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要約

可動性の高い、近赤外線発光光発光金ナノクラスターの調製法と、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡によるHeLa細胞内での直接検出の信頼性と再現性の高い方法について説明する。

要約

過去10年間、蛍光金ナノクラスター(AuNC)は生物学的用途で人気が高まっており、その開発に多大な努力が注がれてきました。本プロトコルでは、水溶性、生体適合性、およびコロイド的に安定な近赤外線発光AuNCの調製のための、最近開発されたファシリティ法が詳細に説明されている。この室温、ボトムアップ化学合成は水溶液のチオクチン酸およびチオール修飾ポリエチレングリコールで覆われた容易に機能可能なAuNCを提供する。合成アプローチでは、有機溶剤や追加のリガンド交換も、合成化学の広範な知識も必要ありません。結果として得られたAuNCは、フリー表面カルボン酸を提供し、AuNCの光発光特性に悪影響を及ぼすことなく、遊離アミン基を有する様々な生体分子で機能化することができる。HeLa細胞によるAuNC取り込みのフロー細胞量定量および共焦点顕微鏡イメージングのための迅速で信頼性の高い手順についても説明した。ストークスシフトが大きいため、AuNCの近赤外光発光を効率的に検出するには、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡におけるフィルタの適切な設定が必要です。

概要

過去10年間で、超小型(≤2 nm)光発光金ナノクラスター(PL AuNC)は、基礎研究と実用的な,,アプリケーション1、2、3、4、5、6、7、8、9、102,の両方の有望なプローブとして登場9,10しました3,4,5。6,78,1彼らの多くの望ましい特徴は高い写真安定性、調整可能な放出の極大さ、長い放出の寿命、大きいストークスのシフト、低い毒性、良い生物適合性、腎クリアランスおよびファシリティバイオコンジュゲーションを含んでいる。PLのAuNCは、青色から近赤外(NIR)スペクトル領域までの光発光を提供することができ、クラスター11内の原子の数および表面リガンド12の性質に応じて異なる。NIR(650-900 nm)を発するAUNCは、細胞および組織の長期的なインビトロおよびインビボイメージングにおいて特に有望であり、内在自家蛍光との重なりが最小、散乱と吸収の弱さ、およびNIR光13、14,14の高い組織浸透による高いシグナル対雑音比を提供する。

近年、種々のチオール含有リガンド13、15、16、17を用いたNIR-PL AuNCを調製するために15,16,17、Au-S共有結合相互作用を利用する様々なアプローチが開発されている。生物医学の応用のために、AuNCは結合相互作用を促進するために生物学的なコンポーネントによって機能化されなければならない。従って、水性溶媒中で容易に機能可能な高いコロイド安定性を有するオーNCが非常に望ましい。現在のプロトコルの全体的な目標は、水性環境下でチオクチン酸およびポリエチレングリコール(PEG)を詳細に採用し、酸アミンカップリング法に従って一次アミンを持つ分子との結合を使用して、表面に機能可能なカルボン酸基を有するAuNCの以前に報告された18の調製を記述することです。合成が容易で再現性が高いため、このプロトコルは非化学の背景を持つ研究者が使用し、適応することができます。

生物医学研究におけるAuNCの応用に必要な重要な条件の1つは、細胞内のAuNCを観察し測定する能力です。細胞によるナノ粒子の取り込み監視に利用できる方法のうち、フローサイトメトリー(FCM)および共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、多数の細胞19における蛍光ナノ材料の内在化を迅速に測定できる、堅牢で高スループットな方法を提供する。ここで、細胞内のPL AuNCを直接測定および分析するためのFCMおよびCLSM法は、追加の染料を必要とせず、また提示されている。

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プロトコル

1. 近赤外線発出オーNCの準備 (1)

  1. 7.8 mg(37.8 μmol)チオクチン酸(TA)と2M NaOHの60 μLを23.4mLの超純水(25°Cで抵抗率18.2 MΩ.cm)に加え、完全に溶解するまで(少なくとも1,000rpm)(少なくとも1,000rpm)をかき混ぜます(〜15〜20分)。TAの迅速な溶解のために、混合物を超音波処理します。合成には、作りたてのTA溶液が推奨される。
  2. 10.2 μL の HAuCl4・3H2O (470 mg/mL) の水溶液を溶液に加えます。
  3. 15分後、激しい撹拌(少なくとも1,000rpm)下でNaBH 4(1.9mg/mL)480μLを加え、同じ条件下で反応混合物を一晩攪拌します。4
    注:新鮮な氷冷超純水でNaBH4溶液を調製し、調製後すぐに反応混合物に追加します。
    メモ: AuNC の合成は容易にスケーラブルです。最大2LのAuNCを単一バッチで合成し、粒子の光学特性に変化を起じることなく行った。
  4. (クリティカル)翌日、分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して溶液を浄化する。この精製手順がなければ、以下の工程が正常に動作しない。
  5. チオール終端ポリエチレングリコール(MW 2,000;15.6 mg;7.8 μmol)を溶液に加え、pHを7~7.5に調整し、混合物を一晩攪拌して1を得る。分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して分散液を浄化する。
    注: 7-7.5 への pH の調整は非常に重要です。pHが高いほど、発光マキシマの青いシフトが生じる可能性があります。

2. 1の表面に3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)の結合

  1. 前工程で調製した溶液1(24mL)と3-(アミノプロピル)臭化トリフェニルホスホニウム(12mg、〜30μmol)を混合します。1 M HCl で pH を 4.5 に調整します。
    注:3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)ブロマイド塩は文献20に記載されているように調製した。
  2. N-(3-ジメチル-Nアミノプロピル)-N'エチルカルボジジミド塩酸塩(EDC·HCl)(60mg、312 μmol)。溶液のpHは増加し、6を超えて行くことを許されるべきではない。反応混合物のpHを最初の1時間監視する。pH が 6 を超える場合は、1 M HCl を追加して 4.5 ~ 6 に減らします。
  3. 反応混合物を室温で一晩かき混ぜる。
  4. 分子量カットオフ3kDaの膜濾過装置を用いて3サイクルの遠心分離/ろ過を適用して分散液を精製し、2を得る。ここで得られた2を超純水で24mLの初期体積に希釈する。溶液中のAuの濃度は200 μg/mLである。

3. 細胞培養

  1. ダルベッコの修飾されたイーグルの培地における培養HeLa細胞(HPA培養コレクション)は、37°Cで5%CO2で10%の胎児ウ2シ血清を添加した。
  2. 彼らは約80%合流に達したときに細胞を分割し、通過します。新しい変異体の獲得を最小限に抑えるために、細胞の伝播数は30を超えてはならない。

4. HeLa細胞へのAuNCの内部化

  1. 20,000細胞/mL(1 mL/ウェル)の密度で12ウェルプレートに細胞を播種します。目標は、48時間後に〜50%の合流を達成することです。
  2. 48時間のポストシードで、培養培地を吸引し、400μGの完全な培養培地(未処理のコントロール用)または500μgのナノ粒子を400μLの完全培養培地(処理サンプル用)に各ウェルに加えます。培養物を37°Cインキュベーターに戻します。
    注:大量のAuNC溶液を添加すると、細胞の生存率に悪影響を及ぼします。AuNCソリューションは集中する必要があります。このようにしてステップ2.4で得られた2は100回濃縮される。40 mL AuNCを400μLに濃縮した。この濃縮溶液の25μLアリコートを400μLの細胞培養培地に添加し、所望のAuNC濃度を得た。
  3. 2時間の内部化後、メーカーのプロトコルに従って標準的なトリプシン法によってセルを取り外します。
  4. 4 °Cで350 x gで5分間、ポリプロピレンマイクロ遠心分離管と遠心分離機でサンプルを収集します。
  5. 次のFCMバッファーを準備する:4°Cで2%ウシ血清アルブミンを補充する前冷やしたリン酸緩衝生理(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM Na2HPO 4、1.47 mM NaH2PO4、pH7.4)を補充した。4
  6. 4°Cで350 x gで5分間、FCMバッファーと遠心分離機の1 mLでペレットを洗浄します。
  7. 500 μLのFCMバッファーでペレットを再懸濁し、分析前にサンプルを 4 °C に保存します。

5. フローサイトメトリー解析

  1. セルストレーナーキャップ付き5 mLポリスチレンラウンドボトムチューブを使用して、すべてのサンプルをフィルターします。
  2. 計測器ソフトウェアを使用してデータを取得する前に、サイトメーターの構成を指定します。
  3. 「取得」のすべてのドットプロットとヒストグラムをフォーマットします。
  4. 前方散乱領域(FSC-A)と側面散乱領域(SSC-A)の2パラメータのドットプロットをプロットして、セルの分布を示します。ダブレットを除外するには、FSC 高さ (FSC-H) と FSC-A の 2 パラメータのドット プロットを作成します。サンプル中の相対的な蛍光強度を監視するには、蛍光チャネル領域(FL-A)の単一パラメータヒストグラムをプロットします。線形スケールを使用して、FSC および SSC データを表現し、すべての蛍光パラメータの対数スケールを使用します。
  5. 一致する事象を最小限に抑えるために、未処理のサンプル(ナノ粒子を含まない)を低い流量で取得し(機器で許可されている場合)取得中に、光増倍管(PMT)電圧を調整して、FSCとSSCプロットで未処理の母集団をスケールで取得します。必要に応じて、FL チャンネルの PMT 電圧を調整して、染色されていない母集団をヒストグラムの左隅に配置します。
  6. ソフトウェア内の特定の「ゲートタブ」を選択し、希望の人口の周りに適切なゲートを描画します。ゲート内のセルは次のチェックポイントに移動します。
  7. サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録します。
  8. すべてのサンプルを同じインストゥルメント設定で記録します。
  9. フローサイトメトリーデータを分析するには、適切なプログラムを使用します。
    注: アプリケーションによっては、フィルタのカスタマイズが必要な場合があります。フィルタ交換については、常にユーザーガイドの製造の推奨事項に従ってください。
    メモ:実験を保存して再ロードして、計測器の設定とギャッティング戦略を保存することができます。
    注: 横散乱高さ(SSC-H)と側散乱領域(SSC-A)プロットは、ダブル除外にも使用できます。このタイプの格紙は、通常はPMTではないため、より感度が高くなる可能性があります。

6. 共焦点レーザー走査顕微鏡用HeLa細胞への2の内部化(CLSM)

  1. 250,000セル/mL(0.5 mL/チャンバー)の密度で4チャンバーガラス底35mm皿に細胞を播種します。チャンバーを5%CO2雰囲気の37°Cインキュベーター2に入れます。目標は、24時間後に〜50%の合流を達成することです。
  2. 24時間のポストシードで、細胞と一緒に0.5 mLの培地を含む各皿チャンバーに2の100 μg(または10 mg/mLのストック溶液から10 μL)を加えます(処理されたサンプル用)。
  3. 皿をインキュベーターに戻します。細胞は、CLSM用に使用する前に24時間、AuNCを内部化します。
  4. 内在化期間の後、培地を捨て、あらかじめ温めた新鮮な培地で細胞を5分間洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。その後、各チャンバーに800 μLの新鮮な培地を充填します。

7. 2で標識された生きたヘラ細胞のCLSMイメージング

  1. 顕微鏡イメージングの場合は、プラン・アポクロマトと共焦点顕微鏡で63x油(n = 1.518)対物レンズ(NA = 1.4)を使用してください。
  2. チャンバーを37°Cに温め、加湿した5%CO2雰囲気を供給して、顕微鏡反転ステージに皿を2取り付けます。
  3. 内部化されたAuNCを検出するには、適切なビームスプリッターを備えた2%のパワーで405 nmレーザーセットを使用します。検出波長の範囲を650~760nmの範囲に設定します。
  4. 画像の解像度を 2048 x 2048 ピクセルに設定します。取得速度設定では、4 μs前後のピクセルドウェル時間を目指し、2x平均(ラインモード、平均法平均平均)で画像を取得します。ピンホールを1つのエアリーユニット(405 nm光用)に設定します。高感度を設定するには、フォトンカウントモードを使用します。
  5. 差動干渉コントラスト(DIC)を用いた透過光の照明を正しく行う場合は、ケーラーのコンデンサとフィールドストップの設定を使用します。透過光の取得には、蛍光検出器を割り当てずに0.7%の電力で488nmレーザーを使用してください。レーザー波長に適したビームスプリッタを設定します。
  6. 各トラック(赤蛍光とDIC)の2つの画像を取得します。彼らの赤い蛍光によってAuNCを追跡します。細胞境界はDICの写真と透過光の中で容易に決定される。

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結果

NIR PL AuNCは、TAの存在下でAu3+から調製され、次いで、チオール終端PEG(MW 2,000)をAuNC表面に結合し、図1に示すワークフローに従って1を得た。1と3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)ブロマイドの間のアミニックカップリングは2.予想通り、吸収スペクトル(図2a)は、AuNC11および

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ディスカッション

NIR発光AuNCは、金前駆体溶液(HAuCl4)を適切なチオールリガンドで処理し4、続いてAu3+の還元を行うボトムアップアプローチを用いて合成した。水溶液中の金属イオンの還元は凝集する傾向があり、超小型NC21ではなく、大きなナノ粒子をもたらす。超小型(≤2 nm)PL AuNCを調製するために、合成条件を調整して大きな粒子の形成を防止し、超小クラスターの形成を?...

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開示事項

メソッドと結果のいくつかの部分は、プラマニクら18の記事で以前に提示された、ここで、これらの方法は、実用的なポイントバイポイントプロトコルに変換されています。著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

著者らは、アルツベタ・マグドルレノワのフローサイトメトリーの助けに感謝している。著者らは、GACRプロジェクトNr.18-12533Sからの財政的支援を認めている。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算が共同出資した共焦点・蛍光顕微鏡研究所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ.2.16/3.1.00/21515、およびチェコバイオイメージング大RIプロジェクトLM2015062によってサポートされています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochlorideTCI ChemicalsD1601https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4161https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydratePENTA s.r.o.15130-31000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98%Alfa AesarL04711https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35%PENTA s.r.o.19350-11000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% minAlfa Aesar36400https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000Sigma-Aldrich743127https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloridePENTA s.r.o.16200-31000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydrideSigma-Aldrich452882https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloridePENTA s.r.o.16610-31000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydratePENTA s.r.o.12330-31000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pelletsPENTA s.r.o.15740-31000https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)Thermo Fisher ScientificX12223https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

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