Generación de organoides testiculares porcinos con arquitectura específica de Testis utilizando Microwell Culture

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la generación reproducible de organoides testiculares porcinos con arquitectura de tejido específica testis utilizando el sistema de cultivo de micropozos disponible comercialmente.

Resumen

Los organoides son estructuras tridimensionales compuestas por múltiples tipos de células que son capaces de recapitular la arquitectura tisular y las funciones de los órganos in vivo. La formación de organoides ha abierto diferentes vías de investigación básica y traslacional. En los últimos años, los organoides testiculares han despertado interés en el campo de la biología reproductiva masculina. Los organoides testiculares permiten el estudio de las interacciones celulares, el desarrollo de tejidos y el microambiente de nicho de células germinales y facilitan el cribado de toxicidad y fármacos de alto rendimiento. Se necesita un método para generar de forma fiable y reproducible organoides testiculares con una arquitectura de tejido específica para testículos. El sistema de cultivo de micropozos contiene una densa gama de micropozos en forma de pirámide. Las células testiculares derivadas de testículos prepúberes se centrifugan en estos micropozos y se cultivan para generar organoides testiculares con arquitectura de tejido específica de testículos y asociaciones celulares. Miles de organoides homogéneos se pueden generar a través de este proceso. El protocolo aquí reportado será de amplio interés para los investigadores que estudian la reproducción masculina.

Introducción

En los últimos años, ha habido un resurgimiento del interés en los organoides tridimensionales (3D). Diferentes órganos como intestino¹, estómago², páncreas^3,4, hígado⁵, y cerebro⁶ se han derivado con éxito en sistemas de organoides 3D. Estos organoides tienen similitudes arquitectónicas y funcionales con los órganos in vivo y son más relevantes biológicamente para el estudio del microambiente tisular que los sistemas de cultivo monocapa^7. Como resultado, los organoides testiculares han comenzado a interesar se además^{de8,9,10,11,12}. La mayoría de los métodos reportados hasta ahora son complejos, no altos rendimiento¹⁰ y requieren la adición de proteínas ECM^8,10. Esta complejidad también conduce a problemas de reproducibilidad. Se necesita un método sencillo y reproducible que permita la generación de organoides testiculares con asociaciones celulares que son como testículos in vivo.

Recientemente hemos informado de un sistema para abordar estos requisitos¹². Utilizando el cerdo como modelo, empleamos un enfoque centrífugo de agregación forzada en el sistema de micropocillos. En el sistema de micropozos, cada pozo contiene un gran número de micropozos más pequeños idénticos^13. Esto permite la generación de numerosos esferoides de tamaño uniforme. El sistema de microrwell permitió la generación de un gran número de organoides uniformes con una arquitectura específica de testis. El sistema es simple y no requiere la adición de proteínas ECM.

Protocolo

NOTA: Los testículos de lechones de 1 semana de edad se obtuvieron de una granja comercial de cerdos como subproducto de la castración de cerdos comerciales. El abastecimiento de testículos fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Calgary.

1. Preparación de soluciones enzimáticas para la digestión de los tejidos

NOTA: Se necesitan tres soluciones enzimáticas diferentes, que incluyen dos soluciones diferentes de colagenasa IV (solución A, B) y una solución de desoxirribonucleasa I (DNase I).

1. Para preparar la solución A, disolver 20 mg de colagenasa IV S(Tabla de Materiales)y 40 mg de colagenasa IV W(Tabla de Materiales)en 25 ml de medio de águila modificado (DMEM) de alta glucosa. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m. Añadir 0,4 ml de suero bovino fetal (FBS) a la solución A para inhibir la actividad de la trippsina.
2. Para preparar la solución B, disolver 80 mg de colagenasa IV W(Tabla de Materiales)en 40 ml de DMEM. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m.
3. Para preparar la solución de DNase I (7 mg/ml), disolver 70 mg de DNase I en 10 ml de DMEM. A continuación, filtre el esterilizado con un filtro de 0,22 m.
   NOTA: La concentración enzimática de las soluciones de colagenasa IV descritas aquí, varía de las concentraciones (2 mg/ml) indicadas en el artículo¹⁴original. El protocolo actual produce celdas con una viabilidad ligeramente mayor. Sin embargo, las células aisladas por ambos protocolos producen organoides con una arquitectura de tejido idéntica.

2. Digestión enzimática del tejido Testis

1. Recoger los testículos en un vaso de precipitados estériles y lavar con solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenga 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Después del lavado, transfiera los testículos a un plato de cultivo de tejido de 100 mm con PBS que contenga 1% de P/S y retire la tunica vaginal y el epidídilo usando tijeras y fórceps autoclavedos. Transfiera los testículos aislados a un nuevo plato de 100 mm y lávelos bien con PBS que contenga 1% P/S.
2. Para mantener la esterilidad, utilice otro conjunto de tijeras estériles y fórceps para pelar el parénquima testicular de la tunica albuginea. Corte los testículos a lo largo del eje longitudinal directamente debajo de la túnica. A continuación, pelar los testículos de la túnica usando dos fórceps y colocar en un nuevo plato de 100 mm que contenga 1 mL DMEM con 1% P/S.
3. Picar los testículos pelados con tijeras estériles en trozos de tejido de 1-2 mm. Después de cortar, utilice fórceps estériles para eliminar fragmentos blancos de tejido conectivo.
4. Transferir las piezas de tejido picado en la solución A y rematar hasta 50 ml con DMEM para obtener una concentración de 0,4 mg/ml para la colagenasa IV S(Tabla de materiales)y una concentración de 0,8 mg/ml para la colagenasa IV W(Tabla de materiales). Colocar la solución A que contiene las piezas de tejido en un baño de agua de 37 oC durante 30 minutos, invertir suavemente los tubos cada 5 minutos y comprobar visualmente la liberación de ADN.
   1. Añadir 500 l de DNase I si se observa ADN flotante libre. Después de 30 min, centrifugar el tubo a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min y desechar el sobrenadante.
      NOTA: El ADN aparecería como una sustancia turbia. Cuando los tubos se agitan, las piezas de tejido se asientan mientras que el ADN se mantendría a flote.
5. Añadir la solución B al tubo y recargar hasta 50 ml con DMEM para obtener una concentración de 1,2 mg/ml de colagenasa IV W(Tabla de materiales). Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 30 minutos e invertir suavemente el tubo cada 5 min. Añadir 500 l de DNase I si se observa ADN flotante libre.
6. Después de 30 min, centrifugar el tubo a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min. Después de eso desechar el sobrenadante y lavar una vez con PBS con 1% P/S.
   NOTA: Los sobrenatantes desechados de la solución A y B contendrán principalmente células intersticiales.
7. Recargar el tubo con PBS hasta 50 mL. Recoja cuidadosamente los túbulos de la parte superior y colóquelos en un nuevo tubo de 50 ml.
   NOTA: Los grandes fragmentos de tejido no digeridos se asientan rápidamente en la parte inferior, mientras que los túbulos seminiferosos digeridos permanecerán en suspensión. No se deben recolectar fragmentos grandes de tejido. Este procedimiento se puede repetir varias veces hasta que la solución en el tubo original esté casi clara y solo queden fragmentos de tejido no digeridos, que se pueden eliminar.
8. Centrifugar los túbulos a 90 x g con frenos a 25oC durante 1,5 min y desechar el sobrenadante. Agregue PBS fresco y centrífuga de nuevo. Repita este paso de lavado dos veces.
9. Después del último lavado de PBS, retire el sobrenadante y resuspenda los túbulos seminiferosos en 5 ml de PBS. A continuación, añadir 15 ml de 0,25% de ácido trypsin-etilendiaminetetraacético (EDTA) a los túbulos. Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC e invertir suavemente cada 2 minutos. Si se observa una gran cantidad de ADN flotante, añadir 500 l de DNase I con 5 ml de DMEM.
10. Evaluar la digestión enzimática de los túbulos a células individuales bajo el microscopio (primero después de 5 min, luego cada 2 min). Si se pueden detectar principalmente células individuales, detenga la reacción con 5 ml de FBS y filtre a través de una malla de 70 m y luego a través de una malla de 40 m.
    NOTA: Se debe tener cuidado de que las tapas de los tubos de 50 ml utilizados para las digestiones (Solución A, B y 0,25% de trippsina-EDTA) estén apretadas correctamente. Si la contaminación en el baño de agua es una preocupación, la película de parafina puede estar envuelta alrededor de la tapa para asegurar la esterilidad.
11. Centrifugar las células individuales a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min, resuspender en el medio de enriquecimiento (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) que contiene 5% FBS y 1% P/S) y contar el número de células viables. Esta es la población de células partidas. Arreglar 100 x 10³ células y realizar inmunocitoquímica para el marcador de células germinales UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) como se describe¹² y determinar el porcentaje de células germinales en esta población de células iniciales.
    NOTA: Marcador de células germinales Leucemia promielocítica proteína de dedo de zinc (PLZF)¹⁵ también podría utilizarse como una alternativa adecuada para UCHL1. En la población celular inicial, el rendimiento celular esperado es de alrededor de 700-800 x 10⁹/g de tejido. El porcentaje de células germinales en esta población celular debe ser de 4-5%.
12. Colocar alrededor de 20 x 10⁶ de esta población de células de partida en dos platos Petri de 100 mm de unión ultrabaja (10 x 10⁶ células suspendidas en 10 ml de DMEM/F12 que contienen 1% P/S en cada plato) durante 2 días en una incubadora de cultivo de tejido (37 oC , 5% CO₂, 21% oxígeno). Realice el enriquecimiento de células germinales con las células restantes.
    NOTA: Para garantizar una visibilidad óptima y la calidad celular, mientras que el enriquecimiento de células germinales y la cuantificación posterior se lleva a cabo, la población de células de partida se coloca en cultivo en platos de cultivo de tejido de unión ultrabaja durante 2 días.

3. Enriquecimiento de células germinales

NOTA: El procedimiento descrito anteriormente produce principalmente células Sertoli y células germinales. Diferentes propiedades de adhesión permiten la separación de células Sertoli y células germinales a través de chapado diferencial.

1. Semilla 20-25 x 10⁶ células de la población celular inicial por plato de cultivo de tejido de 100 mm en un volumen total de 8 ml de medio de enriquecimiento (DMEM/F12 con 5% FBS y 1% P/S) para chapado diferencial. Coloque las células en una incubadora (37 oC, 5% CO_2,21% O₂) y después de 1,5 h, asegúrese de que la mayoría de las células Sertoli se adhieren a la placa.
2. Recoger y combinar el sobrenadante (principalmente que contiene células germinales) de 2 placas a una placa nueva de 100 mm y colocarlo de nuevo en la incubadora. Después de 1 h, vuelva a combinar el sobrenadante de 2 placas con una nueva placa de 100 mm. Vuelva a colocar las placas en la incubadora durante la noche.
   NOTA: Los sobrenadores combinados contendrán principalmente células germinales. Las células adheridas que se desechan junto con las placas son principalmente células somáticas testiculares como Sertoli y células mioides peritubulares.
3. Recoja las células germinales enriquecidas en dos fracciones de la siguiente manera.
   NOTA: Las células germinales enriquecidas se adhieren de manera diferente, fracción no adherente y fracción ligeramente adherida. Ambas fracciones juntas forman la población de células germinales enriquecida
   1. Fracción no adherente: recoger el sobrenadante.
   2. Fracción ligeramente adherente: lavar las placas suavemente con PBS, tratar con 2 ml de dilución de 1:20 de trippsina-EDTA durante 5 min a temperatura ambiente, detener la reacción con 2 ml de medio de enriquecimiento y recoger en el mismo tubo que la fracción no adherente.
      NOTA: 0.25% Trippsin-EDTA necesita ser diluido con PBS para producir una solución de 1:20 trippsina.
4. Cuente el número total de células usando un contador celular, fije 100 x 10³ células y realice inmunocitoquímica para el marcador de células germinales UCHL1 como se describe¹² y determine el porcentaje de células germinales en esta población celular enriquecida.
   NOTA: El porcentaje de células germinales en esta población celular debe ser de al menos 60-70%. Dado que la inmunocitoquímica para la cuantificación requeriría 1 día, las células enriquecidas deben colocarse en una placa Petri de 100 mm de unión ultrabaja con DMEM/F12 suplementada con 1% de P/S durante la duración para garantizar una calidad y viabilidad celular óptimas.

4. Preparación de células para la sembración

1. Para cosechar la preparación de la célula de inicio, recoja el sobrenadante en un tubo de 50 ml de los platos de 100 mm de fijación ultra baja. Lave las placas vigorosamente con PBS para recoger las células adheridas. No se necesita digestión enzimática.
   NOTA: Algunas de las células testiculares, principalmente las células Sertoli, pueden adherirse ligeramente a las placas de unión ultra baja.
2. Combine la preparación de células iniciales y las células germinales enriquecidas para obtener una preparación de células de trabajo que contenga un 25% de células germinales. Centrífuga a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en el medio de formación de organoides (DMEM/F12 suplementada con insulina de 10 g/ml, transferrina 5,5 g/ml, selenio 6,7 ng/ml, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/ml, 20 ng/ml , 1% P/S). Ajuste la densidad de celda a 2,4 x 10⁶ por ml.
   NOTA: Cada pocato de las placas de micropocillos utilizados¹³ en este protocolo contenía 1.200 micropocillos.
3. Utilice la fórmula siguiente para calcular el número de celdas por pozo como se describe a continuación.
   Número de células por pozo- número de micropozos x número de células a agrupar para cada organoide.
4. Para generar organoides a partir de 1.000 células cada una, se sube cada una con (1.200 x 1.000 células cada una) 1,2 x 10⁶ células. Ajuste la densidad celular en la suspensión celular de manera que las células se sembran en un volumen de 0,5 ml de medio. Para organoides formados a partir de 1.000 células cada una, utilice una densidad de 2,4 x 10⁶ células por ml (1,2 x 10⁶ células en 0,5 ml).

5. Preparación de micropozos para recibir células

NOTA: Para asegurarse de que las células no se adhieren a la superficie del micropozo, tratar con una solución de unión surfactante que está disponible para la compra por el fabricante.

1. Añadir 0,5 ml de solución de enrlado a cada poca. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas en el pozo. Para eliminar las burbujas de aire, si las hay, centrifugar la placa a 2.000 x g con frenos a 25oC durante 2 min.
2. Observe la placa bajo un microscopio invertido de bajo aumento, para verificar que las burbujas se han eliminado de los micropocillos. Si se observan burbujas atrapadas, vuelva a centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25 oC durante 2 min para eliminar las burbujas restantes.
3. Cubra la placa con la tapa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizado el tratamiento, retire la solución de enjuague y lave inmediatamente la placa con agua estéril o PBS. Asegúrese de que la placa no se seque después del tratamiento con la solución de acuñación.

6. Generación de organoides testiculares

1. Añadir 0,5 ml de medio de formación de organoides (sin células) a cada pocal y centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25oC durante 2 min para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Observe el pozo bajo un microscopio invertido de baja magnificación para verificar que las burbujas de aire se han eliminado. Si se observan burbujas atrapadas, vuelva a centrifugar a 2.000 x g con frenos a 25 oC durante 2 min para eliminar las burbujas restantes.
2. Agregue 0,5 ml de la suspensión de la celda de trabajo y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Centrífuga a 500 x g con frenos a 25oC durante 5 min. Utilice un microscopio invertido para verificar que las células se han agrupado dentro de los microrpozos.
3. Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular y al cultivo durante 5 días. Cambia la mitad del medio cada dos días.
   1. Para cambiar el medio sin perder ningún organoide, toque la punta de la pipeta a la pared del pozo y baje suavemente para tocar el menisco y dibujar lentamente el medio. Asegúrese de seguir el menisco a medida que cae. Para añadir un medio fresco, toque la punta de la pipeta a la pared del pozo en el mismo lado que la retirada media y agregue el medio fresco suavemente contra la pared del pozo, lo que le permite fluir lentamente por la pared.
4. Para recuperar los organoides, pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de boca ancha. Esto permitiría que los organoides salieran de los micropozos.
5. Recoger los organoides, lavar con PBS, fijar y realizar inmunocitoquímica para marcador de células germinales (UCH-L1), marcador de células Sertoli (PROTEÍNA de unión DE GATA 4-GATA4), marcador de células mioides peritubulares (-Smooth Muscle Actin-SMA) y marcador celular de Leydig (Citocromo) P450-CYP450) como se describe¹² y visualizar bajo un microscopio confocal.

Resultados

Células aisladas de testículos porcinos de 1 semana de edad que se cultivaron en los micropozos autoorganizados en esferoides(Figura 1A, Figura 2), con compartimentos exteriores delineados y distintos (epitelio seminúfero) e interiores ( intersticio)(Figura 1B, Figura 2). Los dos compartimentos estaban separados por una membrana de s?...

Discusión

Hemos establecido un método sencillo que permite la generación consistente y repetible de grandes cantidades de organoides testiculares con arquitectura tisular que es similar a testis in vivo^12. Mientras que el enfoque se desarrolló utilizando células testis porcinas, es más ampliamente aplicable también al ratón, primate no humano y testículo s-humano¹². Se han notificado varios métodos diferentes para producir organoides testiculares⁸

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049