JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для воспроизводимого поколения свиных яичек органоидов с тестом специфической архитектуры тканей с использованием коммерчески доступной системы культуры микроколодцев.

Аннотация

Органоиды представляют трехмерные структуры, состоящие из нескольких типов клеток, которые способны переопределять архитектуру тканей и функции органов in vivo. Формирование органоидов открыло различные возможности фундаментальных и трансляционных исследований. В последние годы органоиды яичек заинтересовались мужской репродуктивной биологией. Личикулярные органоиды позволяют изучать клеточные взаимодействия, развитие тканей и микросреду нишу зародышевых клеток и облегчают высокую пропускную способность наркотиков и скрининга токсичности. Метод необходим для надежного и воспроизводимого генерации яичек органоидов с testis специфической архитектуры тканей. Система культуры микроколодцев содержит плотный массив микроколодцев в форме пирамиды. Яичек клетки, полученные из допубертатных яичек центрифугируются в эти микроуэллы и культивируется для создания яичек органоидов с яичка конкретных архитектуры тканей и клеточных ассоциаций. Тысячи однородных органоидов могут быть созданы с помощью этого процесса. Протокол, представленный здесь, будет представлять широкий интерес для исследователей, изучающих мужское размножение.

Введение

В последние годы наблюдается возрождение интереса к трехмерным (3D) органоидам. Различные органы, такие как кишечник1,желудок2,поджелудочная железа3,4,печень5,и мозг6 были успешно выведены в 3D органоидных систем. Эти органоиды имеют архитектурное и функциональное сходство с органами in vivo и более биологически актуальны для изучения микроокружения тканей, чем монослойные системы культуры7. В результате, органоиды яичек начали набирать интерес, а также8,9,10,11,12. Большинство методов сообщили до сих пор являются сложными, невысокой пропускной записи10 и требуют добавления ECM белков8,10. Эта сложность также приводит к проблемам с воспроизводимостью. Необходим простой и воспроизводимый метод, позволяющий выравлить органоиды яичек с клеточными ассоциациями, которые подобны яичкам in vivo.

Недавно мы сообщили о системе для удовлетворения этихтребований 12. Используя свинью в качестве модели, мы использовали центробежный подход к принудительной агрегации в системе микроколодцов. В системе микроколодцов, каждый из скважин содержит большое количество одинаковых небольших микровелл13. Это позволяет для генерации многочисленных сфероидов равномерного размера. Система микроскважин позволила пообразить большое количество однородных органоидов с архитектурой, специфичной для яичек. Система проста и не требует добавления белков ECM.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Тесты из 1-недельных поросят были получены из коммерческой свинофермы в качестве побочного продукта от кастрации коммерческих свиней. Поиск яичек был одобрен Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари.

1. Подготовка ферментных растворов для пищеварения тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимы три различных ферментативных решения, которые включают в себя два различных коллагеназных IV решения (решение A, B) и deoxyribonuclease I (DNase I) решение.

  1. Для приготовления раствора A растворите 20 мг коллагеназа IV S(Таблица материалов)и 40 мг коллагеназа IV W(Таблица материалов) в 25 мл высокоглюкозного диглобикового среднего орла (DMEM). Затем фильтр стерилизовать с 0,22 мкм фильтра. Добавьте 0,4 мл сыворотки крупного рогатого скота (FBS) к раствору А, чтобы ингибировать активность трипсина.
  2. Для приготовления раствора B растворите 80 мг коллагеназа IV W(Таблица материалов)в 40 мл DMEM. Затем фильтр стерилизовать с 0,22 мкм фильтра.
  3. Для приготовления раствора DNase I (7 мг/мл) растворите 70 мг DNase I в 10 мл DMEM. Затем фильтр стерилизовать с 0,22 мкм фильтра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация фермента для растворов коллагеназа IV, изложенных здесь, варьируется от концентраций (2 мг/мл), указанных в оригинальной статье14. Текущий протокол дает клетки с несколько более высокой жизнеспособностью. Однако клетки, изолированные обоими протоколами, производят органоиды с одинаковой архитектурой тканей.

2. Тестис ткани ферментативное пищеварение

  1. Соберите яички в стерильный стакан и промойте фосфатным буферным сольником (PBS), содержащим 1% пенициллина/стрептомицина (P/S). После мытья, передача яичек на 100 мм ткани культуры блюдо с PBS, содержащий 1% P / S и удалить туника вагины и эпидидимис с помощью автоклавированных ножниц и щипцы. Перенесите изолированные яички в новую 100-мм тарелку и тщательно промойте PBS, содержащее 1% P/S.
  2. Для поддержания стерильности, используйте другой набор стерильных ножниц и щипцы, чтобы очистить яичек parenchyma из туники albuginea. Вырезать яички вдоль продольной оси непосредственно под туника. Затем очистить яички из тунца с помощью двух щипцы и место в новый 100 мм блюдо, содержащее 1 мл DMEM с 1% P / S.
  3. Фарш очищенные яички стерильными ножницами на 1-2 мм кусочки ткани. После измельчения используйте стерильные щипцы для удаления белых фрагментов соединительной ткани.
  4. Перенесите кусочки измельченной ткани в раствор А и пополнить его до 50 мл с DMEM для получения концентрации 0,4 мг/мл для коллагеназа IV S(Таблица материалов) и концентрации 0,8 мг/мл для коллагеназа IV W(Таблица материалов). Поместите раствор А, содержащий кусочки ткани, в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, аккуратно инвертируйте трубки каждые 5 минут и проверьте визуально на предмет высвобождения ДНК.
    1. Добавьте 500 л DNase I, если наблюдается свободное плавающее ДНК. После 30 мин, центрифуга трубки на 90 х г с тормозами при 25 градусов по Цельсию в течение 1,5 мин и отбросить супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК будет выглядеть как мутное вещество. Когда трубки встряхиваются, части ткани оседают, в то время как ДНК будет оставаться на плаву.
  5. Добавить раствор B в трубку и пополнить до 50 мл с DMEM для получения концентрации 1,2 мг/мл коллагеназа IV W(Таблица материалов). Поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут и аккуратно инвертировать трубку каждые 5 минут. Добавить 500 зл. DNase I, если свободно плавающей ДНК наблюдается.
  6. После 30 мин, центрифуга трубки на 90 х г с тормозами при 25 градусах по Цельсию в течение 1,5 мин. После этого отбросить супернатант и вымыть один раз с PBS с 1% P / S.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отбрасываемые супернацианты из обоих растворов A и B будут в основном содержать интерстициальные клетки.
  7. Пополнить трубку с PBS до 50 мл. Тщательно соберите трубки сверху и поместите в новую трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большие непереваренные фрагменты тканей быстро оседают на дне, в то время как переваренные полуниферные трубочки останутся в подвеске. Никакие большие фрагменты ткани не должны быть собраны. Эту процедуру можно повторить несколько раз, пока раствор в исходной трубке не станет почти прозрачным и остались просто непереваренные фрагменты тканей, которые можно утилизировать.
  8. Centrifuge трубочки на 90 х г с тормозами при 25 градусах по Цельсию в течение 1,5 мин и отбросить супернатант. Добавить свежие PBS и центрифуги снова. Повторите этот шаг мытья дважды.
  9. После последнего мытья PBS, удалить супернатант и resuspend seminiferous труб в 5 мл PBS. Затем добавьте 15 мл 0,25% трипсин-этиленедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) в трубки. Поместите трубку в воду в воду в 37 градусов и аккуратно инвертировать каждые 2 мин. Если наблюдается много свободно плавающей ДНК, добавьте 500 кЛ DNase I с 5 мл DMEM.
  10. Оцените ферментативное переваривание трубок до одиночных клеток под микроскопом (сначала через 5 мин, затем каждые 2 мин). Если в основном одиночные клетки могут быть обнаружены, остановить реакцию с 5 мл FBS и фильтр через 70 мкм сетки, а затем через 40 мкм сетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы колпачки на трубках 50 мл, используемых для пищеварения (Решение A, B и 0.25% трипсин-ЭДТА) были затянуты должным образом. Если загрязнение в водяной бане является проблемой, парафин пленка может быть обернута вокруг крышки для обеспечения бесплодия.
  11. Центрифуги одиночные ячейки на 500 х г с тормозами при 25 градусах по Цельсию в течение 5 минут, повторно приостанавливается в среде обогащения (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12), содержащий 5% FBS и 1% P/S) и подсчитывайте количество жизнеспособных клеток. Это популяция исходных клеток. Исправить 100 х 103 клеток и выполнять иммуноцитохимию для маркера зародышевых клеток UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1), как описано12 и определить процент зародышевых клеток в этой популяции исходных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркер клетки зародыша Promyelocytic лейкемия цинк протеин пальцев (PL'F)15 смог также быть использован как целесообразная алтернатива для UCHL1. В популяции исходных клеток, ожидаемый выход клеток составляет около 700-800 х 109/g ткани. Процент зародышевых клеток в этой популяции клеток должен быть 4-5%.
  12. Поместите около 20 х 106 этой стартовой популяции клеток в двух сверхнизких вложениях 100 мм посуды Петри (10 х 106 ячеек, взвешенных в 10 мл DMEM/F12, содержащего 1% Р/С в каждом блюде) в течение 2 дней в инкубаторе культуры тканей (37 градусов по Цельсию) , 5% CO2,21% кислорода). Выполните обогащение зародышевых клеток с остальными клетками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптимальной жизнеспособности и качества клеток, в то время как обогащение зародышевых клеток и последующая количественная оценка происходит, популяция исходных клеток помещается в культуру в ультра низких блюдах культуры ткани привязанности в течение 2 дней.

3. Обогащение зародышевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, описанная выше, дает в первую очередь клетки Сертоли и зародышевые клетки. Различные свойства адгезии позволяют отделять клетки Sertoli и зародышевые клетки через дифференциальное покрытие.

  1. Семена 20-25 х 106 клеток популяции исходных клеток на 100 мм ткани культуры блюдо в общей объеме 8 мл обогащения среды (DMEM/F12 с 5% FBS и 1% P / S) для дифференциального покрытия. Поместите клетки в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2, 21% O2) и после 1,5 ч, убедитесь, что большинство клеток Sertoli прикрепляются к пластине.
  2. Соберите и объедините супернатант (в основном содержащий зародышевые клетки) из 2 пластин в одну новую 100-мм пластину и поместите его обратно в инкубатор. После 1 ч снова совместите супернатант из 2 пластин с новой 100-мм пластиной. Поместите тарелки обратно в инкубатор на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатанты в сочетании в первую очередь содержат зародышевые клетки. Присоединенные клетки, которые отбрасываются вместе с пластинами, в основном являются соматическими клетками яичек, такими как Sertoli и перитукулярные миоидные клетки.
  3. Соберите обогащенные зародышевые клетки в две фракции следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащенные зародышевые клетки придерживаются по-разному, не придерживаются фракции и слегка придерживаются фракции. Обе эти фракции вместе образуют обогащенную популяцию зародышевых клеток
    1. Не адепт фракции: собирать супернатант.
    2. Слегка адепт фракция: мыть пластины мягко с PBS, лечить с 2 мл 1:20 разбавления 0,25% трипсин-EDTA в течение 5 минут при комнатной температуре, остановить реакцию с 2 мл обогащения среды и собирать в той же трубке, как не адепт фракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0.25% Трипсин-EDTA должен быть разбавлен PBS для получения 1:20 трипсин раствор.
  4. Подсчитайте общее количество клеток, используя клеточный счетчик, исправить 100 х 103 клеток и выполнять иммуноцитохимию для маркера зародышевых клеток UCHL1, как описано12 и определить процент зародышевых клеток в этой обогащенной популяции клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процент зародышевых клеток в этой популяции клеток должен быть не менее 60-70%. Так как иммуноцитохимия для количественной оценки потребует 1 день, обогащенные клетки должны быть помещены в ультра низкой крепления 100 мм Петри блюдо с DMEM / F12 дополняется 1% P / S в течение длительности для обеспечения оптимального качества клеток и жизнеспособности.

4. Подготовка клеток для посева

  1. Чтобы собрать стартовый препарат клетки, соберите супернатант в трубке 50 мл из ультранизкой крепления 100 мм посуды. Вымойте пластины энергично с PBS для сбора присоединенных клеток. Никакое ферментативное пищеварение не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые из яичек клеток, в первую очередь Sertoli клетки, может слегка придерживаться ультра низких пластин крепления.
  2. Объедините препарат от начала клетки и обогащенные зародышевые клетки, чтобы получить рабочий препарат клетки, содержащий 25% зародышевых клеток. Центрифуга при 500 х г с тормозами при 25 градусах по Цельсию в течение 5 мин, отбросьте супернатант и resuspend клетки в среде образования органоидов (DMEM/F12 дополнен инсулином 10 мкг/мл, трансферрин 5,5 мкг/мл, селен 6,7 нг/мл, 20 нг/мЛ эпидермального фактора роста , 1% P/S). Отрегулируйте плотность клеток до 2,4 x 106 на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина в микроколодцах, используемых13 в этом протоколе, содержала 1200 микровелл.
  3. Используйте формулу ниже, чтобы вычислить количество ячеек на скважину, описанную ниже.
    Количество клеток на скважину и количество микровелл х числа клеток, которые будут сгруппированы для каждого органоида.
  4. Для генерации органоидов из 1000 клеток каждая, семена каждый с (1200 х 1000 клеток каждый) 1,2 х 106 клеток. Отрегулируйте плотность клеток в суспензии клетки таким образом, чтобы клетки посеяли в объеме 0,5 мл средней. Для органоидов, образованных из 1000 клеток каждая, используйте плотность 2,4 х 106 клеток на мл (1,2 х 106 клеток в 0,5 мл).

5. Подготовка микроколодцев для получения клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что клетки не придерживаются поверхности микроколодца, обработайте сурфактантом, который доступен для покупки производителем.

  1. Добавьте 0,5 мл раствора для промывки каждого колодца. Убедитесь, что пузырьки воздуха не оказались в ловушке в колодце. Чтобы удалить пузырьки воздуха, если таковые имеется, центрифуги пластины на 2000 х г с тормозами при 25 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  2. Наблюдайте за пластиной под малоувеличиваемым перевернутым микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки были удалены из микроколодцев. Если в ловушке пузырьки наблюдаются, центрифуга снова на 2000 х г с тормозами при 25 градусов по Цельсию в течение 2 минут, чтобы удалить все оставшиеся пузырьки.
  3. Накройте тарелку крышкой и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. После завершения лечения снимите раствор полоскания и немедленно промойте тарелку стерильной водой или PBS. Убедитесь, что пластина не высохнет после обработки раствором для промывки.

6. Поколение органоидов яичек

  1. Добавьте 0,5 мл органоидного образования среды (без каких-либо клеток) к каждой скважине и центрифуги на 2000 х г с тормозами при 25 градусов по Цельсию в течение 2 минут, чтобы удалить любые захваченные пузырьки воздуха. Обратите внимание на скважину под низкоувеличим перевернутым микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха были удалены. Если в ловушке пузырьки наблюдаются, центрифуга снова на 2000 х г с тормозами при 25 градусов по Цельсию в течение 2 минут, чтобы удалить все оставшиеся пузырьки.
  2. Добавьте 0,5 мл рабочей подвески ячейки и аккуратно перемешайте, прокладывая вверх и вниз. Центрифуга при 500 х г с тормозами при 25 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Используйте перевернутый микроскоп, чтобы убедиться, что клетки сгруппированы в микроуэллах.
  3. Перенесите пластину в инкубатор и культуру клеточной культуры на 5 дней. Изменение половины среды через день.
    1. Чтобы изменить среду, не теряя ни одного органоидов, коснитесь кончика пипетки к стенке колодца и опустите осторожно, чтобы коснуться мениска и медленно нарисуйте среду. Убедитесь в том, чтобы следовать мениска, как он падает. Чтобы добавить свежую среду, коснитесь кончика пипетки к стене колодца на той же стороне, что и средний вывод, и добавьте свежую среду мягко против стены колодца, позволяя ей медленно стекать вниз по стене.
  4. Чтобы восстановить органоиды, аккуратно пипетка среды вверх и вниз с помощью широкого рта пипетка. Это позволило бы органоидам выйти из микроколодцев.
  5. Соберите органоиды, мыть с PBS, исправить и выполнить иммуноцитохимию для маркера зародышевых клеток (UCH-L1), Маркер клетки Sertoli (GATA Связывающий белок 4-GATA4), перитубулярный миоидный маркер клетки (З-Гладкий мышечный актин-ЗСМА) и Лейдиг маркер клеток (Cytochrome P450-CYP450), как описано12 и визуализировать под конфокальный микроскоп.

Результаты

Изолированные клетки из 1-недельных старых свиных яичек, которые культивировались в микроуэллах, самоорганизованных в сфероиды(рисунок 1A, Рисунок 2),с разграниченной и четкой внешности (семиниферный эпителий) и внутренних отсе...

Обсуждение

Мы создали простой метод, который позволяет последовательное, повторяемое поколение большого количества яичек органоидов с архитектурой тканей, которая похожа на testis in vivo12. Хотя подход был разработан с использованием свиных яичек клеток, это более широко применимо также ?...

Раскрытие информации

Д-р Ungrin имеет финансовый интерес в технологии AggreWell в качестве изобретателя.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH/NICHD HD091068-01 доктору Ине Добрински.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm ultra low attachment tissue culture dishCorning#CLS3262
100 mm tissue culture dishCorning#353803
Aggrwell 400Stemcell Technologies#34411
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemcell Technologies#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticumSigma-Aldrich#C5138referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV WorthingtonWorthington-Biochem#LS004189referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12Gibco#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucoseSigma-Aldrich#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich#D8537
Epidermal Growth FactorR&D Systems#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µmFisherScientific#352350
Falcon Cell Strainers 40 µmFisherScientific#352340
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific#12483-020
Insulin-Transferrin-SeleniumGibco#41400-045
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich#P4333
Porcine testicular tissueSunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter UnitMillipore#SCGP00525
Trypsin-EDTASigma#T4049

Ссылки

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

152

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены