Augmentation de la durabilité des cultures de cellules neurales dissociées à l’aide d’une matrice coralline biologiquement active

Résumé

La culture cellulaire dissociée de l’hippocampe est un outil expérimental essentiel en neurosciences. La survie et la fonction des cellules neurales en culture sont améliorées lorsque les squelettes coralliniques sont utilisés comme matrices, en raison de leurs rôles neuroprotecteurs et neuromodulateurs. Par conséquent, les cellules neurales cultivées sur la matrice coralline montrent une durabilité plus élevée et sont donc plus adéquates pour la culture.

Résumé

Les cultures de cellules neuronales et gliales hippocampiques dissociées constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation cellulaire élevée et un environnement contrôlé. Cependant, la survie des cellules de l’hippocampe in vitro est compromise : la plupart des cellules meurent au cours de la première semaine de culture. Il est donc très important d’identifier des moyens d’augmenter la durabilité des cellules neurales en culture.

Le carbonate de calcium sous forme d’aragonite cristalline dérivée du squelette des coraux peut être utilisé comme matrice supérieure et active pour les cultures neuronales. En nourrissant, protégeant et activant les cellules gliales, le squelette corallien améliore la survie et la croissance de ces cellules in vitro mieux que les autres matrices.

Ce protocole décrit une méthode de culture de cellules hippocampiques sur une matrice corallienne. Cette matrice est générée en attachant des grains de squelettes de corail à des plats de culture, des flacons et des lamelles de verre en verre. Les grains aident à améliorer l’environnement des cellules en les introduisant dans un environnement tridimensionnel fin (3D) pour se développer et former des structures ressemblant à des tissus. L’environnement 3D introduit par le squelette corallien peut être optimisé pour les cellules par broyage, ce qui permet de contrôler la taille et la densité des grains (c’est-à-dire la rugosité de la matrice), une propriété qui s’est avérée influencer l’activité des cellules gliales. De plus, l’utilisation de grains facilite l’observation et l’analyse des cultures, en particulier lors de l’utilisation de la microscopie optique. Par conséquent, le protocole comprend des procédures pour la génération et l’optimisation de la matrice coralline en tant qu’outil pour améliorer la maintenance et la fonctionnalité des cellules neurales in vitro.

Introduction

Les cultures de cellules neurales dissociées, en l’occurrence les cellules hippocampiques, constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation et une accessibilité cellulaires élevées ^1,2,3. Ce type de culture est fréquemment utilisé en neurosciences, en développement de médicaments et en ingénierie tissulaire en raison de la grande quantité d’informations qui peuvent être collectées, telles que les taux de croissance et de viabilité, la neurotoxicité, la croissance et la mise en réseau des neurites, la connectivité synaptique et la plasticité, les modifications morphologiques, l’organisation et le câblage des neurites, etc.1,4,5,6,7.

Malgré l’importance des cultures, les cellules cultivées sont généralement forcées de se développer sur des lamelles de verre dans une monocouche bidimensionnelle. Ces modifications environnementales strictes diminuent considérablement la capacité des cellules neurales à survivre au fil du temps, car les lamelles de verre sont des substrats non nourrissants avec une faible force d’adhérence, présentant une capacité inférieure à soutenir la croissance cellulaire 8,9,10,11.

Parce que les cellules neurales cultivées sont forcées de croître dans des conditions difficiles, une approche essentielle pour améliorer leur survie serait d’imiter leur environnement naturel autant que possible^12,13. Cela pourrait être réalisé en utilisant des biomatériaux qui agiront comme des matrices et imiteront la matrice extracellulaire des cellules, leur permettant de former une structure tissulaire et d’aider à leur alimentation¹⁴.

L’utilisation de biomatériaux est une approche prometteuse pour améliorer les cultures cellulaires, car ils agissent comme des échafaudages biocompatibles, assurant la stabilité mécanique et améliorant une variété de propriétés cellulaires, y compris l’adhésion, la survie, la prolifération, la migration, la morphogenèse et la différenciation^15,16,17. Plusieurs types de biomatériaux sont utilisés pour améliorer les conditions des cellules in vitro. Parmi eux se trouvent des biopolymères, ou composants biologiques qui font généralement partie de la matrice extracellulaire des cellules. Ces biomatériaux sont principalement utilisés comme forme d’agents d’enrobage polymérisés ou d’hydrogels^18,19,20. D’une part, les matrices mentionnées ci-dessus donnent aux cellules un environnement 3D familier pour se développer, favorisent leur adhésion à la capsule et leur donnent un soutien mécanique^21,22. D’autre part, leur forme polymérisée et le confinement des cellules dans les hydrogels perturbent l’accès des cellules aux composants nourriciers présents dans le milieu de croissance et rendent également plus difficile le suivi des cellules par des méthodes microscopiques²³.

Les exosquelettes coralliens sont des matrices biologiques d’origine marine. Ils sont faits de carbonate de calcium, ont une stabilité mécanique et sont biodégradables. Des études antérieures utilisant le squelette de corail comme matrice pour la croissance de cellules neurales en culture ont montré une adhésion beaucoup plus grande, par rapport aux lamelles de couverture^{en verre 24,25}. De plus, les cellules neurales cultivées sur le squelette de corail ont démontré leur capacité à absorber le calcium dont le squelette est composé, ce qui protège les cellules neurales dans des conditions de privation de nutriments²⁶. De plus, le squelette corallien est une matrice de soutien et de soutien qui augmente la survie des cellules neurales, encourage la formation de réseaux neuronaux, élève le taux de connectivité synaptique et permet la formation de structures tissulaires^27,28. Des études récentes ont également montré que la topographie de surface de la matrice du squelette corallien joue un rôle crucial dans la distribution et l’activation des cellules gliales ^8,29. En outre, le squelette de corail est efficace comme matrice pour la culture d’autres types de cellules, tels que les ostéocytes^30,31, les hépatocytes et les cardiomyocytes en culture (données non publiées).

Par conséquent, le squelette de corail est une matrice prometteuse pour la culture de cellules in vitro. Ainsi, le protocole détaillé ci-dessous décrit la technique de culture de cellules neurales sur squelette de corail pour produire des cultures neuronales plus stables et prospères que celles obtenues par les méthodes existantes. Ce protocole peut également être utile pour la culture de cardiomyocytes, d’hépatocytes et d’autres types de cellules.

Protocole

L’utilisation d’animaux dans ce protocole a été approuvée par le Comité national de soin et d’utilisation des animaux.

NOTE: Les squelettes de coraux carbonatés de calcium doivent être utilisés sous forme cristalline d’aragonite. Les types de coraux testés jusqu’à présent pour les cultures neuronales sont Porites Lutea, Stylophora Pistillata et Trachyphyllia Geoffroyi. Les squelettes peuvent être achetés entiers ou moulus.

1. Nettoyage des morceaux de squelette de corail

ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte chimique à température ambiante, car les solutions décrites ci-dessous sont dangereuses et peuvent causer des brûlures et des irritations.

1. Utilisez un marteau pour briser le squelette de corail et divisez-le en fragments de 0,5 à 2 cm. Afin de dissoudre les résidus organiques et non organiques, faire tremper les fragments du squelette de corail dans une solution d’hypochlorite de sodium à 10% pendant 10 min, puis laver une fois avec de l’eau bidistillée (DDW).
2. Pour éliminer les résidus organiques restants, faire tremper les fragments dans une solution de NaOH 1M pendant 5 min, puis laver une fois avec DDW. Poursuivre l’élimination des dépôts organiques en faisant tremper les fragments dans une solution à 30% H_2O2 pendant 10 min, puis laver les fragments 3x avec DDW.
3. Enlevez autant d’excès de DDW que possible et laissez sécher les fragments de corail dans la capuche (1–8 h).

2. Nettoyage des lamelles de verre

1. Transférer les lamelles de verre dans une boîte de Petri en verre de 100 mm. Ajouter 10 mL d’éthanol à 95 % pendant 15 min.
2. Retirer l’éthanol et laver avec DDW 3x, en attendant 10 min entre chaque lavage. Placer la capsule sur une plaque chauffante préchauffée à 80 °C jusqu’à ce que le DDW s’évapore. Remuez doucement les lamelles de couverture dans la plaque plusieurs fois pendant le séchage pour les empêcher de coller les unes aux autres.
3. Autoclave les lamelles de couverture.

3. Préparation des grains de squelette de corail

1. Broyer les fragments du squelette de corail à l’aide d’un mortier et d’un pilon (broyage manuel) jusqu’à décomposition complète. Le résultat est un mélange de grains avec des tailles allant de 20 μm à 200 μm.
2. Vous pouvez également broyer les fragments du squelette de corail à l’aide d’une rectifieuse électrique à une vitesse de 1 000 tr/min pendant 30 s (longueur de la lame = 6 cm; largeur = 0,5 cm–1,0 cm). La taille des grains résultante est similaire à la plage de taille produite par le meulage manuel.

4. Purification de grains d’une gamme de tailles spécifique

REMARQUE : Si l’on souhaite contrôler la taille des grains dans une matrice, utiliser la procédure de purification des grains basée sur la filtration suivante.

1. Transférer les grains sur une crépine filtrante manuelle ou électrique de 40 μm.
2. Diviser les grains en deux gammes spécifiques en tamisant les grains à travers la passoire (si vous utilisez une passoire électrique, les conditions suivantes sont recommandées: agitation = 600 amplitudes/min, rebond = 6/s). Cette procédure produit deux groupes de granulomets, l’un <40 μm et le second >40 μm.
   REMARQUE: Les deux tailles peuvent être déterminées à l’aide de crépines à mailles variables. Si une plage plus restreinte est souhaitée, tamisez à nouveau chaque groupe à partir de l’étape 4.2 à travers des crépines à mailles différentes.
3. Autoclaver les grains.

5. Préparation de plats enrobés de grains de corail ou de bordereaux de couverture

1. Pour enrober des flacons, des plaques ou des boîtes de Petri
   REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.
   1. Ajouter les grains du squelette de corail dans une solution de poly-D-lysine (PDL) de 20 μg/mL dissoute dans la solution de Hanks. La concentration recommandée est de 5 mg/10 mg de grains par 1 mL de solution PDL.
   2. Verser la solution dans des flacons et des plats (environ 2 mL/25 cm²) et incuber toute la nuit à 4 °C. Les grains coulent et se fixent au fond.
   3. Le lendemain, lavez les flacons et la vaisselle une fois avec du DDW stérile. Laissez sécher les flacons et la vaisselle dans la hotte.
      NOTE: Il est préférable d’utiliser des flacons et des plats fraîchement enrobés. Les flacons et plats enduits peuvent être utilisés jusqu’à une semaine après le revêtement s’ils sont conservés à 4 °C. Cependant, l’efficacité de la matrice peut être compromise.
2. Revêtement des lamelles de verre (12 mm de diamètre, 0,17 mm d’épaisseur)
   1. Ajouter des grains de squelette de corail à DDW à la concentration désirée. Les densités courantes utilisées pour les cellules neurales sont de 5 mg/mL et 10 mg/mL. Verser 40 μL de la solution granulée au centre de la lamelle de couverture (Figure 4).
   2. Placez les lamelles de couverture sur une plaque chauffante préchauffée à 80 °C et attendez l’évaporation complète (généralement 15 min). Dans ces conditions, les grains adhèrent à la lamelle de couverture. Autoclaver les lamelles de recouvrement enduites. Conserver dans des conditions stériles.
   3. Un jour avant la culture, placez les lamelles de couverture sur le couvercle d’une plaque stérile de 24 puits. Ajouter 100 μL de solution PDL à 20 μg/mL à chaque lame-couvercle. Utilisez l’embout pour vous assurer que le liquide recouvre toute la région du grain et le reste de la surface de la lamelle de couverture.
   4. Couvrez le couvercle avec le fond de la plaque. Enveloppez les côtés des assiettes avec un film de paraffine. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
   5. Le lendemain, laver une fois avec DDW et sécher dans la hotte.
      NOTE: Il est préférable d’utiliser des lamelles de couverture fraîchement enduites.

6. Culture de cellules dissociées de l’hippocampe sur des lamelles de verre recouvertes de grains de squelette de corail

NOTE: La méthode de culture cellulaire dissociée de l’hippocampe a été modifiée par rapport aux procédures publiées précédemment^24,27. La préparation de la culture est décrite pour quatre ratons. Le rendement attendu de chaque hippocampe est de 1 à 1,5 x 10⁶ cellules.

1. Coup monté
   1. Préparez une boîte de Petri vide de 60 mm. Verser 2 mL de milieu essentiel minimal (MEM) dans une boîte de Petri de 60 mm et mettre sur de la glace.
   2. Verser 2 mL de MEM dans une capsule de 35 mm et le mettre dans un incubateur à 37 °C, 5–10% CO₂. Verser 2 mL de MEM dans un tube de 15 mL et le maintenir à 4 °C.
   3. Verser 1 mL de First Day Medium dans un tube de 15 mL et le mettre dans un incubateur à 37 °C, 5-10% CO₂.
      REMARQUE : La composition du milieu du premier jour est décrite dans le tableau des matières.
   4. Décongeler 200 μL d’une solution de trypsine à 2,5 % et incuber à 37 °C.
   5. Préparez trois pipettes Pasteur en verre avec des têtes de 0,5 mm, 0,75 mm et 1,0 mm de diamètre à l’aide d’une flamme.
   6. Préparez des outils chirurgicaux adéquats: un gros ciseau, deux petits ciseaux, une grande pince à épiler, quatre petites pinces à épiler et un scalpel.
   7. Préparez un stéréomicroscope dans la hotte.
2. À l’aide d’un gros ciseau, sacrifiez les ratons Sprague Dawley âgés de 0 à 3 jours en séparant leur tête de leur corps dans une boîte de Petri vide de 60 mm (étape 6.1.1). Éliminez les corps.
3. Ramassez la tête en la tenant de la bouche avec une grosse pince à épiler. Coupez la peau recouvrant le crâne avec un petit ciseau.
4. Avec un ciseau propre, entrez sous le crâne (sur le côté du cervelet) et coupez le crâne à droite et à gauche pour permettre son retrait. À l’aide d’une petite pince à épiler, retirez le crâne du cerveau.
5. À l’aide d’une pince à épiler propre, séparer la cervelle de la tête et la placer dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 2 ml de MEM froid (voir étape 6.1.2).
6. À l’aide de deux petites pincettes, disséquez l’hippocampe sous un stéréomicroscope. Transférer l’hippocampe dans la capsule préparée de 35 mm (à partir de l’étape 6.1.2) contenant du MEM.
   REMARQUE : Les étapes 6.3 à 6.6 doivent être répétées pour chaque chiot.
7. Couper l’hippocampe en tranches d’environ 1 mm à l’aide du scalpel. Ajouter 200 μL de la solution de trypsine (diluée à une concentration finale de 0,25%). Mélanger délicatement et incuber à 37 °C, 5–10% CO₂ pendant 30 min.
8. Après l’incubation, ajouter 2 mL de MEM froid (étape 6.1.2) dans la capsule pour désactiver la trypsine. Transférer le tissu trypsinisé dans un tube de 15 mL contenant 1 mL de milieu Premier Jour préchauffé à 37 °C (étape 6.1.3) à l’aide de la pipette Pasteur en verre du plus grand diamètre (étape 6.1.5).
   REMARQUE: Le meilleur rapport milieu / tissu (v: v) pour le traitement ultérieur du tissu est de 1 mL / 8 hippocampe. Évitez autant que possible de transférer le milieu avec le tissu.
9. Triturez le tissu en le faisant passer 10 à 15 fois dans la pipette en verre de plus grand diamètre. Ensuite, répétez ce processus à l’aide de la pipette en verre de diamètre moyen. Continuez à triturer avec la pipette de plus petit diamètre. Évitez les bulles pour réduire la mort cellulaire.
10. Laisser couler les morceaux de tissu restants pendant 2 à 5 minutes, puis transférer le surnageant dans un autre tube de 15 mL. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    REMARQUE: La densité cellulaire préférable est de 200 000 à 400 000 cellules / mL. Utiliser le milieu Premier Jour pour diluer ou centrifuger à 470 x g pour concentrer les cellules.
11. Ensemencer 100 μL de cellules sur chaque lamelle de verre. Pendant l’ensemencement, assurez-vous de couvrir toute la lamelle de couverture avec des cellules. Incuber à 37 °C, 5–10% CO₂.
12. Le lendemain, ajoutez 500 μL de milieu de croissance neuronale aux puits.
    NOTE: La composition du milieu de croissance neuronale est décrite dans le tableau des matériaux.
13. Transférer délicatement chaque lamelle de couverture dans son puits approprié à l’aide d’une pince à épiler tout en retirant le support Premier jour en inclinant le capiton. Aspirez le reste du média du couvercle.
14. Incuber à 37 °C, 5–10% CO_2. Évitez de remplacer le milieu tout au long de l’incubation. Les cultures peuvent être maintenues dans ces conditions jusqu’à 1 mois. La principale préoccupation est l’humidité. Par conséquent, assurez-vous de maintenir l’incubateur humidifié au maximum.

Résultats

Afin de préparer la matrice du squelette corallien, l’ensemble du squelette corallien (Figure 1A) a été brisé en fragments de 0,5 à 2 cm à l’aide d’un marteau (Figure 1B) et soigneusement nettoyé des résidus organiques en trois étapes (étape 1 du protocole) en utilisant une solution d’hypochlorite à 10%, une solutionde NaOH 1M et une solution H 2 O_{2 à} 30% (Figure 1C). Les fragments de corail...

Discussion

La technique présentée ici décrit un moyen d’améliorer le maintien et la fonctionnalité des cellules neurales en culture. Ceci est réalisé en adhérant les cellules à une matrice faite de grains de squelette de corail qui nourrit les cellules et favorise leur croissance et leur activité. L’utilisation de cette technique augmente la capacité du modèle de culture neuronale à imiter l’environnement des cellules dans le cerveau.

L’introduction de la matrice en tant que substrat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	#A4503
D – glucose	Sigma	#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)	Sigma	#D5796
Electrical sieve	Ari Levy	#3700
Fetal Bovine Serun (FBS)	Biological Industries	#04-007-1A
First Day Medium			85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks	Greiner	#60-690160	25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine	Sigma	#F0503
Glass Coverslips	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Sigma	#N4888
HANK'S solution	Sigma	#H6648
Kynurenic acid	Sigma	#K3375
L - glutamine	Sigma	#G7513
Manual strainer (40µm)	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)	Sigma	#M2279
Mortar and pestle	De-Groot	4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite)	Sigma	#425044	Hazardous
NaOH	Sigma	#S8045	Hazardous
Neuronal Growth Medium			45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish	Greiner	#60-628160, #60-627160	60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine	Sigma	#P7280
Smart Dentin Grinder	KometaBio	#GR101
Trypsin	Gibco	#15-090-046
Uridine	Sigma	#U3750