Aumentando a Durabilidade de Culturas de Células Neurais Dissociadas Usando Matriz Coralina Biologicamente Ativa

Resumo

A cultura de células dissociadas do hipocampo é uma ferramenta experimental fundamental em neurociência. A sobrevivência e a função das células neurais em cultura são aumentadas quando esqueletos coralinos são usados como matrizes, devido ao seu papel neuroprotetor e neuromodulador. Assim, as células neurais cultivadas em matriz coralina apresentam maior durabilidade e, portanto, são mais adequadas para o cultivo.

Resumo

Culturas de células neuronais e gliais do hipocampo dissociadas são um modelo experimental valioso para estudar o crescimento e a função neural, proporcionando alto isolamento celular e um ambiente controlado. No entanto, a sobrevivência das células do hipocampo in vitro está comprometida: a maioria das células morre durante a primeira semana de cultivo. Portanto, é de grande importância identificar maneiras de aumentar a durabilidade das células neurais em cultura.

O carbonato de cálcio na forma de aragonita cristalina derivada do esqueleto de corais pode ser usado como uma matriz ativa superior para culturas neurais. Ao nutrir, proteger e ativar as células gliais, o esqueleto do coral aumenta a sobrevivência e o crescimento dessas células in vitro melhor do que outras matrizes.

Este protocolo descreve um método para cultivar células hipocampais em uma matriz coralina. Essa matriz é gerada pela fixação de grãos de esqueletos de corais em pratos de cultura, frascos e lamínulas de vidro. Os grãos ajudam a melhorar o ambiente das células, introduzindo-as em um ambiente tridimensional fino (3D) para crescer e formar estruturas semelhantes a tecidos. O ambiente 3D introduzido pelo esqueleto do coral pode ser otimizado para as células por moagem, o que permite o controle sobre o tamanho e a densidade dos grãos (ou seja, a rugosidade da matriz), uma propriedade que foi encontrada para influenciar a atividade das células gliais. Além disso, o uso de grãos facilita a observação e análise das culturas, principalmente quando se utiliza microscopia de luz. Assim, o protocolo inclui procedimentos para geração e otimização da matriz coralina como ferramenta para melhorar a manutenção e funcionalidade das células neurais in vitro.

Introdução

Culturas de células neurais dissociadas, neste caso células hipocampais, são um valioso modelo experimental para o estudo do crescimento e função neural, proporcionando alto isolamento celular e acessibilidade ^1,2,3. Esse tipo de cultura é frequentemente utilizado em neurociências, desenvolvimento de fármacos e engenharia de tecidos devido à grande quantidade de informações que podem ser coletadas, tais como taxas de crescimento e viabilidade, neurotoxicidade, crescimento e rede de neuritos, conectividade e plasticidade sináptica, modificações morfológicas, organização e fiação de neuritos, etc.1,4,5,6,7.

Apesar da importância das culturas, as células cultivadas são geralmente forçadas a crescer sobre lamínulas de vidro em uma monocamada bidimensional. Essas modificações ambientais estritas diminuem significativamente a capacidade de sobrevivência das células neurais ao longo do tempo, pois as lamínulas de vidro são substratos não nutritivos com baixa força de adesão, exibindo menor capacidade de suportar o crescimento celular 8,9,10,11.

Como as células neurais cultivadas são forçadas a crescer em condições desafiadoras, uma abordagem essencial para aumentar sua sobrevivência seria imitar ao máximo seu ambiente natural^12,13. Isso poderia ser obtido com o uso de biomateriais que atuarão como matrizes e mimetizarão a matriz extracelular das células, permitindo que elas formem uma estrutura semelhante a um tecido e auxiliem na sua nutrição¹⁴.

O uso de biomateriais é uma abordagem promissora no aprimoramento de culturas celulares, pois atuam como arcabouços biocompatíveis, proporcionando estabilidade mecânica e melhorando uma variedade de propriedades celulares, incluindo adesão, sobrevivência, proliferação, migração, morfogênese e diferenciação^15,16,17. Vários tipos de biomateriais são utilizados para melhorar as condições das células in vitro. Entre eles estão os biopolímeros, ou componentes biológicos que geralmente fazem parte da matriz extracelular das células. Esses biomateriais são utilizados principalmente como forma de agentes polimerizados de revestimento ou hidrogéis^18,19,20. Por um lado, as matrizes citadas acima conferem às células um ambiente 3D familiar para crescer, estimulam sua adesão ao prato e lhes dão suporte mecânico^21,22. Por outro lado, sua forma polimerizada e o confinamento das células dentro de hidrogéis perturbam o acesso das células aos componentes nutritivos presentes nos meios de crescimento e também dificultam o acompanhamento das células por métodos microscópicos²³.

Exoesqueletos de corais são matrizes biológicas de origem marinha. Eles são feitos de carbonato de cálcio, têm estabilidade mecânica e são biodegradáveis. Estudos prévios utilizando o esqueleto de coral como matriz para o crescimento de células neurais em cultura mostraram adesão muito maior, em comparação com lamínulas de vidro^24,25. Além disso, células neurais cultivadas no esqueleto do coral demonstraram sua capacidade de ingerir o cálcio do esqueleto composto, o que protege as células neurais em condições de privação de nutrientes²⁶. Além disso, o esqueleto do coral é uma matriz de suporte e nutrição que aumenta a sobrevivência das células neurais, estimula a formação de redes neurais, eleva a taxa de conectividade sináptica e possibilita a formação de estruturas semelhantes a tecidos^27,28. Estudos recentes também têm demonstrado que a topografia superficial da matriz do esqueleto coral desempenha um papel crucial na distribuição e ativação das células^gliais8,29. Além disso, o esqueleto de coral é eficaz como matriz para o cultivo de outros tipos celulares, como osteócitos^30,31, hepatócitos e cardiomiócitos em cultura (dados não publicados).

Assim, o esqueleto de corais é uma matriz promissora para o cultivo de células in vitro. Assim, o protocolo detalhado a seguir descreve a técnica de cultivo de células neurais no esqueleto de corais para a produção de culturas neurais mais estáveis e prósperas do que aquelas alcançadas pelos métodos existentes. Esse protocolo também pode ser útil para o cultivo de cardiomiócitos, hepatócitos e outros tipos celulares.

Protocolo

O uso de animais neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais.

NOTA: Esqueletos de corais carbonatados com cálcio devem ser usados na forma cristalina de aragonita. Os tipos de corais testados até agora para culturas neurais são Porites Lutea, Stylophora Pistillata e Trachyphyllia Geoffroyi. Os esqueletos podem ser comprados inteiros ou terrestres.

1. Limpeza das peças do esqueleto do coral

CUIDADO: As seguintes etapas devem ser realizadas em uma coifa química à temperatura ambiente, pois as soluções descritas abaixo são perigosas e podem causar queimaduras e irritações.

1. Use um martelo para quebrar o esqueleto do coral e dividi-lo em fragmentos de 0,5 a 2 cm. Para dissolver resíduos orgânicos e não orgânicos, mergulhe os fragmentos do esqueleto do coral em solução de hipoclorito de sódio a 10% por 10 minutos e, em seguida, lave uma vez com água bidestilada (DDW).
2. Para remover os resíduos orgânicos restantes, mergulhe os fragmentos em uma solução de NaOH 1M por 5 minutos e, em seguida, lave uma vez com DDW. Continue com a remoção dos depósitos orgânicos mergulhando os fragmentos em solução de 30% H 2 O₂por 10 min, em seguida, lave os fragmentos 3x com DDW.
3. Remova o máximo de DDW em excesso possível e deixe os fragmentos de coral no capô secar (1 a 8 h).

2. Limpeza das tampas de vidro

1. Transfira as lamínulas de vidro para uma placa de Petri de vidro de 100 mm. Adicionar 10 mL de etanol 95% por 15 min.
2. Retire o etanol e lave com DDW 3x, aguardando 10 min entre cada lavagem. Coloque o prato numa placa de aquecimento pré-aquecida a 80 °C até evaporar o DDW. Mexa suavemente as tampas dentro do prato várias vezes durante a secagem para evitar que grudem umas nas outras.
3. Autoclave as lamínulas.

3. Preparação de grãos de esqueleto de coral

1. Triture os fragmentos do esqueleto do coral usando uma argamassa e pilão (moagem manual) até a completa quebra. O resultado é uma mistura de grãos com tamanhos que variam de 20 μm a 200 μm.
2. Alternativamente, triture os fragmentos do esqueleto do coral usando uma máquina de moagem elétrica a uma velocidade de 1.000 rpm por 30 s (comprimento da lâmina = 6 cm; largura = 0,5 cm – 1,0 cm). O tamanho de grão resultante é semelhante à faixa de tamanho produzida pela moagem manual.

4. Purificação de grãos de uma faixa de tamanho específica

NOTA: Se o controle sobre o tamanho dos grãos em uma matriz for desejado, use o seguinte procedimento de purificação de grãos baseado em filtração.

1. Transfira os grãos para um filtro de malha filtrante manual ou elétrico de 40 μm.
2. Divida os grãos em duas faixas específicas, peneirando os grãos através do filtro (se estiver usando um filtro elétrico, as seguintes condições são recomendadas: agitação = 600 amplitudes/min, salto = 6/s). Este procedimento produz dois grupos de tamanhos de grãos, um <40 μm e o segundo >40 μm.
   NOTA: Os dois tamanhos podem ser determinados usando filtros de malhas variadas. Se um intervalo mais restrito for desejado, então peneire novamente cada grupo da etapa 4.2 através de filtros com malhas diferentes.
3. Autoclave os grãos.

5. Preparação de pratos ou lamínulas revestidas com grãos de coral

1. Para revestimento de frascos, placas ou placas de Petri
   NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em condições estéreis.
   1. Adicionar os grãos do esqueleto do coral em uma solução de poli-D-lisina (PDL) de 20 μg/mL dissolvida em solução de Hanks. A concentração recomendada é de 5 mg/10 mg de grãos por 1 mL de solução de PDL.
   2. Deite a solução em frascos e pratos (aproximadamente 2 ml/25 cm²) e incube durante a noite a 4 °C. Os grãos afundam e se prendem ao fundo.
   3. No dia seguinte, lave os frascos e pratos uma vez com DDW estéril. Deixe os frascos e pratos secarem no capô.
      NOTA: É preferível usar frascos e pratos recém-revestidos. Os frascos e pratos revestidos podem ser utilizados até uma semana após o revestimento, se conservados a 4 °C. No entanto, a eficácia da matriz pode estar comprometida.
2. Revestimento de lamínulas de vidro (12 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura)
   1. Adicione grãos de esqueleto de coral ao DDW em qualquer concentração desejada. As densidades comuns usadas para células neurais são 5 mg/mL e 10 mg/mL. Despeje 40 μL da solução de grão sobre o centro da lamínula (Figura 4).
   2. Coloque as lamínulas numa placa de aquecimento pré-aquecida a 80 °C e aguarde a evaporação completa (normalmente 15 min). Nessas condições, os grãos aderem à lamínula. Autoclave as lamínulas revestidas. Armazenar em condições estéreis.
   3. Um dia antes da cultura, coloque as tampas na tampa de uma placa estéril de 24 poços. Adicionar 100 μL de 20 μg/ml de solução de PDL a cada lamínula. Use a ponta para garantir que o líquido cubra toda a região do grão e o restante da superfície da tampa.
   4. Cubra a tampa com o fundo da placa. Embrulhe as laterais das placas com filme de parafina. Incubar durante a noite a 4 °C.
   5. No dia seguinte, lave uma vez com DDW e seque no capô.
      NOTA: É preferível usar lamínulas recém-revestidas.

6. Cultivo de células dissociadas do hipocampo em lamínulas de vidro revestidas com grãos de esqueleto de coral

OBS: O método para cultura de células dissociadas do hipocampo foi modificado a partir de procedimentos previamente^{publicados24,27}. O preparo da cultura é descrito para quatro filhotes de ratos. O rendimento esperado de cada hipocampo é de 1–1,5 x 10⁶ células.

1. Configuração
   1. Prepare uma placa de Petri de 60 mm vazia. Despeje 2 mL de meio essencial mínimo (MEM) em uma placa de Petri de 60 mm e coloque gelo.
   2. Despeje 2 mL de MEM em uma placa de 35 mm e coloque-o em uma incubadora a 37 °C, 5–10% CO₂. Deite 2 ml de MEM num tubo de 15 ml e mantenha-o a 4 °C.
   3. Despeje 1 mL de meio de primeiro dia em um tubo de 15 mL e coloque-o em uma incubadora a 37 °C, 5-10% CO₂.
      NOTA: A composição do Meio do Primeiro Dia está descrita na Tabela de Materiais.
   4. Descongelar 200 μL de uma solução de tripsina a 2,5% e incubar a 37 °C.
   5. Prepare três pipetas de vidro Pasteur com cabeças de 0,5 mm, 0,75 mm e 1,0 mm de diâmetro usando uma chama.
   6. Prepare ferramentas cirúrgicas adequadas: uma tesoura grande, duas tesouras pequenas, um tweezer grande, quatro pinças pequenas e um bisturi.
   7. Prepare um estereomicroscópio no capô.
2. Usando uma tesoura grande, sacrifique filhotes de ratos Sprague Dawley de 0 a 3 dias separando suas cabeças de seus corpos em uma placa de Petri vazia de 60 mm (passo 6.1.1). Descarte os corpos.
3. Pegue a cabeça segurando-a da boca com um grande tweezer. Corte a pele que cobre o crânio com uma pequena tesoura.
4. Com uma tesoura limpa, entre por baixo do crânio (do lado do cerebelo) e corte o crânio à direita e à esquerda para permitir sua remoção. Usando um pequeno tweezer, descasque o crânio do cérebro.
5. Com um tweezer limpo, separe o cérebro da cabeça e coloque-o numa placa de Petri de 60 mm contendo 2 ml de MEM frio (ver passo 6.1.2).
6. Usando duas pinças pequenas, disseque os hipocampos sob um estereomicroscópio. Transferir os hipocampos para o prato preparado de 35 mm (a partir do passo 6.1.2) contendo MEM.
   NOTA: As etapas 6.3–6.6 devem ser repetidas para cada filhote.
7. Cortar os hipocampos em fatias de aproximadamente 1 mm com o bisturi. Adicionar 200 μL da solução de tripsina (diluída até uma concentração final de 0,25%). Misture delicadamente e incube a 37 °C, 5–10% CO₂ durante 30 min.
8. Após a incubação, adicionar 2 ml de MEM frio (passo 6.1.2) à placa para desativar a tripsina. Transferir o tecido tripsinizado para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio do primeiro dia pré-aquecido a 37 °C (passo 6.1.3) utilizando a pipeta de vidro Pasteur de maior diâmetro (passo 6.1.5).
   NOTA: A melhor relação meio/tecido (v:v) para processamento posterior do tecido é de 1 mL/8 hipocampos. Evite ao máximo transferir o meio com o tecido.
9. Triture o tecido passando-o através da pipeta de vidro de maior diâmetro 10 a 15 vezes. Em seguida, repita esse processo usando a pipeta de vidro com o diâmetro médio. Continue triturando com a pipeta de menor diâmetro. Evite borbulhar para reduzir a morte celular.
10. Deixe os pedaços de tecido restantes afundarem por 2 a 5 minutos e, em seguida, transfira o sobrenadante para outro tubo de 15 mL. Conte as células usando um hemocitômetro.
    NOTA: A densidade celular preferencial é de 200.000 a 400.000 células/mL. Use o meio do primeiro dia para diluir ou centrifugação a 470 x g para concentrar as células.
11. Semear 100 μL de células em cada lamínula de vidro. Durante a semeadura, certifique-se de cobrir toda a tampa com células. Incubar a 37 °C, 5–10% CO₂.
12. No dia seguinte, adicione 500 μL de Meio de Crescimento Neuronal aos poços.
    NOTA: A composição do meio de crescimento neuronal está descrita na Tabela de Materiais.
13. Transfira suavemente cada lamínula para o poço apropriado usando uma pinça enquanto remove o meio do primeiro dia, inclinando a lamínula. Sucção do meio restante da tampa.
14. Incubar a 37 °C, 5–10% CO_2. Evite substituir o meio durante toda a incubação. As culturas podem ser mantidas nessas condições até 1 mês. A maior preocupação é a umidade. Portanto, certifique-se de manter a incubadora ao máximo umidificada.

Resultados

Para preparar a matriz do esqueleto do coral, todo o esqueleto do coral (Figura 1A) foi quebrado em fragmentos de 0,5 a 2 cm com martelo (Figura 1B) e completamente limpo dos resíduos orgânicos em três etapas (etapa 1 do protocolo) com solução de hipoclorito a 10%, solução de NaOH 1M e solução de H 2 O₂ a 30% (Figura 1C). Os fragmentos de corais foram bem limpos quando a cor do esqueleto mudou de marro...

Discussão

A técnica aqui apresentada descreve uma maneira de melhorar a manutenção e funcionalidade de células neurais em cultura. Isto é conseguido através da adesão das células a uma matriz feita de grãos de esqueleto de coral que nutre as células e promove o seu crescimento e atividade. O uso dessa técnica aumenta a capacidade do modelo de cultura neural de imitar o ambiente das células no cérebro.

A introdução da matriz como substrato de cultura apresenta diversas vantagens sobre outr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	#A4503
D – glucose	Sigma	#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)	Sigma	#D5796
Electrical sieve	Ari Levy	#3700
Fetal Bovine Serun (FBS)	Biological Industries	#04-007-1A
First Day Medium			85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks	Greiner	#60-690160	25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine	Sigma	#F0503
Glass Coverslips	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Sigma	#N4888
HANK'S solution	Sigma	#H6648
Kynurenic acid	Sigma	#K3375
L - glutamine	Sigma	#G7513
Manual strainer (40µm)	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)	Sigma	#M2279
Mortar and pestle	De-Groot	4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite)	Sigma	#425044	Hazardous
NaOH	Sigma	#S8045	Hazardous
Neuronal Growth Medium			45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish	Greiner	#60-628160, #60-627160	60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine	Sigma	#P7280
Smart Dentin Grinder	KometaBio	#GR101
Trypsin	Gibco	#15-090-046
Uridine	Sigma	#U3750