Aumento de la durabilidad de cultivos de células neurales disociadas utilizando matriz coralina biológicamente activa

Resumen

El cultivo celular disociado del hipocampo es una herramienta experimental fundamental en neurociencia. La supervivencia y función de las células neuronales en cultivo se mejora cuando los esqueletos coralinos se utilizan como matrices, debido a sus funciones neuroprotectoras y neuromoduladoras. Por lo tanto, las células neuronales cultivadas en la matriz coralina muestran una mayor durabilidad y, por lo tanto, son más adecuadas para el cultivo.

Resumen

Los cultivos de células neuronales y gliales disociadas del hipocampo son un modelo experimental valioso para estudiar el crecimiento y la función neuronal, ya que proporcionan un alto aislamiento celular y un entorno controlado. Sin embargo, la supervivencia de las células del hipocampo in vitro se ve comprometida: la mayoría de las células mueren durante la primera semana de cultivo. Por lo tanto, es de gran importancia identificar formas de aumentar la durabilidad de las células neuronales en cultivo.

El carbonato de calcio en forma de aragonita cristalina derivada del esqueleto de los corales se puede utilizar como una matriz activa superior para cultivos neuronales. Al nutrir, proteger y activar las células gliales, el esqueleto de coral mejora la supervivencia y el crecimiento de estas células in vitro mejor que otras matrices.

Este protocolo describe un método para cultivar células del hipocampo en una matriz coralina. Esta matriz se genera uniendo granos de esqueletos de coral a platos de cultivo, frascos y cubreobjetos de vidrio. Los granos ayudan a mejorar el entorno de las células introduciéndolas en un entorno tridimensional fino (3D) para crecer y formar estructuras similares a tejidos. El entorno 3D introducido por el esqueleto de coral se puede optimizar para las células mediante molienda, lo que permite controlar el tamaño y la densidad de los granos (es decir, la rugosidad de la matriz), una propiedad que se ha encontrado que influye en la actividad de las células gliales. Además, el uso de granos facilita la observación y el análisis de los cultivos, especialmente cuando se utiliza microscopía óptica. Por lo tanto, el protocolo incluye procedimientos para la generación y optimización de la matriz coralina como una herramienta para mejorar el mantenimiento y la funcionalidad de las células neuronales in vitro.

Introducción

Los cultivos de células neurales disociadas, en este caso las células del hipocampo, son un modelo experimental valioso para estudiar el crecimiento y la función neuronal, proporcionando un alto aislamiento celular y accesibilidad ^1,2,3. Este tipo de cultivo se utiliza con frecuencia en neurociencia, desarrollo de fármacos e ingeniería de tejidos debido a la gran cantidad de información que se puede recopilar, como tasas de crecimiento y viabilidad, neurotoxicidad, crecimiento y redes de neuritas, conectividad sináptica y plasticidad, modificaciones morfológicas, organización y cableado de neuritas, etc.1,4,5,6,7.

A pesar de la importancia de los cultivos, las células cultivadas generalmente se ven obligadas a crecer en cubreobjetos de vidrio en una monocapa bidimensional. Estas modificaciones ambientales estrictas disminuyen significativamente la capacidad de las células neurales para sobrevivir en el tiempo, ya que los cubreobjetos de vidrio son sustratos no nutritivos con una baja fuerza de adhesión, exhibiendo una menor capacidad para soportar el crecimiento celular 8,9,10,11.

Debido a que las células neuronales cultivadas se ven obligadas a crecer en condiciones difíciles, un enfoque esencial para mejorar su supervivencia sería imitar su entorno natural tanto como sea posible^12,13. Esto podría lograrse mediante el uso de biomateriales que actuarán como matrices e imitarán la matriz extracelular de las células, permitiéndoles formar una estructura similar a un tejido y ayudar en su nutrición¹⁴.

El uso de biomateriales es un enfoque prometedor para mejorar los cultivos celulares, ya que actúan como andamios biocompatibles, proporcionando estabilidad mecánica y mejorando una variedad de propiedades celulares, incluyendo adhesión, supervivencia, proliferación, migración, morfogénesis y diferenciación^15,16,17. Se utilizan varios tipos de biomateriales para mejorar las condiciones de las células in vitro. Entre ellos se encuentran los biopolímeros, o componentes biológicos que suelen formar parte de la matriz extracelular de las células. Estos biomateriales se utilizan principalmente como una forma de agentes de recubrimiento polimerizados o hidrogeles^18,19,20. Por un lado, las matrices mencionadas anteriormente dan a las células un entorno 3D familiar para crecer, fomentan su adhesión al plato y les dan soporte mecánico^21,22. Por otro lado, su forma polimerizada y el confinamiento de las células dentro de hidrogeles perturba el acceso de las células a los componentes nutritivos presentes en los medios de crecimiento y también dificulta el seguimiento de las células por métodos microscópicos²³.

Los exoesqueletos de coral son matrices biológicas de origen marino. Están hechos de carbonato de calcio, tienen estabilidad mecánica y son biodegradables. Estudios previos que utilizan el esqueleto de coral como matriz para el crecimiento de células neuronales en cultivo han demostrado una adhesión mucho mayor, en comparación con los cubreobjetos de vidrio^24,25. Además, las células neurales cultivadas en el esqueleto de coral demostraron su capacidad para ingerir el calcio del que está compuesto el esqueleto, que protege las células neurales en condiciones de privación de nutrientes²⁶. Además, el esqueleto de coral es una matriz de apoyo y crianza que aumenta la supervivencia de las células neuronales, estimula la formación de redes neuronales, eleva la tasa de conectividad sináptica y permite la formación de estructuras similares a tejidos^27,28. Estudios recientes también han demostrado que la topografía superficial de la matriz del esqueleto de coral juega un papel crucial en la distribución y activación de las células gliales ^8,29. Además, el esqueleto de coral es eficaz como matriz para el cultivo de otros tipos de células, como osteocitos^30,31, hepatocitos y cardiomiocitos en cultivo (datos no publicados).

Por lo tanto, el esqueleto de coral es una matriz prometedora para el cultivo de células in vitro. Por lo tanto, el protocolo detallado a continuación describe la técnica de cultivo de células neuronales en esqueleto de coral para producir cultivos neuronales más estables y prósperos que los logrados por los métodos existentes. Este protocolo también puede ser útil para el cultivo de cardiomiocitos, hepatocitos y otros tipos de células.

Protocolo

El uso de animales en este protocolo fue aprobado por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales.

NOTA: Los esqueletos de coral carbonatados de calcio deben usarse en la forma cristalina de aragonita. Los tipos de coral probados hasta ahora para cultivos neuronales son Porites Lutea, Stylophora Pistillata y Trachyphyllia Geoffroyi. Los esqueletos se pueden comprar enteros o molidos.

1. Limpieza de las piezas del esqueleto de coral

PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos deben realizarse en una campana química a temperatura ambiente, ya que las soluciones descritas a continuación son peligrosas y pueden causar quemaduras e irritaciones.

1. Use un martillo para romper el esqueleto de coral y divídalo en fragmentos de 0.5-2 cm. Para disolver los residuos orgánicos y no orgánicos, remoje los fragmentos del esqueleto de coral en una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante 10 minutos, luego lave una vez con agua doble destilada (DDW).
2. Para eliminar los residuos orgánicos restantes, remoje los fragmentos en una solución de NaOH 1M durante 5 minutos, luego lave una vez con DDW. Continuar con la eliminación de los depósitos orgánicos remojando los fragmentos en una solución de_H2O2al 30% durante 10 min, luego lavar los fragmentos 3 veces con DDW.
3. Retire la mayor cantidad posible de DDW en exceso y deje secar los fragmentos de coral en la campana (1-8 h).

2. Limpieza de los cubreobjetos de vidrio

1. Transfiera los cubreobjetos de vidrio a una placa de Petri de vidrio de 100 mm. Agregue 10 ml de etanol al 95% durante 15 min.
2. Retire el etanol y lave con DDW 3x, esperando 10 minutos entre cada lavado. Coloque el plato en una placa calefactora precalentada a 80 °C hasta que el DDW se evapore. Revuelva suavemente los cubreobjetos dentro de la placa varias veces mientras se secan para evitar que se peguen entre sí.
3. Autoclave los cubreobjetos.

3. Preparación de granos de esqueleto de coral

1. Moler los fragmentos del esqueleto de coral usando un mortero (molienda manual) hasta que se descomponga por completo. El resultado es una mezcla de granos con tamaños que van desde 20 μm a 200 μm.
2. Alternativamente, moler los fragmentos del esqueleto de coral usando una máquina de molienda eléctrica a una velocidad de 1,000 rpm durante 30 s (longitud de la hoja = 6 cm; ancho = 0.5 cm–1.0 cm). El tamaño de grano resultante es similar al rango de tamaño producido por la molienda manual.

4. Purificación de granos de un rango de tamaño específico

NOTA: Si se desea controlar el tamaño de los granos en una matriz, utilice el siguiente procedimiento de purificación de granos basado en filtración.

1. Transfiera los granos a un filtro de malla manual o eléctrico de 40 μm.
2. Divida los granos en dos rangos específicos tamizando los granos a través del filtro (si usa un filtro eléctrico, se recomiendan las siguientes condiciones: agitación = 600 amplitudes / min, rebote = 6 / s). Este procedimiento produce dos grupos de tamaños de grano, uno <40 μm y el segundo >40 μm.
   NOTA: Los dos tamaños se pueden determinar mediante el uso de filtros de mallas variables. Si se desea un rango más restringido, vuelva a tamizar cada grupo desde el paso 4.2 a través de filtros con diferentes mallas.
3. Autoclave los granos.

5. Preparación de platos o cubreobjetos recubiertos de grano de coral

1. Para recubrir matraces o placas de Petri
   NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles.
   1. Agregue los granos del esqueleto de coral en una solución de poli-D-lisina (PDL) de 20 μg / ml disuelta en la solución de Hanks. La concentración recomendada es de 5 mg/10 mg de granos por 1 ml de solución de PDL.
   2. Verter la solución en matraces y platos (aproximadamente 2 mL/25 cm²) e incubar durante la noche a 4 °C. Los granos se hunden y se adhieren al fondo.
   3. Al día siguiente, lave los frascos y los platos una vez con DDW estéril. Deje secar los frascos y los platos en la campana.
      NOTA: Es preferible utilizar frascos y platos recién recubiertos. Los matraces y platos recubiertos pueden utilizarse hasta una semana después del recubrimiento si se conservan a 4 °C. Sin embargo, la efectividad de la matriz puede verse comprometida.
2. Cubreobjetos de vidrio de revestimiento (12 mm de diámetro, 0,17 mm de espesor)
   1. Agregue granos de esqueleto de coral a DDW en cualquier concentración deseada. Las densidades comunes utilizadas para las células neurales son 5 mg / ml y 10 mg / ml. Vierta 40 μL de la solución de grano en el centro del cubreobjetos (Figura 4).
   2. Coloque los cubreobjetos sobre una placa calefactora precalentada a 80 °C y espere a que se evapore por completo (generalmente 15 min). En estas condiciones, los granos se adhieren al cubreobjetos. Autoclave de los cubreobjetos recubiertos. Almacenar en condiciones estériles.
   3. Un día antes del cultivo, coloque los cubreobjetos en la tapa de una placa estéril de 24 pocillos. Añadir 100 μL de solución de PDL de 20 μg/ml a cada cubreobjetos. Use la punta para asegurarse de que el líquido cubra toda la región del grano y el resto de la superficie del cubreobjetos.
   4. Cubra la tapa con el fondo del plato. Envuelva los lados de las placas con película de parafina. Incubar durante la noche a 4 °C.
   5. Al día siguiente, lavar una vez con DDW y secar en la campana.
      NOTA: Es preferible utilizar cubreobjetos recién recubiertos.

6. Cultivo de células disociadas del hipocampo en cubreobjetos de vidrio recubiertos de grano del esqueleto de coral

NOTA: El método para el cultivo celular disociado del hipocampo fue modificado a partir de procedimientos previamente publicados^24,27. La preparación del cultivo se describe para cuatro cachorros de rata. El rendimiento esperado de cada hipocampo es de 1–1.5 x 10⁶ células.

1. Arreglo
   1. Preparar una placa de Petri vacía de 60 mm. Vierta 2 ml de medio esencial mínimo (MEM) en una placa de Petri de 60 mm y ponga en hielo.
   2. Vierta 2 ml de MEM en un plato de 35 mm y póngalo en una incubadora a 37 ° C, 5-10% de_CO2. Vierta 2 ml de MEM en un tubo de 15 ml y manténgalo a 4 °C.
   3. Vierta 1 ml de First Day Medium en un tubo de 15 ml y póngalo en una incubadora a 37 ° C, 5-10% de_CO2.
      NOTA: La composición del primer día medio se describe en la Tabla de materiales.
   4. Descongelar 200 μL de una solución de tripsina al 2,5% e incubar a 37 °C.
   5. Prepare tres pipetas Pasteur de vidrio con cabezas de 0,5 mm, 0,75 mm y 1,0 mm de diámetro con una llama.
   6. Prepare herramientas quirúrgicas adecuadas: una tijera grande, dos tijeras pequeñas, una pinza grande, cuatro pinzas pequeñas y un bisturí.
   7. Prepare un estereomicroscopio en la campana.
2. Con una tijera grande, sacrifique a las crías de rata Sprague Dawley de 0 a 3 días de edad separando sus cabezas de sus cuerpos en una placa de Petri vacía de 60 mm (paso 6.1.1). Desechar los cuerpos.
3. Levante la cabeza sosteniéndola de la boca con una pinza grande. Corta la piel que cubre el cráneo con una tijera pequeña.
4. Con una tijera limpia, ingrese debajo del cráneo (en el lado del cerebelo) y corte el cráneo a la derecha y a la izquierda para permitir su eliminación. Usando una pinza pequeña, despegue el cráneo del cerebro.
5. Con una pinza limpia, separe el cerebro de la cabeza y colóquelo en una placa de Petri de 60 mm que contenga 2 ml de MEM fría (ver paso 6.1.2).
6. Usando dos pinzas pequeñas, disecciona el hipocampo bajo un microscopio estereoscópico. Transfiera el hipocampo al plato preparado de 35 mm (del paso 6.1.2) que contenga MEM.
   NOTA: Los pasos 6.3–6.6 deben repetirse para cada cachorro.
7. Cortar el hipocampo a aproximadamente 1 mm de rodajas con el bisturí. Añadir 200 μL de la solución de tripsina (diluida hasta una concentración final del 0,25%). Mezclar suavemente e incubar a 37 °C, 5-10% de_CO2 durante 30 min.
8. Después de la incubación, añadir 2 ml de MEM fría (paso 6.1.2) a la placa para desactivar la tripsina. Transfiera el tejido tripsinizado a un tubo de 15 ml que contenga 1 ml de primer día medio precalentado a 37 °C (paso 6.1.3) utilizando la pipeta de vidrio Pasteur con el diámetro más grande (paso 6.1.5).
   NOTA: La mejor relación medio a tejido (v:v) para el procesamiento posterior del tejido es de 1 ml/8 hipocampo. Evite transferir el medio con el tejido tanto como sea posible.
9. Triturar el tejido pasándolo a través de la pipeta de vidrio de mayor diámetro 10-15 veces. A continuación, repita este proceso utilizando la pipeta de vidrio con el diámetro medio. Continuar triturando con la pipeta de menor diámetro. Evite burbujear para reducir la muerte celular.
10. Deje que las piezas de tejido restantes se hundan durante 2-5 minutos, luego transfiera el sobrenadante a otro tubo de 15 ml. Contar las células con un hemocitómetro.
    NOTA: La densidad celular preferible es de 200.000–400.000 células/ml. Utilice First Day Medium para diluir o centrifugar a 470 x g para concentrar las células.
11. Semilla 100 μL de células en cada cubreobjetos de vidrio. Mientras siembra, asegúrese de cubrir todo el cubreobjetos con celdas. Incubar a 37 °C, 5–10% de_CO2.
12. Al día siguiente, agregue 500 μL de medio de crecimiento neuronal a los pocillos.
    NOTA: La composición del Medio de Crecimiento Neuronal se describe en la Tabla de Materiales.
13. Transfiera suavemente cada cubreobjetos a su pozo apropiado con una pinza mientras retira el primer día medio inclinando el cubreobjetos. Succiona los medios restantes de la tapa.
14. Incubar a 37 °C, 5–10% de_CO2. Evite reemplazar el medio durante la incubación. Los cultivos se pueden mantener en estas condiciones hasta 1 mes. La principal preocupación es la humedad. Por lo tanto, asegúrese de mantener la incubadora humidificada al máximo.

Resultados

Para preparar la matriz del esqueleto de coral, todo el esqueleto de coral (Figura 1A) se dividió en fragmentos de 0,5 a 2 cm con un martillo (Figura 1B) y se limpió a fondo de residuos orgánicos a través de tres pasos (paso 1 en el protocolo) utilizando una solución de hipoclorito al 10%, una solución de NaOH al 10% y una solución de_H2O2al 30% (Figura 1C). Los fragmentos de coral se limpiaron bien cuand...

Discusión

La técnica presentada aquí describe una forma de mejorar el mantenimiento y la funcionalidad de las células neuronales en cultivo. Esto se logra adhiriendo las células a una matriz hecha de granos de esqueleto de coral que nutre las células y promueve su crecimiento y actividad. El uso de esta técnica aumenta la capacidad del modelo de cultivo neuronal para imitar el entorno de las células en el cerebro.

La introducción de la matriz como sustrato de cultivo tiene varias ventajas sobre ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	#A4503
D – glucose	Sigma	#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)	Sigma	#D5796
Electrical sieve	Ari Levy	#3700
Fetal Bovine Serun (FBS)	Biological Industries	#04-007-1A
First Day Medium			85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks	Greiner	#60-690160	25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine	Sigma	#F0503
Glass Coverslips	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Sigma	#N4888
HANK'S solution	Sigma	#H6648
Kynurenic acid	Sigma	#K3375
L - glutamine	Sigma	#G7513
Manual strainer (40µm)	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)	Sigma	#M2279
Mortar and pestle	De-Groot	4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite)	Sigma	#425044	Hazardous
NaOH	Sigma	#S8045	Hazardous
Neuronal Growth Medium			45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish	Greiner	#60-628160, #60-627160	60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine	Sigma	#P7280
Smart Dentin Grinder	KometaBio	#GR101
Trypsin	Gibco	#15-090-046
Uridine	Sigma	#U3750