使用微孔培养法生成具有睾丸特定结构的猪睾丸组织

摘要

在这里，我们提出了一个协议，用于使用市售的微孔培养系统，用睾丸特定组织架构的可重复生成猪睾丸器官。

摘要

有机体是由多种细胞类型组成的三维结构，能够概括组织结构和体内器官的功能。有机物的形成开辟了基础研究和转化研究的不同途径。近年来，睾丸器官在男性生殖生物学领域引起了兴趣。睾丸类有机物允许研究细胞-细胞相互作用、组织发育和生殖细胞利基微环境，并促进高通量药物和毒性筛选。需要一种方法，以可靠和可重复地生成睾丸器官与睾丸特定的组织结构。微井培养系统包含密集的金字塔形微井阵列。从青春期前睾丸中提取的睾丸细胞被离心到这些微孔中，并培养成具有睾丸特异性组织架构和细胞关联的睾丸器官。通过这一过程可以产生数千个均质有机体。这里报道的协议将引起研究男性生殖的研究人员的广泛兴趣。

引言

近年来，人们对三维（3D）有机体的兴趣重新抬头。不同的器官，如^{肠1，胃2，}胰^{腺3，4，肝脏5，}和^大脑6已经成功地衍生成3D器官系统。与单层培养系统7相比，这些有机物与体内器官具有建筑和功能上的相似性，在研究组织微环境方面更具生物学^相关性。结果，睾丸类物开始引起兴趣，以及8，9，10，11，12。迄今报告的大多数方法都是复杂的，非高通^量10，并且需要添加ECM^{蛋白8，10。}这种复杂性还会导致重现性问题。需要一种简单且可重复的方法，允许生成具有细胞关联（类似于体内睾丸）的睾丸器官。

我们最近报告有一个系统，以解决这些问题^{的要求12。}以猪为模型，我们在微井系统中采用了离心强制聚集方法。在微井系统中，每口井都含有大量相同的小微^井13。这允许生成大量均匀大小的球体。微井系统能够生成大量具有睾号特异性架构的均匀有机体。该系统简单，不需要添加ECM蛋白。

研究方案

注:从1周大的小猪身上获得睾号，作为商业猪的副产品。卡尔加里大学动物护理委员会批准了睾兽的采购。

1. 组织消化酶溶液的制备

注:需要三种不同的酶溶液，包括两种不同的胶原酶IV溶液（溶液A，B）和脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶液。

1. 要制备溶液A，在25mL的高葡萄糖Dulbeco的改性鹰中分部（DMEM）中溶解20毫克胶原酶IV S（材料表）和40毫克胶原酶IV W（材料表）。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。将0.4 mL的胎儿牛血清（FBS）加入溶液A，以抑制胰蛋白酶活性。
2. 制备溶液B时，将80毫克胶原酶IV W（材料表）溶解在40 mL的DMEM中。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。
3. 要制备DNase I溶液（7毫克/mL），在10mL的DMEM中溶解70毫克DNase I。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。
   注:此处概述的胶原酶IV溶液的酶浓度与原^第14条所述的浓度（2mg/mL）不同。目前的协议产生具有略高生存能力的细胞。然而，两种协议分离的细胞产生具有相同组织结构的器官。

2. 睾度组织酶消化

1. 将睾片收集到无菌烧杯中，用含有1%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗。洗涤后，将睾丸转移到含有1%P/S的PBS的100毫米组织培养皿中，并使用高压灭菌剪刀和钳子去除阴道和表皮。将分离的睾剂转移到新的 100 mm 盘中，用含有 1% P/S 的 PBS 彻底清洗。
2. 为了保持无菌性，使用另一套无菌剪刀和钳子将睾丸皮瘤从图尼卡albuginea中剥离出来。沿着垂直轴直接切割睾号。然后用两个钳子将睾胎从图尼卡剥离出来，放入含有 1 mL DMEM 的 1 mL DMEM 的 100 mm 新盘中，并带有 1% P/S。
3. 用无菌剪刀将去皮的睾丸切成1-2毫米的组织片。切碎后，使用无菌钳去除结缔组织的白色碎片。
4. 将切碎的组织件转移到溶液A中，用DMEM将其顶入50 mL，以获得胶原酶IV S（材料表）的0.4mg/mL浓度和胶原酶IV W（材料表）的0.8mg/mL浓度。将含有组织碎片的溶液A放入37°C水浴中30分钟，每5分钟轻轻倒置管，并目视检查DNA的释放情况。
   1. 如果观察到自由浮动DNA，则加入500μL的DNase I。30分钟后，在25°C下用制动器将管在90 x g下离心1.5分钟，然后丢弃上清液。
      注:DNA会显示为一种浑浊的物质。当管子被摇动时，组织碎片稳定下来，而DNA会保持漂浮。
5. 将溶液B添加到管中，用DMEM加到50 mL，以获得1.2mg/mL的胶原酶IV W（材料表）的浓度。将管放入37°C水浴30分钟，每5分钟轻轻倒置管。如果观察到自由浮动DNA，则加入500μL的DNase I。
6. 30分钟后，在25°C下用制动器将管在90 x g下离心1.5分钟。之后丢弃上清液，用 1% P/S 的 PBS 洗涤一次。
   注:溶液A和B中丢弃的上生物将主要包含间质细胞。
7. 用 PBS 将管充值至 50 mL。小心地从顶部收集小管，并放入新的 50 mL 管中。
   注:大未消化的组织碎片迅速沉降在底部，而消化的小管将留在悬浮状态。不应收集大组织碎片。此过程可以重复几次，直到原始管中的溶液几乎清晰，仅剩下未消化的组织片段，可以进行处置。
8. 将小管在 90 x g下离心，在 25°C 下踩下制动器 1.5 分钟，然后丢弃上清液。再次添加新鲜的PBS和离心机。重复此洗涤步骤两次。
9. 上次 PBS 洗涤后，去除上清液，在 PBS 的 5 mL 中重新悬浮小管。然后向小管中加入15 mL的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）。将管子放入 37°C 水浴中，每 2 分钟轻轻倒置一次。如果观察到大量自由浮动的DNA，在5mL的DMEM中加入500μL的DNase I。
10. 在显微镜下评估小管的酶消化到单个细胞（先在5分钟后，然后每2分钟一次）。如果可以检测到大多数单个细胞，则停止使用 5 mL FBS 的反应，并通过 70 μm 网格进行过滤，然后通过 40 μm 网格进行过滤。
    注意:应注意，用于消化的50 mL管（溶液A、B和0.25%胰蛋白酶-EDTA）的盖子应正确拧紧。如果水浴中的污染是一个问题，石蜡薄膜可以包裹在盖子上，以确保不育。
11. 在500 x g下将单细胞在25°C下踩下5分钟，在浓缩培养基（Dulbeco改性鹰介质F/12（DMEM/F12）中重新悬浮，含有5%的FBS和1%的P/S），并计算活细胞的数量。这是起始细胞群。修复100 x 10³细胞，并执行免疫细胞化学的生殖细胞标记UCHL1（泛素C-终端水酸酶L1）如^描述12，并确定生殖细胞在此起始细胞群的百分比。
    注:生殖细胞标记原细胞白血病锌指蛋白（PLZF）15也可用作UCHL1的合适替代品。在起始细胞群中，预期细胞产量约为700-800 x 10⁹/g组织。生殖细胞在此细胞群中的百分比应为4-5%。
12. 将大约 20 x 10⁶的起始细胞群放入两个超低附件 100 mm 培养皿（10 x 10⁶个细胞，悬浮在 10 mL 的 DMEM/F12 中，每盘含有 1% P/S）在组织培养箱中等待 2 天（37 °C，5%CO 2，21% 氧气）。用剩余的细胞进行生殖细胞浓缩。
    注:为确保最佳活力和细胞质量，在生殖细胞富集和随后定量时，起始细胞群在超低附着组织培养皿中放置2天。

3. 生殖细胞富集

注:上述程序主要产生血清素细胞和生殖细胞。不同的粘附特性允许通过差分电镀分离Sertoli细胞和生殖细胞。

1. 种子 20-25 x 10⁶细胞起始细胞群每 100 毫米组织培养盘的总体积为 8 mL 的浓缩介质 （DMEM/F12 与 5% FBS 和 1% P/S） 差分电镀。将细胞放入培养箱（37°C，5%CO2，21%O_2）和1.5小时后，确保大多数Sertoli细胞附着在板上。
2. 收集并组合2个板的上清液（主要包含生殖细胞）到一个新的100毫米板，并将其放回培养箱。1 小时后，再次将 2 个板的上清液组合到新的 100 mm 板中。将盘子放回孵化器中过夜。
   注:组合的上生子将主要包含生殖细胞。与板块一起被丢弃的粘附细胞主要是睾丸体细胞，如Sertoli和前管状体细胞。
3. 收集富集的生殖细胞成两部分如下。
   注:富集生殖细胞粘附不同，非附着分数和微附粘度部分。这两个分数一起形成富集的生殖细胞群
   1. 非附着分数:收集上清液。
   2. 微粘度分数:用PBS轻轻清洗板，在室温下用2mL的1:20稀释0.25%胰蛋白酶-EDTA5分钟，停止反应，用2mL的浓缩介质，并收集在同一管作为非粘附分数。
      注:0.25%胰蛋白酶-EDTA需要用PBS稀释，以产生1:20胰蛋白酶溶液。
4. 使用细胞计数器计算细胞总数，修复 100 x 10³细胞，并像描述¹²一样对生殖细胞标记 UCHL1 进行免疫细胞化学，并确定此富集细胞群中生殖细胞的百分比。
   注:该细胞群中生殖细胞的百分比应至少为60-70%。由于定量的免疫细胞化学需要1天，浓缩细胞应放置在超低附着100毫米培养皿中，DMEM/F12在持续时间内辅以1%的P/S，以确保最佳的细胞质量和活力。

4. 准备用于播种的细胞

1. 要收获起始细胞制剂，从超低附件100 mm的培养皿中收集50 mL管中的上清液。用PBS大力清洗板，收集粘附细胞。无需酶消化。
   注:一些睾丸细胞，主要是Sertoli细胞，可以稍微粘附在超低附着板上。
2. 结合起始细胞制备和富集生殖细胞，获得含有25%生殖细胞的工作细胞制剂。在500 x g下，在25°C下用制动器离心5分钟，丢弃上清液，在有机体形成培养基中重新悬浮细胞（DMEM/F12补充胰岛素10微克/mL，转移蛋白5.5微克/mL，硒6.7纳克/mL，20纳克/mL表皮生长因子，1% P/S）。将细胞密度调整到 2.4 x 10⁶每 mL。
   注:本议定书中使用的^微孔板中每个孔包含1，200个微孔。
3. 使用下面的公式计算每个单元格数，如下所述。
   每口井的细胞数 = 每个有机体要聚类的微井数 x 细胞数。
4. 要从每个细胞中生成1000个细胞，每个细胞的种子（每个1，200 x 1，000个细胞+）1.2 x 10⁶个细胞。调整细胞悬浮液中的细胞密度，使细胞在0.5 mL的培养量中播种。对于由1，000个细胞组成的有机体，使用每mL2.4 x10⁶个细胞的密度（0.5 mL中的1.2 x 10⁶个细胞）。

5. 制备微井以接收细胞

注:为确保细胞不粘附在微井表面，请使用制造商可购买的表面活性剂注解溶液处理。

1. 在每个井中加入0.5 mL的浸解溶液。确保井中没有气泡。要去除气泡（如果有），请用 25°C 的制动器在 2，000 x g下离心板 2 分钟。
2. 在低放大倍率倒置显微镜下观察板，以验证气泡是否从微孔中去除。如果观察到被困气泡，在 25°C 下用制动器在 2，000 x g下再次离心 2 分钟，以清除任何剩余的气泡。
3. 用盖子盖住盘子，在室温下孵育30分钟。治疗完成后，取出冲洗溶液，并立即用无菌水或PBS清洗盘子。使用洗面溶液处理后，确保盘子不会干涸。

6. 睾丸器官的生成

1. 在每个井中加入0.5 mL的有机体形成介质（不含任何细胞），并在2000 x g下以25°C的制动器离心2分钟，以清除任何被困的气泡。在低放大倍率倒置显微镜下观察油井，以确认气泡已消除。如果观察到被困气泡，在 25°C 下用制动器在 2，000 x g下再次离心 2 分钟，以清除任何剩余的气泡。
2. 加入0.5 mL的工作细胞悬架，通过上下移液轻轻混合。在500 x g下，在25°C下用制动器离心5分钟。使用倒置显微镜验证细胞是否聚集在微井内。
3. 将板转移到细胞培养箱和培养5天。每隔一天更换一半的介质。
   1. 要在不丢失任何有机物的情况下更换介质，请触摸井壁上的移液器尖端，轻轻降低以触摸半月板并缓慢绘制介质。一定要跟随半月板，因为它下降。要添加新鲜的介质，请触摸与中拉回水一侧的井壁上的移液器尖端，并在井壁上轻轻添加新鲜的介质，使其缓慢地流下墙壁。
4. 要回收有机物，使用宽口移液器轻轻上下移液。这将允许有机物从微井中出来。
5. 收集有机物，用PBS清洗，修复并执行生殖细胞标记（UCH-L1）、血清细胞标记物（GATA结合蛋白4-GATA4）、管状肌体细胞标记（β-平滑肌蛋白-SMA）和莱迪格细胞标记（细胞色素）的免疫细胞化学P450-CYP450）如^描述12，并在共聚焦显微镜下可视化。

结果

从微孔中自组织成球体的1周老猪睾的分离细胞（图1A，图2），具有划定和独特的外部（显性上皮）和内部隔间（插曲） （图 1B，图 2）.两个隔间由胶原蛋白 IV^+ve基底膜隔开。UCH-L1^+ve生殖细胞和GATA4+saSertoli细胞位于地下室膜的外部隔间内（

讨论

我们已经建立了一个简单的方法，允许一致，可重复地生成大量的睾丸器官与组织结构，类似于睾丸在^体内12。该方法是利用猪睾细胞开发的，但更广泛地适用于小鼠、非人类灵长类动物和人类睾^人。已报告生产睾丸类有机^{物8、9、10、11}的多种不同方法。Baert等人通...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049