Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

Resumen

Se describe un método fiable y fácilmente reproducible para la preparación de nanocúmulos de oro fotoluminiscente de emisión de infrarrojo cercano funcional y y su detección directa dentro de las células de HeLa mediante citometría de flujo y microscopía de escaneo láser confocal.

Resumen

Durante la última década, los nanoclusters de oro fluorescente (AuNCs) han sido testigos de una creciente popularidad en aplicaciones biológicas y se han dedicado enormes esfuerzos a su desarrollo. En este protocolo, se ha descrito en detalle un método fácil recientemente desarrollado para la preparación de AuNCs de emisión de infrarrojo cercano solubles en agua, biocompatibles y coloidialmente estables. Esta síntesis química de temperatura ambiente y de abajo hacia arriba proporciona ACN fácilmente funcionalizables tapados con ácido tiotable y polietilenglicol modificado con tio en solución acuosa. El enfoque sintético no requiere disolventes orgánicos ni intercambio de ligandos adicionales ni un amplio conocimiento de la química sintética para reproducirse. Los AuNC resultantes ofrecen ácidos carboxílicos de superficie libre, que se pueden funcionalizar con varias moléculas biológicas que llevan un grupo libre de aminas sin afectar negativamente a las propiedades fotoluminiscentes de los ACN. También se describió un procedimiento rápido y fiable para la cuantificación citométrica de flujo y la toma microscópica confocal de la toma de AuNC por las células de HeLa. Debido al gran cambio de Stokes, es necesario ajustar adecuadamente los filtros en la citometría de flujo y la microscopía confocal para la detección eficiente de fotoluminiscencia de infrarrojo cercano de los ACN.

Introducción

En la última década, nanoclusters de oro fotoluminiscente ultrapequeños (2 nm) han surgido como sondas prometedoras tanto para la investigación fundamental como para aplicaciones prácticas^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}. Sus muchas características deseables incluyen alta fotoestabilidad, máxima de emisión ajustable, largos ciclo de emisión, grandes cambios Stokes, baja toxicidad, buena biocompatibilidad, aclaramiento renal y bioconjugación fácil. Los AuNC PL pueden proporcionar fotoluminiscencia desde el azul hasta la región espectral de infrarrojo cercano (NIR), dependiendo del número de átomos dentro del cluster¹¹ y la naturaleza del ligando superficial^12. Los ANAC emisores de NIR (650-900 nm) son particularmente prometedores para las imágenes in vitro e in vivo a largo plazo de células y tejidos, ya que ofrecen una alta relación señal-ruido debido a una mínima superposición con autofluorescencia intrínseca, dispersión y absorción más débiles y alta penetración de tejido de la luz NIR^13,14.

En los últimos años, se han desarrollado diversos enfoques que aprovechan las interacciones covalentes de Au-S para preparar Los ACN NIR-PL tapados con una variedad de ligandos que contienen tiol^{13,,15,,16,,17}. Para aplicaciones biomédicas, los ACN deben ser funcionalizados con un componente biológico para facilitar las interacciones vinculantes. Por lo tanto, los AuNCs con alta estabilidad coloidal que son fácilmente funcionalizables en disolvente acuoso son altamente deseables. El objetivo general del protocolo actual es describir una preparación previamente notificada de^{Los AuNC} con un grupo de ácido carboxílico funcionalizable en la superficie mediante el uso de ácido tiojal y polietilenglicol (PEG) en un entorno acuoso en detalle y su conjugación con moléculas que llevan una amina primaria siguiendo el método de acoplamiento ácido-amina. Debido a la facilidad de síntesis y alta reproducibilidad, este protocolo puede ser utilizado y adaptado por investigadores de orígenes no químicos.

Uno de los requisitos clave para las aplicaciones de los ACN en la investigación biomédica es la capacidad de observar y medir los ACN dentro de las células. Entre los métodos disponibles para monitorear la absorción de nanopartículas por células, la citometría de flujo (FCM) y la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) ofrecen métodos robustos y de alto rendimiento que permiten mediciones rápidas de la internalización de nanomateriales fluorescentes en un gran número de células^19. Aquí, el método FCM y CLSM para la medición directa y el análisis de los AuNC PL dentro de las células, sin la necesidad de disteantes adicionales, también se han presentado.

Protocolo

1. Preparación de ACN emisores de infrarrojo cercano (1)

1. Añadir 7,8 mg (37,8 m) de ácido tiojal (TA) y 60 ml de NaOH de 2 M a 23,4 ml de agua ultrapura (resistividad de 18,2 M a 25 oC) y agitar (al menos 1.000 rpm) hasta que se disuelva por completo (15-20 min). Para una disolución más rápida de TA, sonicar la mezcla. Para la síntesis, se recomienda la solución TA recién preparada.
2. Añadir 10,2 ml de HAuCl₄x 3H₂O (470 mg/ml) de solución acuosa a la solución.
3. Después de 15 min, añadir 480 ml de NaBH₄ (1,9 mg/ml) bajo agitación vigorosa (al menos 1.000 rpm) y remover la mezcla de reacción en las mismas condiciones durante la noche.
   NOTA: Recién preparar la solución NaBH₄ en agua ultrapura helada y añadir a la mezcla de reacción inmediatamente después de la preparación.
   NOTA: La síntesis de AuNCs es fácilmente escalable. Hasta 2 L de AuNCs se sintetizaron en un solo lote, sin ningún cambio en las propiedades ópticas de las partículas.
4. (Crítico) Al día siguiente, purificar la solución aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa. Sin este procedimiento de purificación, el siguiente paso no funciona correctamente.
5. Añadir el polietilenglicol terminado tiol (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 mm) a la solución, ajustar el pH a 7-7,5 y agitar la mezcla durante la noche para obtener 1. Purificar la dispersión aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa.
   NOTA: El ajuste del pH a 7-7.5 es extremadamente importante. Un pH más alto puede dar lugar a un cambio azul de la emisión máxima.

2. Conjugación de 3-(aminopropyl)bromuro de trifenilffosfano (TPP) en la superficie de 1

1. Mezclar la 1 solución (24 ml) preparada en el paso anterior y el bromuro de trifenilfosfano 3(aminopropyl)(12 mg, 30 omol). Ajuste el pH a 4,5 con 1 M HCl.
   NOTA: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) bromuro se preparó como se describe en la literatura²⁰.
2. Iniciar la reacción añadiendo un exceso de N-(3-dimetil-aminopropyl)-N-etilcarbodiimide clorhidrato (EDC - HCl) (60 mg, 312 omol). El pH de la solución aumentará y no se debe permitir que vaya más allá de 6. Controlar el pH de la mezcla de reacción durante la primera hora. Si el pH aumenta por encima de 6, reducirlo a 4.5–6 mediante la adición de 1 M HCl.
3. Revuelva la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente.
4. Purificar la dispersión aplicando tres ciclos de centrifugación/filtración utilizando un dispositivo de filtración por membrana con un corte de peso molecular de 3 kDa para obtener 2. Diluir 2 obtenido aquí con agua ultrapura al volumen inicial de 24 ml. La concentración de Au en la solución es de 200 g/ml.

3. Cultivo celular

1. Células HeLa de cultivo (colección de cultivos HPA) en el medio de águila modificado de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal en 5% CO₂ a 37 oC.
2. Divida y desvíe las celdas cuando alcancen el 80 % de confluencia. Para minimizar la adquisición de nuevos mutantes, el número de propagaciones celulares no debe exceder de 30.

4. Internalización de AuNC en las células de HeLa

1. Sembrar las células en una placa de 12 pocillos a una densidad de 20.000 celdas/ml (1 ml/pozo). El objetivo es lograr una confluencia del 50 % después de 48 h.
2. A 48 h de post-sembrado, aspirar el medio de cultivo y añadir 400 l de medio de cultivo completo (para controles no tratados) o 500 g de nanopartículas en 400 oL de medio cultivado completo (para muestras tratadas) a cada pocto. Devolver las culturas a una incubadora de 37oC.
   NOTA: La adición de grandes volúmenes de solución AuNC afecta negativamente a la viabilidad celular. Las soluciones De AuNC deben concentrarse. Así, 2 obtenidos en el paso 2.4 se concentra n.o 100 veces. 40 ml de AuNC se concentró a 400 oL. Se añadió una alícuota de 25 l de esta solución concentrada a los medios de cultivo celular de 400 ml para obtener la concentración de AuNC deseada.
3. Después de 2 h de internalización, separar las células por trippsinización estándar de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Recoger las muestras en tubos de microcentrífuga de polipropileno y centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 oC.
5. Preparar el siguiente búfer FCM: solución salina tamponada de fosfato preenfriado (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM NaH₂PO_4,pH 7.4) complementada con 2% de albúmina sérica bovina a 4 oC.
6. Lavar los pellets con 1 ml de tampón FCM y centrífuga durante 5 min a 350 x g a 4 oC.
7. Resuspenda el pellet en 500 ml de búfer FCM y almacene las muestras a 4 oC antes del análisis.

5. Análisis de citometría de flujo

1. Filtrar todas las muestras utilizando un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con una tapa de colador de celda.
2. Antes de adquirir datos utilizando el software del instrumento, especifique la configuración del catómetro.
3. Formatee todas las gráficas de puntos e histogramas para "Adquisiciones".
4. Trazar una gráfica de puntos de dos parámetros del área de dispersión hacia delante (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) para mostrar la distribución de las celdas. Para excluir dobletes, cree una gráfica de puntos de dos parámetros de altura FSC (FSC-H) frente a FSC-A. Para supervisar la intensidad relativa de la fluorescencia en la muestra, trace un histograma de un solo parámetro para el área del canal fluorescente (FL-A). Utilice una escala lineal para representar los datos FSC y SSC, y una escala logarítmica para todos los parámetros fluorescentes.
5. Adquirir muestra no tratada (sin nanopartículas) a un caudal bajo para minimizar los eventos coincidentes (si el instrumento lo permite). Durante la adquisición, ajuste los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) para obtener la población no tratada a escala en la gráfica FSC vs SSC. Si es necesario, ajuste los voltajes PMT para que el canal FL coloque la población no manchada en la esquina izquierda del histograma.
6. Seleccione la "pestaña de puerta" específica en el software y dibuje una puerta apropiada alrededor de la población deseada. Las celdas dentro de la puerta se moverán al siguiente punto de control.
7. Registre 10.000 eventos por muestra.
8. Grabe todas las muestras en la misma configuración del instrumento.
9. Utilice un programa adecuado para analizar los datos de citometría de flujo.
   NOTA: Algunas aplicaciones pueden requerir una configuración personalizada de los filtros. Para el intercambio de filtros, siga siempre las recomendaciones del fabricante en la guía del usuario.
   NOTA: El experimento se puede guardar y volver a cargar para conservar la configuración del instrumento y la estrategia de gating.
   NOTA: Una gráfica de altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a área de dispersión lateral (SSC-A) también se puede utilizar para la exclusión de doblete. Este tipo de gating puede ser más sensible, ya que el detector FSC no suele ser una PMT.

6. Internalización de 2 en las células HeLa para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM)

1. Sembrar las células en un plato inferior de 4 cámaras de 35 mm a una densidad de 250.000 células/ml (0,5 ml/cámara). Mantener la cámara en una incubadora de 37oC con un 5% de atmósfera de_CO2. El objetivo es lograr una confluencia del 50 % después de las 24 h.
2. A 24 h de postsiembra, añadir 100 g de 2 (o 10 l de la solución en stock de 10 mg/ml) a cada cámara de plato que contenga 0,5 ml de medio con las células (para muestras tratadas).
3. Devuelva el plato a la incubadora. Deje que las celdas internalicen los AuNC durante 24 horas antes de usarlas para CLSM.
4. Después del período de internalización, deseche el medio y lave las celdas con un medio fresco precalentado durante 5 min. Repita el paso de lavado una vez más. A continuación, llene cada cámara con 800 ml de medio fresco.

7. CLSM Imaging de células Hela vivas etiquetadas con 2

1. Para las imágenes microscópicas, utilice la lente objetivo de aceite 63x (n a 1.518) (NA a 1,4) en un microscopio confocal con Plan-Apochromat.
2. Montar el plato en la etapa invertida del microscopio con la cámara calentada a 37 oC y suministrada con una atmósfera humidificada de 5%_CO2.
3. Para detectar AuNC internalizado, utilice un láser de 405 nm a una potencia del 2% con un divisor de haz adecuado. Establezca el rango de longitudes de onda de detección entre 650 y 760 nm.
4. Establezca la resolución de la imagen en 2048 x 2048 píxeles. En el ajuste de velocidad de adquisición, apunte a un tiempo de permanencia de píxeles alrededor de 4 s. Adquiera la imagen con un promedio de 2 veces (modo de línea, media del método de promediación). Ajuste el agujero en 1 unidad airy (para luz de 405 nm). Para una mayor sensibilidad, utilice el modo de recuento de fotones.
5. Para una correcta iluminación en la luz transmitida con contraste de interferencia diferencial (DIC), utilice el ajuste del condensador y el tope de campo de la marca de campo. Para la adquisición de luz transmitida, utilice un láser de 488 nm a una potencia del 0,7% sin ningún detector de fluorescencia asignado. Establezca un divisor de haz adecuado para la longitud de onda láser.
6. Adquirir dos imágenes para cada pista (fluorescencia roja y DIC). Rastrear AuNCs por su fluorescencia roja; los límites de las células se determinan fácilmente en la luz transmitida con imágenes DIC.

Resultados

Los AuNC NIR PL se prepararon a partir de Au³⁺ en presencia de TA, y luego PEG terminado tiol (MW 2.000) se asolidó en la superficie AuNC para obtener 1 siguiendo el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 1. Acoplamiento amida entre 1 y 3-(aminopropyl) bromuro de trifenilffosfano (TPP) proporcionado 2. Como era de esperar, los espectros de absorción(Figura 2a) indicaron que los ACN 1

Discusión

Los AuNc emisores de NIR se sintetizaron utilizando un enfoque de abajo hacia arriba en el que la solución precursora de oro (HAuCl₄) fue tratada con ligandos tiol adecuados, seguido de una reducción de Au^3+. La reducción de los iones metálicos en la solución acuosa tiende a agregar y da como resultado nanopartículas grandes en lugar de NCs ultrapequeños^21. Para preparar AuNCs PL ultrapequeños (2 nm), se ajustaron las condiciones sintéticas para evitar la formación ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	TCI Chemicals	D1601	https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4161	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	15130-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98%	Alfa Aesar	L04711	https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35%	PENTA s.r.o.	19350-11000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min	Alfa Aesar	36400	https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000	Sigma-Aldrich	743127	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride	PENTA s.r.o.	16200-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride	PENTA s.r.o.	16610-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	12330-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets	PENTA s.r.o.	15740-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)	Thermo Fisher Scientific	X12223	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223