos painéis de figura, quando apropriado.

Para avaliar a morfologia do astrocite, realizou-se iontoforese intracelular com corante LY para preenchimento de astrócitos no estrato de CA1 radiatum, que está resumido na Figura 1. A Figura 2 retrata um astrocite representativo e sua elaborada estrutura morfológica. A célu...

Discussão

O método esboçado neste papel descreve uma maneira de visualizar a morfologia do astrocyte usando o iontoforese intracelular do corante de ly em fatias levemente fixas do cérebro. Existem vários fatores críticos destacados neste protocolo que contribuem para a bem sucedida iontoforese e reconstrução morfológica das células. Um fator é a qualidade e reprodutibilidade das imagens, que é determinada em grande parte pela idade do rato e o resultado da perfusão. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57/BL6N ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher	SF 100-20	An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall	4692	An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody	Novus Biologicals	NBP1-87679	A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody	Abcam	ab4674	A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac mice	Taconic Stock	B6	A similar alternative can be used
Calcium Chloride	Sigma	21108	An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	A similar alternative can be used
D-glucose	Sigma	G7528	An identical alternative can be used
Disodium Phosphate	Sigma	255793	An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97	Sutter	P-97	A similar alternative can be used
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		A similar alternative can be used
Isofluorane	Henry Schein Animal Health	29404	An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%)	Clipper	1050035	An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt	Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass	Thermo Scientific	24X60-1	An identical alternative can be used
Microscope Slides	Fisher	12-544-2	An identical alternative can be used
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	An identical alternative can be used
Objective lens (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	A similar alternative can be used
Objective lens (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL	VWR	VWRVE404	An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	A similar alternative can be used
Potassium Chloride	Sigma	P3911	An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	An identical alternative can be used
Sodium Chloride	Sigma	S5886	An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010	World precision instruments	Omnical 2010	A similar alternative can be used
Triton X 100	Sigma	T8787	An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000	Pelco	100-S	A similar alternative can be used