הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל

Summary

לכאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדור הניתן להתרבות של אורגנואידים האשך של חזירי עם ארכיטקטורת רקמה ספציפית בראש באמצעות מערכת התרבות הזמינה מסחרית למיקרוגל.

Abstract

אורגנואידים הם שלושה מבנים ממדיים המורכב מסוגי תאים מרובים המסוגלים ללכוד את ארכיטקטורת הרקמה ופונקציות של איברים בvivo. היווצרות אורגנואידים פתחה שדרות שונות של מחקר בסיסי וטרנסלייתי. בשנים האחרונות, אורגנואידים האשכים צברה עניין בתחום ביולוגיה של הגבר הרבייה. אורגנואידים האשכים לאפשר את המחקר של אינטראקציות תא תא, התפתחות רקמות, ואת התא הנבט נישה מיקרואקולוגיה ולהקל על התפוקה הגבוהה של סמים והקרנות רעילות. שיטה נדרשת באופן אמין ומתוכשל ליצור אורגנואידים האשכים עם הרקמה הספציפית של רקמת רקמות. מערכת התרבות של המיקרוגל מכילה מערך צפוף של המיקרוגל בצורת פירמידה. תאים האשכים נגזר מפני האשכים pubertal הם centrifuged לתוך המיקרוגל האלה ותרבותי כדי ליצור אורגנואידים האשכים עם ביקורות-הרקמה הספציפית בדיקות ואגודות תאים. בתהליך זה ניתן ליצור אלפי אורגנואידים אחידים. הפרוטוקול המדווח כאן יהיה עניין נרחב לחוקרים הלומדים רבייה גברית.

Introduction

בשנים האחרונות, היתה תחייה של עניין באורגנואידים תלת ממדיים. איברים שונים כגון המעי¹, בטן², הלבלב^3,4, הכבד⁵, ואת המוח⁶ נגזר בהצלחה לתוך 3d מערכות אורגאיד. לאורגנואידים אלה יש דמיון אדריכלי ופונקציונלי לאיברים בvivo והם רלוונטיים יותר ביולוגית לחקר מיקרואקולוגיה של רקמות מאשר מערכות התרבות⁷. כתוצאה מכך, מארגני האשכים החלו לקבל ריבית כמו גם^8,9,10,11,12. רוב השיטות שדווחו עד כה מורכבות, תפוקה שאינה גבוהה¹⁰ ודורשות תוספת של חלבונים ecm^8,10. מורכבות זו גם מובילה לבעיות עם התוכסות. שיטה פשוטה ומקיימת צורך שמאפשר את הדור של אורגנואידים האשכים עם שיוכי תאים שהם כמו ביקורות של vivo.

לאחרונה דיווחו על מערכת שתפנה לדרישות הללו¹². בעזרת החזיר כמודל, העסקנו גישה. לצבירת כפייה גלית במערכת המיקרוגל במערכת המיקרוגל, כל הבאר מכילה מספר רב של מערך המיקרוגל הקטן יותר¹³. זה מאפשר את הדור של מספר רב של מידות בגודל אחיד. מערכת המיקרוגל אפשרה דור של מספר רב של ממדים אחידים עם ארכיטקטורה ספציפית. המערכת פשוטה ואינה דורשת תוספת של חלבונים מבית ECM.

Protocol

הערה: האשכים מ 1-שבוע החזרזירונים התקבלו מחוות חזיר מסחרית כתוצר לידי מסירוס של חזירים מסחריים. המקור של האשכים אושרה על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים באוניברסיטת קלגרי.

1. הכנת פתרונות אנזימים לעיכול רקמות

הערה: יש צורך בשלושה פתרונות אנזימטיים שונים, הכוללים שתי פתרונות לקולגן שונים (פתרון A, B) ופתרון deoxyribonuclease I (DNase I).

1. כדי להכין את הפתרון A, לפזר 20 מ"ג של הקולגן של העירוי (טבלת חומרים) ו 40 מ"ג של הקולגן של הרביעי W (טבלת חומרים) ב 25 מ ל של בינונית הנשר השונה של Dulbecco של מדיום (dmem). לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22. הוסף 0.4 mL של סרום העוברי (FBS) כדי פתרון A כדי לעכב טריפסין פעילות.
2. כדי להכין פתרון B, לפזר 80 מ"ג של הקולגן הרביעי W (לוח חומרים) ב 40 ML של dmem. לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22.
3. כדי להכין פתרון DNase I (7 מ"ג/mL), לפזר 70 מ"ג של DNase I ב 10 מ ל של d,. לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22.
   הערה: ריכוז האנזים לפתרונות הקולגן המתואר כאן, משתנה מהריכוזים (2 מ"ג/mL) המופיעה בסעיף¹⁴המקורי. הפרוטוקול הנוכחי מניב תאים עם יכולת קיום מעט גבוהה יותר. עם זאת, תאים מבודדים על ידי שני הפרוטוקולים לייצר אורגנואידים עם ארכיטקטורה זהה רקמה.

2. רקמת עיכול אנזימטית

1. לאסוף את האשכים לתוך הגביע סטרילי ולשטוף עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). לאחר כביסה, להעביר את האשכים לצלחת התרבות 100 מ"מ רקמות עם PBS המכיל 1% P/S ולהסיר את הוגיניקה ואת האפידיאמיס באמצעות מספריים בלוק מלקחיים. להעביר את האשכים מבודדים למנה חדשה 100 mm ולשטוף ביסודיות עם PBS המכיל 1% P/S.
2. כדי לשמור על עקרות, להשתמש בקבוצה אחרת של מספריים סטרילי מלקחיים לקלף את האשך האשכים מתוך אלבומין המנהרה. חותכים את האשכים לאורך ציר האורך ישירות מתחת tunica. לאחר מכן לקלף את האשכים מתוך tunica באמצעות שני מלקחיים ומקום לתוך מנה חדשה 100 mm המכיל 1 mL DMEM זיכרון עם 1% P/S.
3. האוהב את האשכים קלופות עם מספריים סטרילי לתוך 1-2 מ"מ חתיכות רקמה. לאחר חיתוך, השתמש מלקחיים סטרילי להסיר שברי לבן של רקמת החיבור.
4. להעביר את חתיכות הרקמה הטחון לתוך פתרון A ולמעלה עד 50 mL עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 0.4 mg/mL עבור הקולגן הרביעי (טבלת חומרים) וריכוז של 0.8 Mg/ml עבור הקולגן הרביעי W (טבלת חומרים). פתרון מקום A המכיל את חתיכות הרקמה לתוך אמבטיה מים 37 ° c עבור 30 דקות, בעדינות להפוך את הצינורות כל 5 דקות ולבדוק חזותית עבור שחרורו של ה-DNA.
   1. הוסף 500 μL של DNase I אם ה-DNA צף בחינם הוא נצפתה. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות ולהיפטר supernatant.
      הערה: הדנ א יופיע כחומר מעונן. כאשר הצינורות מזועזעת, את חתיכות הרקמה להתיישב בעוד ה-DNA היה לצוף.
5. הוסף פתרון B לצינור העליון עד 50 mL עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 1.2 mg/mL של הקולגן הרביעי W (טבלת חומרים). מניחים את הצינור לתוך 37 אמבט מים ° c עבור 30 דקות ובעדינות להפוך את הצינור כל 5 דקות. הוסף 500 μL של DNase אני אם ה-DNA צף בחינם הוא נצפתה.
6. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות. לאחר מכן לבטל את הסופרנטנט ולשטוף פעם אחת עם PBS 1% P/S.
   הערה: הסופרנטטים שנזרקו מהפתרון A ו-B יכילו בעיקר תאים ביניים.
7. במעלה הצינור עם הערוץ הגבוה עד 50 mL. בזהירות לאסוף את tubules מן החלק העליון ומקום לתוך צינור חדש 50 mL.
   הערה: שברי הרקמה הגדולה והבלתי מתעכל מתפשרים במהירות בתחתית, ואילו tubules מתעכלים יישארו בהשעיה. אין לאסוף שברי רקמות גדולים. הליך זה יכול לחזור מספר פעמים עד הפתרון בצינור המקורי הוא כמעט ברור רק שברי רקמות לא מתעכל נשאר, אשר ניתן להיפטר.
8. צנטריפוגה את tubules ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות ולהיפטר supernatant. הוסיפו שוב את הערוץ החדש והצנטריפוגה. חזור על שלב השטיפה פעמיים.
9. לאחר השטיפה האחרונה של ה-PBS, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הטוטטוספסים ב-5 מ ל של PBS. לאחר מכן, הוסף 15 מ ל של 0.25% טריפסין-אתילליאדיאמטהחומצה (EDTA) כדי tubules. הניחו את הצינור באמבט המים 37 ° c והיפוך עדין כל 2 דקות. אם הרבה בחינם צף DNA הוא נצפתה, להוסיף 500 μL של DNase I עם 5 מ ל של Dזיכרון.
10. הערכת העיכול האנזימטי של tubules לתאים בודדים מתחת למיקרוסקופ (הראשון אחרי 5 דקות, ואז כל 2 דקות). אם בעיקר תאים בודדים ניתן לזהות, לעצור את התגובה עם 5 מ ל של fbs ולסנן דרך רשת 70 יקרומטר ולאחר מכן באמצעות רשת 40 יקרומטר.
    הערה: הטיפול צריך להילקח כי הכובעים על הצינורות 50 mL המשמשים לעיכול (פתרון A, B ו 0.25% טריפסין-EDTA) הם התהדקו כראוי. אם זיהום באמבט מים היא דאגה, סרט פרפין עשוי להיות עטוף סביב כובע כדי להבטיח עקרות.
11. צנטריפוגה את התאים היחידים ב 500 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 5 דקות, להשעות מחדש במדיום העשרה (בינונית הנשר משתנה בינוני F/12 (dmem/F12) המכיל 5% fbs ו 1% P/S) ולספור את מספר תאים קיימא. זוהי אוכלוסיית התא ההתחלתית. תקן 100 x 10³ תאים ולבצע האימונולוציטוכימיה עבור תא הנבט סמן UCHL1 (אוביקוויב C-טרמינל הידרוקלז L1) כמתואר¹² ולקבוע את אחוז התאים הנבט באוכלוסייה זו מתחיל תא.
    הערה: תא נבט סמן פרוילציטים חלבון לוקמיה האצבע אבץ (PLZF)¹⁵ יכול לשמש גם כחלופה מתאימה UCHL1. באוכלוסיית התא ההתחלתי, תפוקת התאים הצפויה היא סביב 700-800 x 10⁹/g של רקמות. אחוז תאי הנבט באוכלוסיית תאים זו צריך להיות 4-5%.
12. מניחים סביב 20 x 10⁶ של האוכלוסייה ההתחלתית הזאת בשני מצורף נמוך במיוחד 100 מ"מ מנות פטרי (10 x 10⁶ תאים הושעה 10 מ ל/F12 המכיל 1% P/S בכל מנה) עבור 2 ימים בחממה תרבות רקמה (37 ° c , 5% CO₂, 21% חמצן). בצע את תא הנבט העשרה עם התאים הנותרים.
    הערה: כדי להבטיח את הכדאיות האופטימלית ואת איכות התאים, בעוד תא הנבט העשרה והקוונפיקציה הבאה מתרחשת, אוכלוסיית התא המתחיל ממוקם בתרבות של מנות מצורף מאוד נמוך ברקמת העור במשך יומיים.

3. העשרה לתאי נבט

הערה: ההליך המתואר לעיל תשואות בעיקר תאים Sertoli ותאי נבט. תכונות הדבקה שונות מאפשרות הפרדת תאי Sertoli ותאי נבט באמצעות ציפוי דיפרנציאלי.

1. Seed 20-25 x 10⁶ תאים של אוכלוסיית התאים המתחילים לכל 100 מ"מ ממנה התרבות הרקמה בנפח כולל של 8 מ ל של העשרה mL של בינונית (dmem/F12 עם 5% fbs ו 1% P/S) עבור ציפוי דיפרנציאלי. מניחים את התאים לתוך אינקובטור (37 ° c, 5% CO₂, 21% O₂) ואחרי 1.5 h, לוודא כי רוב התאים sertoli להצמיד לצלחת.
2. לאסוף ולשלב את supernatant (בעיקר המכיל תאי הנבט) של 2 צלחות לצלחת אחת חדשה 100 mm ולמקם אותו בחזרה לתוך החממה. אחרי 1 h, שוב לשלב את supernatant של 2 צלחות לצלחת 100 mm חדש. מניחים את הצלחות בחזרה. לתוך החממה למשך הלילה
   הערה: הסופרנטנמלים המשולבים יכילו בעיקר תאי נבט. התאים הדוניים שנזרקו יחד עם הלוחות הם בעיקר תאי האשכים הסומטיים כגון Sertoli ו peritubular myoid תאים.
3. לאסוף את תאי הנבט מועשר בשני שברים כדלקמן.
   הערה: תאי הנבט מועשר לדבוק באופן שונה, שבר לא מחסיד ושבריר דבקה מעט. שני השברים האלה מהווים את אוכלוסיית תאי הנבט המועשרת
   1. שבר לא מחסיד: לאסוף את הסופרנטאנט.
   2. שבר במקצת חסיד: לשטוף את הצלחות בעדינות עם PBS, לטפל עם 2 מ ל של 1:20 דילול של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את התגובה עם 2 מ ל של העשרה מדיום ולאסוף בצינור זהה כמו שבר לא חסיד.
      הערה: 0.25% טריפסין-EDTA צריך להיות מדולל עם PBS כדי לייצר מ1:20 טריפסין פתרון.
4. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות מונה התא, לתקן 100 x 10³ תאים ולבצע החיסונית של תא הנבט סמן UCHL1 כמתואר¹² ולקבוע את אחוז תאי הנבט באוכלוסיה זו מועשר תאים.
   הערה: אחוז תאי הנבט באוכלוסיית תאים זו צריך להיות לפחות 60-70%. מאז הכימיה החיסונית לכימות ידרוש יום אחד, את התאים מועשר צריך להיות ממוקם מצורף נמוך במיוחד 100 מ"מ צלחת פטרי עם DMEM/F12 שיושלם עם 1% P/S עבור המשך כדי להבטיח איכות תא אופטימלי ויכולת הכדאיות.

4. הכנת תאים לזריעה

1. כדי לקצור את הכנת התא ההתחלתי, לאסוף את supernatant בצינור 50 mL מתוך החזקה אולטרה מצורף מנות 100 מ"מ. לשטוף את הצלחות במרץ עם PBS לאסוף את התאים הדבקו. אין צורך בעיכול אנזימטי.
   הערה: חלק מתאי האשכים, בעיקר בתאי Sertoli, יכולים מעט לדבוק לוחיות ההחזקה האולטרה נמוכה.
2. לשלב את ההכנה התא ההתחלתי ותאי נבט מועשר כדי להשיג הכנה לתא עבודה המכיל 25% תאי הנבט. צנטריפוגה ב 500 x g עם בלמים 25 ° צלזיוס עבור 5 דקות, למחוק את supernatant ולהשעות את התאים בינונית היווצרות אורגאיד (Dמאמ/F12 בתוספת אינסולין 10 μg/ml, העברת 5.5 Μg/ml, סלניום 6.7 Ng/ml, 20 Ng/ml מקדם גידול באפידרמיס , 1% P/S). כוונן את צפיפות התא ל-2.4 x 10⁶ לכל mL.
   הערה: כל באר בלוחות המיקרוגל המשמשים¹³ בפרוטוקול זה הכילו 1,200 המיקרוגל.
3. השתמש בנוסחה שלהלן כדי לחשב את מספר התאים בהתאם למפורט להלן.
   מספר התאים בבאר = מספר התאים של המיקרוגל x שניתן לאשכולות עבור כל אורגנואיד.
4. כדי ליצור אורגנואידים מ 1, 000 תאים כל אחד, זרע כל עם (1,200 x 1,000 תאים כל =) 1.2 x 10⁶ תאים. כוונן את צפיפות התא בתא ההשעיה באופן שבו התאים נזרע בנפח של 0.5 mL של בינוני. עבור אורגנואידים נוצר מ 1,000 תאים כל אחד, להשתמש בצפיפות של 2.4 x 10⁶ תאים לכל mL (1.2 x 10⁶ תאים בשנת 0.5 mL).

5. הכנת המיקרוגל לקבלת תאים

הערה: כדי לוודא שהתאים אינם נצמדים למשטח המיקרוגל, התייחס לפתרון שטיפה הניתן לשטיפה הזמין לרכישה על-ידי היצרן.

1. הוסף 0.5 mL של פתרון שטיפה לכל טוב. ודא כי אין בועות אוויר לכודים בבאר. כדי להסיר בועות אוויר, אם בכלל, צנטריפוגה את הצלחת ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות.
2. שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך נמוך, כדי לוודא כי הבועות הוסרו מן המיקרוגל. אם לכודים בועות הם נצפו, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנותרים.
3. מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הטיפול הושלם, להסיר את הפתרון שטיפה ומיד לשטוף את הצלחת עם מים סטרילי או PBS. ודא כי הצלחת לא להתייבש לאחר הטיפול עם פתרון שטיפה.

6. דור של אורגנואידים האשכים

1. הוסף 0.5 mL של היווצרות אורגאיד בינונית (ללא כל התאים) כל היטב צנטריפוגה ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר כל בועות אוויר לכודים. צפו בבאר תחת מיקרוסקופ הפוך נמוך כדי לוודא כי בועות האוויר הוסרו. אם לכודים בועות הם נצפו, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנותרים.
2. הוסף 0.5 mL של ההשעיה התא עובד בעדינות לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב 500 x g עם בלמים 25 ° צלזיוס עבור 5 דקות. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי התאים מקובצים בתוך המיקרוגל.
3. להעביר את הצלחת לתוך החממה תרבות התאים והתרבות עבור 5 ימים. . לשנות חצי מהמדיום בכל יום
   1. כדי לשנות בינונית מבלי לאבד אורגנואידים, גע בעצת הפיפטה לקיר הבאר והנמך בעדינות כדי לגעת במנקוס ולמשוך לאט את המדיום. הקפידו לעקוב אחרי המאנקוס כשהוא נופל. כדי להוסיף בינונית טרייה, גע בעצת הפיפטה לקיר של הבאר באותו צד של הנסיגה הבינונית והוסף בעדינות בינוני טרי לקיר הבאר ומאפשר לו לזרום לאט במורד הקיר.
4. כדי לשחזר את האורגנואידים, בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה בפה רחב. זה יאפשר לאורגנואידים. לצאת ממיקרוגל
5. לאסוף את האורגנואידים, לשטוף עם PBS, לתקן ולבצע אימונוציטוכימיה לסמן תא הנבט (בL1), מסמן תא Sertoli (החלבון כריכה מחייב 4-GATA4), peritubular מסמן התא myoid (α-חלקה שריר Actin-αSMA) ו ליידיג סמן תא (ציטוכרום P450-CYP450) כמתואר¹² והמחש במיקרוסקופ קונפוקלית וקד.

תוצאות

תאים מבודדים מ 1-שבוע האשכים חזירי שהיו מתורבתים במיקרוגל עצמי מאורגן לתוך spheroids (איור 1A, איור 2), עם החיצוני הנבדל ונפרד (אפיתל הרקמות) ותאי פנים ( interstitium) (איור 1ב, איור 2). שני התאים היו מופרד?...

Discussion

הקמנו שיטה פשוטה המאפשרת את עקבית, הדור לשחזור של מספר גדול של אורגנואידים האשכים עם אדריכלות רקמות דומה להעיד ב vivo¹². בעוד הגישה פותחה באמצעות תאי התפיסה של חזירי, היא ישימה יותר באופן כללי גם על העכבר, הפרימטים הלא אנושיים ו-האדם¹². מספר שיטות שונות דווחו להפקת אור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish	Corning	#CLS3262
100 mm tissue culture dish	Corning	#353803
Aggrwell 400	Stemcell Technologies	#34411
Anti-Adherence Rinsing Solution	Stemcell Technologies	#07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	#C5138	referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington	Worthington-Biochem	#LS004189	referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	#DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12	Gibco	#11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	#D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	#D8537
Epidermal Growth Factor	R&D Systems	#236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm	FisherScientific	#352350
Falcon Cell Strainers 40 µm	FisherScientific	#352340
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	#12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	#41400-045
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	#P4333
Porcine testicular tissue	Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit	Millipore	#SCGP00525
Trypsin-EDTA	Sigma	#T4049