Génération d'organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de Testis utilisant la culture de Microwell

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la génération reproductible des organoïdes testiculaires porcins avec l'architecture spécifique de tissu de testicule utilisant le système commercial disponible de culture de microwell.

Résumé

Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles composées de plusieurs types de cellules qui sont capables de récapituler l'architecture tissulaire et les fonctions des organes in vivo. La formation d'organoïdes a ouvert différentes voies de recherche fondamentale et translationnelle. Ces dernières années, les organoïdes testiculaires ont suscité l'intérêt dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine. Les organoïdes testiculaires permettent l'étude des interactions cellules-cellules, du développement des tissus et du microenvironnement de niche des cellules germinales et facilitent le dépistage des médicaments à haut débit et de la toxicité. Une méthode est nécessaire pour générer de façon fiable et reproductible des organoïdes testiculaires avec l'architecture spécifique de tissu de testicule. Le système de culture des micropuits contient un réseau dense de micropuits en forme de pyramide. Les cellules testiculaires dérivées des testicules pré-puberté sont centrifugeuses dans ces micropuits et cultivées pour produire des organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu testis-spécifique et les associations cellulaires. Des milliers d'organoïdes homogènes peuvent être générés par ce processus. Le protocole rapporté ici sera d'un grand intérêt pour les chercheurs qui étudient la reproduction masculine.

Introduction

Ces dernières années, il y a eu un regain d'intérêt pour les organoïdes tridimensionnels (3D). Différents organes tels que l'intestin¹, estomac², pancréas^3,4, foie⁵, et le cerveau⁶ ont été avec succès dérivés dans les systèmes organoïdes 3D. Ces organoïdes ont des similitudes architecturales et fonctionnelles avec les organes in vivo et sont plus biologiquement pertinents pour l'étude du microenvironnement tissulaire que les systèmes de culture monocouches⁷. En conséquence, organoïdes testiculaires ont commencé à susciter l'intérêt ainsi^8,9,10,11,12. La majorité des méthodes signalées jusqu'à présent sont complexes, sans haut débit¹⁰ et nécessitent l'ajout de protéines ECM^8,10. Cette complexité entraîne également des problèmes de reproductibilité. Une méthode simple et reproductible est nécessaire qui permet la génération d'organoïdes testiculaires avec des cellules-associations qui sont comme le testicule in vivo.

Nous avons récemment signalé un système pour répondre à ces exigences¹². En utilisant le porc comme modèle, nous avons utilisé une approche centrifuge d'agrégation forcée dans le système de micropuits. Dans le système de micropuits, chaque puits contient un grand nombre de micropuits identiques plus petits¹³. Cela permet la génération de nombreux sphéroïdes de taille uniforme. Le système de micropuits a permis la génération d'un grand nombre d'organoïdes uniformes avec une architecture spécifique aux testis. Le système est simple et ne nécessite pas l'ajout de protéines ECM.

Protocole

REMARQUE : Les testicules des porcelets d'une semaine ont été obtenus à partir d'une ferme porcine commerciale comme sous-produit de la castration de porcs commerciaux. L'approvisionnement en testicules a été approuvé par le Comité des soins aux animaux de l'Université de Calgary.

1. Préparation de solutions enzymatiques pour la digestion des tissus

REMARQUE : Trois solutions enzymatiques différentes sont nécessaires, qui comprennent deux solutions différentes de collagène IV (solution A, B) et une solution de désoxyribonuclease I (DNase I).

1. Pour préparer la solution A, dissoudre 20 mg de collagène IV S(Tableau des matériaux) et 40 mg de collagène IV W (Tableau des matériaux) dans 25 mL de moyenne d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m. Ajouter 0,4 ml de sérum bovin fœtal (SF) à la solution A pour inhiber l'activité de la trypsine.
2. Pour préparer la solution B, dissoudre 80 mg de collagène IV W (Table of Materials) en 40 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m.
3. Pour préparer la solution DNase I (7 mg/mL), dissoudre 70 mg de DNase I dans 10 ml de DMEM. Puis filtrez la stérilisation à l''infiltre de 0,22 m.
   REMARQUE: La concentration enzymatique pour les solutions de collagène IV décrites ici, varie des concentrations (2 mg/mL) énoncées dans l'article^{original 14}. Le protocole actuel donne des cellules avec une viabilité légèrement plus élevée. Cependant, les cellules isolées par les deux protocoles produisent des organoïdes avec l'architecture de tissu identique.

2. Digestion enzymatique de tissu de testis

1. Recueillir les testicules dans un bécher stérile et laver avec du phosphate tamponné salin (PBS) contenant 1% de pénicilline/streptomycine (P/S). Après le lavage, transférer les testicules dans un plat de culture tissulaire de 100 mm avec PBS contenant 1% P/S et enlever la tunica vaginalis et l'épididyme à l'aide de ciseaux et de forceps autoclaved. Transférer les testicules isolés dans un nouveau plat de 100 mm et laver soigneusement avec du PBS contenant 1 % de P/S.
2. Pour maintenir la stérilité, utilisez un autre ensemble de ciseaux et de forceps stériles pour éplucher le parenchyme testiculaire de la tunica albuginea. Couper les testicules le long de l'axe longitudinal directement sous la tunica. Ensuite, épluchez les testicules hors de la tunica à l'aide de deux forceps et placez-les dans un nouveau plat de 100 mm contenant 1 ml de DMEM avec 1% P/S.
3. Émincer les testicules pelés avec des ciseaux stériles en morceaux de tissu de 1 à 2 mm. Après le hachage, utilisez des forceps stériles pour enlever les fragments blancs de tissu conjonctif.
4. Transférer les morceaux de tissu haché dans la solution A et le garnir jusqu'à 50 ml avec dMEM pour obtenir une concentration de 0,4 mg/mL pour la collagène IV S (Tableau des matériaux) et une concentration de 0,8 mg/mL pour la collagène IV W (Tableau des matériaux). Placez la solution A contenant les morceaux de tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min, inversez délicatement les tubes toutes les 5 min et vérifiez visuellement la libération d'ADN.
   1. Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre. Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant.
      REMARQUE : L'ADN apparaîtrait comme une substance trouble. Lorsque les tubes sont secoués, les morceaux de tissu s'installent alors que l'ADN resterait à flot.
5. Ajouter la solution B au tube et recharger jusqu'à 50 ml avec DMEM pour obtenir une concentration de 1,2 mg/ml de collagène IV W(tableau des matériaux). Placez le tube dans un bain d'eau de 37 oC pendant 30 min et inversez doucement le tube toutes les 5 min. Ajouter 500 l de DNase I si l'ON observe de l'ADN flottant libre.
6. Après 30 min, centrifuger le tube à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min. Après que jeter le supernatant et laver une fois avec PBS avec 1% P / S.
   REMARQUE : Les supernatants jetés des deux solutions A et B contiendront principalement des cellules interstitielles.
7. Rehaussez le tube avec pbS jusqu'à 50 ml. Recueillir soigneusement les tubules du haut et les placer dans un nouveau tube de 50 ml.
   REMARQUE : Les gros fragments de tissus non digérés se déposent rapidement au fond, tandis que les tubules séminifères digérés resteront en suspension. Aucun gros fragment de tissu ne doit être recueilli. Cette procédure peut être répétée plusieurs fois jusqu'à ce que la solution dans le tube d'origine soit presque claire et que des fragments de tissu non digérés restent, ce qui peut être éliminé.
8. Centrifuger les tubules à 90 x g avec freins à 25 oC pendant 1,5 min et jeter le supernatant. Ajouter à nouveau le PBS frais et la centrifugeuse. Répétez cette étape de lavage deux fois.
9. Après le dernier lavage PBS, retirer le supernatant et resuspendre les tubules séminiferous dans 5 ml de PBS. Ajouter ensuite 15 ml d'acide trypsin-éthylèneetélènetetraacetic (EDTA) aux tubules. Placer le tube dans un bain d'eau de 37 oC et inverser délicatement toutes les 2 minutes. Si beaucoup d'ADN flottant est observé, ajoutez 500 l de DNase I avec 5 mL de DMEM.
10. Évaluer la digestion enzymatique des tubules en cellules individuelles au microscope (d'abord après 5 min, puis toutes les 2 min). Si la plupart du temps des cellules simples peuvent être détectées, arrêtez la réaction avec 5 ml de FBS et filtrez à travers un maillage de 70 m, puis à travers un maillage de 40 m.
    REMARQUE : Il faut prendre soin de serrer correctement les bouchons des tubes de 50 ml utilisés pour la digestion (Solution A, B et 0,25 % trypsine-EDTA). Si la contamination dans le bain d'eau est un problème, film de paraffine peut être enroulé autour du bouchon pour assurer la stérilité.
11. Centrifuger les cellules individuelles à 500 x g avec des freins à 25 oC pendant 5 min, resuspendre dans le milieu d'enrichissement (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contenant 5 % de FBS et 1 % de P/S) et compter le nombre de cellules viables. C'est la population de cellules de départ. Fixer 100 x 10³ cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) comme décrit¹² et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population de cellules de départ.
    REMARQUE : Le marqueur de cellules germinales Promyelocytic le virus de la leucémie à zinc (PLZF)¹⁵ pourrait également être utilisé comme alternative appropriée pour UCHL1. Dans la population de cellules de départ, le rendement cellulaire prévu est d'environ 700-800 x 10⁹/g de tissu. Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être de 4-5%.
12. Placer environ 20 x 10⁶ de cette population de cellules de départ dans deux plats Petri ultra faiblement en attachement 100 mm (10 x 10⁶ cellules suspendues dans 10 ml de DMEM/F12 contenant 1% de P/S dans chaque plat) pendant 2 jours dans un incubateur de culture tissulaire (37 oC , 5% CO₂, 21% d'oxygène). Effectuer l'enrichissement des cellules germinales avec les cellules restantes.
    REMARQUE : Pour assurer la viabilité optimale et la qualité cellulaire, tandis que l'enrichissement des cellules germinales et la quantification subséquente ont lieu, la population de cellules de départ est placée en culture dans des plats de culture de tissus ultra faiblement attachés pendant 2 jours.

3. L'enrichissement des cellules germinales

REMARQUE : La procédure décrite ci-dessus donne principalement des cellules de Sertoli et des cellules germinales. Différentes propriétés d'adhérence permettent la séparation des cellules de Sertoli et des cellules germinales par placage différentiel.

1. Graines 20-25 x 10⁶ cellules de la population de cellules de départ par plat de culture tissulaire de 100 mm dans un volume total de 8 ml de milieu d'enrichissement (DMEM/F12 avec 5% FBS et 1% P/S) pour le placage différentiel. Placer les cellules dans un incubateur (37 oC, 5 % CO₂, 21 % O₂) et après 1,5 h, s'assurer que la majorité des cellules Sertoli se fixent à la plaque.
2. Recueillir et combiner le supernatant (contenant principalement des cellules germinales) de 2 plaques à une nouvelle plaque de 100 mm et le remettre dans l'incubateur. Après 1 h, regroupez à nouveau le supernatant de 2 plaques dans une nouvelle plaque de 100 mm. Remettre les assiettes dans l'incubateur pour la nuit.
   REMARQUE : Les supernatants combinés contiendront principalement des cellules germinales. Les cellules adhérentes qui sont jetées avec les plaques sont principalement des cellules somatiques testiculaires telles que Sertoli et les cellules myoïdes périurtiques.
3. Recueillir les cellules germinales enrichies en deux fractions comme suit.
   REMARQUE : Les cellules germinales enrichies adhèrent différemment, fraction non adhérente et fraction légèrement adhérente. Ces deux fractions forment ensemble la population de cellules germinales enrichies
   1. Fraction non adhérente : collectez le supernatant.
   2. Fraction légèrement adhérente : lavez les assiettes doucement avec du PBS, traitez avec 2 ml de dilution de 1:20 de 0,25 % trypsine-EDTA pendant 5 min à température ambiante, arrêtez la réaction avec 2 ml de milieu d'enrichissement et collectez dans le même tube que la fraction non adhérente.
      REMARQUE: 0,25% Trypsin-EDTA doit être dilué avec PBS pour produire une solution 1:20 trypsin.
4. Compter le nombre total de cellules à l'aide d'un compteur cellulaire, fixer 100 x 10³ cellules et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales UCHL1 comme décrit¹² et de déterminer le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire enrichie.
   REMARQUE : Le pourcentage de cellules germinales dans cette population cellulaire devrait être d'au moins 60-70%. Puisque l'immunocytochimie pour la quantification exigerait 1 jour, les cellules enrichies devraient être placées dans un plat de Petri ultra bas d'attachement 100 mm avec DMEM/F12 complété avec 1% P/S pour la durée pour assurer la qualité et la viabilité optimales de cellules.

4. Préparation des cellules pour l'ensemencement

1. Pour récolter la préparation de la cellule de départ, recueillir le supernatant dans un tube de 50 ml de la vaisselle ultra faible de 100 mm. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour recueillir les cellules adhérentes. Aucune digestion enzymatique n'est nécessaire.
   REMARQUE : Certaines cellules testiculaires, principalement des cellules de Sertoli, peuvent légèrement adhérer aux plaques d'attachement ultra basses.
2. Combinez la préparation des cellules de départ et les cellules germinales enrichies pour obtenir une préparation de cellules de travail contenant 25 % de cellules germinales. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min, jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans le milieu de formation organoïde (DMEM/F12 complété par de l'insuline 10 g/mL, transferin 5,5 g/mL, sélénium 6,7 ng/mL, 20 ng/mL de croissance du facteur épidermique , 1 % P/S). Ajuster la densité cellulaire à 2,4 x 10⁶ par ml.
   REMARQUE : Chaque puits dans les plaques de micropuits utilisés¹³ dans ce protocole contenait 1 200 micropuits.
3. Utilisez la formule ci-dessous pour calculer le nombre de cellules par puits comme décrit ci-dessous.
   Nombre de cellules par puits - nombre de micropuits x nombre de cellules à regrouper pour chaque organoïde.
4. Pour générer des organoïdes à partir de 1 000 cellules chacune, ensemencez chacune avec (1 200 x 1 000 cellules chacune) 1,2 x 10⁶ cellules. Ajuster la densité cellulaire dans la suspension cellulaire de manière à ce que les cellules soient ensemies dans un volume de 0,5 ml de milieu. Pour les organoïdes formés à partir de 1 000 cellules chacune, utilisez une densité de 2,4 x 10⁶ cellules par mL (1,2 x 10⁶ cellules en 0,5 ml).

5. Préparation des micropuits pour recevoir les cellules

REMARQUE : Pour s'assurer que les cellules n'adhèrent pas à la surface du micropuits, traitez-les avec une solution de rinçant de surfactant qui est disponible à l'achat par le fabricant.

1. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçant à chaque puits. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée dans le puits. Pour enlever les bulles d'air, le cas échéant, centrifuger la plaque à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min.
2. Observez la plaque sous un microscope inversé à faible grossissement, pour vérifier que les bulles ont été retirées des micropuits. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.
3. Couvrir la plaque avec le couvercle et couver pendant 30 min à température ambiante. Une fois le traitement terminé, retirer la solution de rinçant et laver immédiatement la plaque avec de l'eau stérile ou du PBS. Assurez-vous que la plaque ne se dessèche pas après le traitement avec la solution de rinçant.

6. Génération d'organoïdes testiculaires

1. Ajouter 0,5 ml de milieu de formation d'organoïdes (sans cellules) à chaque puits et centrifugeuse à 2 000 x g avec freins à 25 oC pendant 2 min pour éliminer les bulles d'air emprisonnées. Observez le puits sous un microscope inversé à faible grossissement pour vérifier que les bulles d'air ont été enlevées. Si l'on observe des bulles piégées, la centrifugeuse à nouveau à 2 000 x g avec des freins à 25 oC pendant 2 min pour enlever les bulles restantes.
2. Ajouter 0,5 ml de suspension de la cellule de travail et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Centrifugeuse à 500 x g avec freins à 25 oC pendant 5 min. Utilisez un microscope inversé pour vérifier que les cellules se sont regroupées dans les micropuits.
3. Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire et la culture pendant 5 jours. Changer la moitié du support tous les deux jours.
   1. Pour changer de milieu sans perdre d'organoïdes, touchez la pointe de la pipette à la paroi du puits et baissez doucement pour toucher le ménisque et dessinez lentement le milieu. Assurez-vous de suivre le ménisque au fur et à mesure qu'il tombe. Pour ajouter le milieu frais, touchez la pointe de pipette au mur du puits sur le même côté que le retrait moyen et ajoutez le milieu frais doucement contre le mur de puits, lui permettant de couler lentement en bas du mur.
4. Pour récupérer les organoïdes, pipette doucement le milieu de haut en bas à l'aide d'une pipette à large bouche. Cela permettrait aux organoïdes de sortir des micropuits.
5. Recueillir les organoïdes, laver avec du PBS, fixer et effectuer l'immunocytochimie pour le marqueur de cellules germinales (UCH-L1), marqueur cellulaire Sertoli (GATA Binding Protein 4-GATA4), marqueur de cellules myoïdes périubulaires (Actin-SMA muscle lisse) et marqueur cellulaire Leydig (Cytochrome P450-CYP450) comme décrit¹² et visualiser sous un microscope confocal.

Résultats

Cellules isolées de testicules porcins d'une semaine qui ont été cultivés dans les micropuits auto-organisés en sphéroïdes (Figure 1A, Figure 2), avec un extérieur délimité et distinct (épithélium séminifère) et des compartiments intérieurs ( interstitium) (Figure 1B, Figure 2). Les deux compartiments ont été séparés p...

Discussion

Nous avons établi une méthode simple qui permet la génération cohérente et reproductible d'un grand nombre d'organoïdes testiculaires avec l'architecture de tissu qui est semblable au testicule in vivo^12. Bien que l'approche ait été développée à l'aide de cellules de testicules porcines, elle s'applique plus largement aussi aux testicules de souris, de primates non humains et de testicules humains¹². Un certain nombre de méthodes différentes ont été rapporté...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049