Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi

Özet

Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.

Özet

Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.

Giriş

Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar¹, mide², pankreas^3,4, karaciğer⁵, ve beyin⁶ başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültür^sistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır^8,9,10,11,12. Şimdiye kadar bildirilen yöntemlerin çoğunluğu karmaşık, non-yüksek iş¹⁰ ve ECM proteinleri⁸,¹⁰eklenmesini gerektirir. Bu karmaşıklık aynı zamanda tekrarlanabilirlik ile ilgili sorunlara yol açar. Testis in vivo gibi hücre çağrışımları olan testis organoidlerinin oluşumuna olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir.

Biz son zamanlarda bu gereksinimleri¹²adresine bir sistem bildirdiniz. Domuzu model olarak kullanarak microwell sisteminde santrifüj zorunlu toplama yaklaşımını kullandık. Microwell sisteminde, her kuyu aynı küçük microwells¹³çok sayıda içerir. Bu üniforma boyutu çok sayıda küresel nesil sağlar. Microwell sistemi, testislere özgü bir mimariye sahip çok sayıda tek tip organoidin üretilebini sağladı. Sistem basittir ve ECM proteinlerinin eklenmesini gerektirmez.

Protokol

NOT: 1 haftalık domuz yavrularından alınan testisler, ticari domuzların hadım edilmesinden elde edilen yan ürün olarak ticari bir domuz çiftliğinden elde edilebildi. Testislerin kaynak Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Doku sindirimi için enzim çözeltilerinin hazırlanması

NOT: İki farklı kollajenaz IV çözeltisi (A, B çözeltisi) ve deoksiribonükle I (DNase I) çözeltisi içeren üç farklı enzimatik çözüm gereklidir.

1. A çözeltisi hazırlamak için, 20 mg kollajenaz IV S(Malzeme Tablosu)ve 40 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)25 mL yüksek glikozLu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) olarak çözünür. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre. Trypsin aktivitesini inhibe etmek için A solüsyonuna 0,4 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.
2. B çözeltisini hazırlamak için, DMEM'in 40 mL'sinde 80 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre.
3. DNase I çözeltisi (7 mg/mL) hazırlamak için, 70 mg DNase I'i 10 mL DMEM'de çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre.
   NOT: Burada özetlenen kollajenaz IV çözeltilerinin enzim konsantrasyonu, orijinal madde^14'tebelirtilen konsantrasyonlara (2 mg/mL) göre değişir. Geçerli protokol, biraz daha yüksek canlılığa sahip hücreler verir. Ancak, her iki protokol tarafından izole hücreler aynı doku mimarisi ile organoidler üretirler.

2. Testis doku enzimatik sindirim

1. Testisleri steril bir kabın içine toplayın ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testisleri %1 P/S içeren PBS içeren 100 mm'lik doku kültür kabına aktarın ve otoklavlı makas ve forseps kullanarak tunica vaginalis ve epididimleri çıkarın. İzole testislerini yeni bir 100 mm'lik tabağa aktarın ve %1 P/S içeren PBS ile iyice yıkayın.
2. Kısırlığı korumak için, tunica albuginea testis parenkim soymak için steril makas ve forseps başka bir dizi kullanın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testisler kesin. Daha sonra iki forsep sinerek testisleri tunicadan soyun ve %1 P/S ile 1 mL DMEM içeren 100 mm'lik yeni bir tabağa yerleştirin.
3. 1-2 mm doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testisler kıyma. Doğrama sonra, bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.
4. Kolajenaz IV S(Malzeme Tablosu)için 0,4 mg/mL konsantrasyon ve kollajenaz IV W (Malzeme Tablosu)için 0,8 mg/mL konsantrasyon elde etmek için kıymalı doku parçalarını A solüsyonuna aktarın ve DMEM ile 50 mL'ye kadar yükseltin. ÇözeltiSi Doku parçalarını içeren 37 °C'lik su banyosuna 30 dakika yerleştirin, tüpleri her 5 dakikada bir hafifçe ters çevirin ve DNA salınımını görsel olarak kontrol edin.
   1. Serbest yüzen DNA gözlenirse 500 μL DNase I ekleyin. 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk frenle santrifüj edin ve süpernatantatın.
      NOT: DNA bulutlu bir madde olarak görünür. Tüpler sarsıldığında doku parçaları durulunca DNA su üstünde kalır.
5. 1.2 mg/mL kollajenaz IV W konsantrasyonu elde etmek için tüpe B çözeltisi ekleyin ve DMEM ile 50 mL'ye kadar kontör ekleyin (Malzeme Tablosu). Tüpü 30 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir tüpü hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA gözlemlenirse 500 μL DNase I ekleyin.
6. 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk santrifüj edin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 P / S ile PBS ile bir kez yıkayın.
   NOT: Hem A hem de B çözeltisinden atılan süpernatantlar öncelikle interstisyel hücreler içerir.
7. 50 mL'ye kadar PBS ile tüpü toplayın. Tübülleri üstten dikkatlice toplayın ve yeni bir 50 mL tüpe yerleştirin.
   NOT: Sindirilmemiş büyük doku parçaları hızla alt yerleşmek, sindirilmiş seminiferous tübüller süspansiyon kalır. Büyük doku parçaları toplanmamalıdır. Bu işlem, orijinal tüpteki çözelti neredeyse net olana ve sadece sindirilmemiş doku parçaları kalana kadar birkaç kez tekrarlanabilir.
8. 25 °C'de 90 x g'de tübülleri 1,5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantatın. Taze PBS ve santrifüj tekrar ekleyin. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın.
9. Son PBS yıkadıktan sonra, supernatant çıkarın ve PBS 5 mL seminiferous tübüller resuspend. Daha sonra tübüllere %0,25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 15 mL ekleyin. Tüpü 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 2 dakikada bir hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA çok gözlenirse, 5 mL DMEM ile 500 μL DNase I ekleyin.
10. Mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim ini değerlendirin (önce 5 dk sonra, sonra her 2 dakika). Çoğunlukla tek bir hücre tespit edilebiliyorsa, reaksiyonu 5 mL FBS ile durdurun ve 70 m'lik bir kafesten ve ardından 40 μm'lik bir kafesten filtreleyin.
    NOT: Sindirim için kullanılan 50 mL tüplerin kapaklarının (A, B ve %0,25 tripsin-EDTA) düzgün bir şekilde sıkılmasına dikkat edilmelidir. Su banyosunda kontaminasyon bir sorun ise, parafin film sterilite sağlamak için kapak etrafında sarılmış olabilir.
11. 55 °C'de frenli 500 x g'deki tek hücreleri 5 dakika süreyle santrifüj edin, zenginleştirme ortamında (Dulbecco Modifiye Kartal Orta F/12 (DMEM/F12) %5 FBS ve %1 P/S içeren yeniden askıya alın ve canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre popülasyonu. Fix 100 x 10³ hücreleri ve germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya gerçekleştirmek (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) olarak açıklanan¹² ve bu başlangıç hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirlemek.
    NOT: Germ hücre belirteci Promielositik lösemi çinko parmak proteini (PLZF)¹⁵ de UCHL1 için uygun bir alternatif olarak kullanılabilir. Başlangıç hücre popülasyonunda beklenen hücre verimi 700-800 x 10⁹/g civarındadır. Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi %4-5 olmalıdır.
12. Bu başlangıç hücre popülasyonunun yaklaşık 20 x 10^6'sını iki ultra düşük ek 100 mm Petri kapasine (10 x 10⁶ hücre dmem/F12'nin 10 mL'sinde her bir kapta %1 P/S içeren) doku kültürü kuluçka makinesinde 2 gün boyunca (37 °C) yerleştirin , 5% CO_2,21% oksijen). Kalan hücrelerle germ hücre zenginleştirme gerçekleştirin.
    NOT: Optimum canlılık ve hücre kalitesini sağlamak için germ hücre zenginleştirme ve müteakip nicelik gerçekleşirken, başlangıç hücre popülasyonu 2 gün boyunca ultra düşük ek doku kültürü yemeklerinde kültüre yerleştirilir.

3. Germ hücre zenginleştirme

NOT: Yukarıda açıklanan işlem öncelikle Sertoli hücreleri ve mikrop hücrelerini verir. Farklı yapışma özellikleri, Sertoli hücrelerinin ve mikrop hücrelerinin diferansiyel kaplama ile ayrılmasını sağlar.

1. Tohum 20-25 x 10¹⁰ 10 10 00 mm doku kültürü çanak başına başlangıç hücre nüfusunun 6 hücre zenginleştirme orta toplam hacmi (DMEM/ F12 ile% 5 FBS ve% 1 P / S) diferansiyel kaplama için. Hücreleri bir kuvöze yerleştirin (37 °C, %5 CO_2,%21 O₂) ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunun tabağa bağlanmasını sağlayın.
2. 2 plakadan oluşan süpernatant'ı (çoğunlukla mikrop hücreleri içeren) bir 100 mm'lik yeni bir plakayla toplayın ve birleştirin ve kuvöze geri yerleştirin. 1 saat sonra, 2 plakanın supernatantını yeni bir 100 mm plakayla birleştirin. Plakaları bir gece için kuvöze geri yerleştirin.
   NOT: Supernatants kombine öncelikle mikrop hücreleri içerecektir. Plakalar ile birlikte atılır yapışmış hücreler sertoli ve peritubüler miyoid hücreler gibi öncelikle testis somatik hücrelerdir.
3. Aşağıdaki gibi iki kesirler halinde zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak.
   NOT: Zenginleştirilmiş mikrop hücreleri farklı, yapışmaz fraksiyonve hafif yapışmış fraksiyona yapışır. Bu fraksiyonların her ikisi de zenginleştirilmiş germ hücre popülasyonu oluşturur.
   1. Non adherent fraksiyonu: supernatant toplamak.
   2. Hafif yapışma fraksiyonu: PBS ile yavaşça plakaları yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika için % 0,25 tripsin-EDTA% 0,25 seyreltme 2 mL ile tedavi, zenginleştirme orta 2 mL ile reaksiyonu durdurmak ve yapışmaz fraksiyonu olarak aynı tüp içinde toplamak.
      NOT: 0.25% Trypsin-EDTA 1:20 trypsin çözeltisi üretmek için PBS ile seyreltilmiş olması gerekir.
4. Hücre sayacı nı kullanan toplam hücre sayısını sayın, 100 x 10³ hücreyi sabitleyin ve^12'de açıklandığı gibi germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya yapın ve bu zenginleştirilmiş hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
   NOT: Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi en az %60-70 olmalıdır. Sayısallaştırma için immünositokimya 1 gün gerektirdiğinden, zenginleştirilmiş hücreler optimum hücre kalitesi ve canlılığını sağlamak için süre boyunca %1 P/S ile takviye edilmiş DMEM/F12 ile ultra düşük bir eki 100 mm Petri kabına yerleştirilmelidir.

4. Tohumlama için hücrelerin hazırlanması

1. Başlangıç hücresi preparatını hasat etmek için, süpernatantı ultra düşük eki 100 mm'lik tabaklardan 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Yapışan hücreleri toplamak için plakaları PBS ile şiddetle yıkayın. Enzimatik sindirime gerek yoktur.
   NOT: Bazı testis hücreleri, öncelikle Sertoli hücreleri, biraz ultra düşük eki plakaları yapışabilir.
2. Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini birleştirerek %25'lik mikrop hücrelerini içeren çalışan bir hücre preparatını elde edin. 500 x g'de frenli 500 x g 5 dk, süpernatant atın ve organoid oluşum ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (DMEM/F12 insülin 10 μg/mL, transferrin 5.5 μg/mL, selenyum 6.7 ng/mL, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü , %1 P/S). Hücre yoğunluğunu mL başına 2,4 x 10⁶ olarak ayarlayın.
   NOT: Bu^protokolde kullanılan mikrokuyu plakalarda her kuyu1.200 mikrokuyu içeriyordu.
3. Aşağıda açıklandığı gibi başına düşen hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
   Kuyu başına düşen hücre sayısı = her organoid için kümelenecek mikrokuyu sayısı x hücre sayısı.
4. Her biri 1,000 hücreden organoid ler üretmek için her biri 1.200 x 1.000 hücreye sahip tohumlar=) 1.2 x 10⁶ hücre. Hücre süspansiyonundaki hücre yoğunluğunu, hücrelerin 0,5 mL orta hacimde tohumlanmış bir şekilde ayarlayın. Her biri 1.000 hücreden oluşan organoidler için mL başına 2,4 x 10⁶ hücre (0,5 mL'de 1,2 x 10⁶ hücre) yoğunluğu kullanılır.

5. Hücre almak için mikrokuyuların hazırlanması

NOT: Hücrelerin mikrokuyu yüzeyine yapışmadığından emin olmak için, üretici tarafından satın alınabilecek bir yüzey aktif durulama çözeltisi ile tedavi edin.

1. Her kuyuya 0,5 mL durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun. Hava kabarcıklarını temizlemek için, varsa, 25 °C'de 2 5 dakika frenlerle plakayı 2.000 x g'de santrifüj edin.
2. Kabarcıkların mikrokuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için, düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.
3. Kapağı kapağı ile kapak ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Durulama çözeltisi ile tedaviden sonra plakanın kurumaması için.

6. Testis organoidlerinin üretimi

1. Her kuyuya 0,5 mL organoid oluşum ortamı (herhangi bir hücre olmadan) ekleyin ve 2.000 x g'de 25 °C'de frenlerle 2 dk.'lık bir hava baloncuklarını temizleyin. Hava kabarcıklarının kaldırıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında kuyuyu gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.
2. Çalışma hücresi süspansiyonunun 0,5 mL'sini ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. 55 °C'de 500 x g'de 5 dakika frenli santrifüj.
3. Plakayı 5 gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin.
   1. Herhangi bir organoid kaybetmeden orta değiştirmek için, menisküs dokunmak ve yavaş yavaş orta çizmek için yavaşça kuyu nun duvarına pipet ucu dokunun ve düşük. Aşağı düşerken menisküs takip emin olun. Taze ortam eklemek için, boru ucunu kuyunun aynı tarafındaki duvara orta çekme ile aynı tarafta takın ve kuyu duvarına hafifçe taze orta ekleyin ve yavaşça duvardan aşağı akmasını bekleyin.
4. Organoidleri kurtarmak için, geniş bir ağız pipeti kullanarak orta yı hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Bu, organoidlerin mikrokuyulardan çıkmasını sağlar.
5. Organoidleri toplamak, PBS ile yıkamak, germ hücre belirteci (UCH-L1), Sertoli hücre belirteci (GATA Bağlayıcı Protein 4-GATA4), peritübüler miyoid hücre belirteci (α-Smooth Muscle Actin-αSMA) ve Leydig hücre belirteci (Sitokrom) için immünositokimyayı düzeltmek ve gerçekleştirmek P450-CYP450) açıklandığı gibi¹² ve bir konfokal mikroskop altında görselleştirmek.

Sonuçlar

Mikrowelllerde kendi kendine organize edilen 1 haftalık domuz testlerinden izole hücreler(Şekil 1A, Şekil 2), belirgin dış (seminifer epitel) ve iç bölmeler ( interstitium) (Şekil 1B, Şekil 2). İki bölme kollajen IV^+ve bazmembran ile ayrılmıştır. UCH-L1^+ve mikrop hücreleri ve GATA4^+ve Ser...

Tartışmalar

Biz in vivo¹²testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis¹²için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,^9,10,11 üretmek için farklı yöntemler

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049