生物学的に活性なサンゴリンマトリックスを用いた解離神経細胞培養の耐久性向上

要約

解離した海馬細胞培養は、神経科学における極めて重要な実験ツールです。サンゴの骨格をマトリックスとして使用すると、神経保護的および神経調節的役割により、培養における神経細胞の生存と機能が強化されます。したがって、サンゴマトリックス上で増殖した神経細胞はより高い耐久性を示し、それによって培養により適しています。

要約

解離した海馬の神経細胞とグリア細胞の培養は、高い細胞分離と制御された環境を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです。しかし、in vitroでの海馬細胞の生存は損なわれます:ほとんどの細胞は培養の最初の週に死にます。したがって、培養中の神経細胞の耐久性を高める方法を特定することは非常に重要です。

サンゴの骨格に由来する結晶性アラゴナイトの形の炭酸カルシウムは、神経培養のための優れた活性マトリックスとして使用することができます。グリア細胞を育て、保護し、活性化することにより、サンゴの骨格は他のマトリックスよりもin vitroでこれらの細胞の生存と成長を促進します。

このプロトコルは、サンゴマトリックス上で海馬細胞を培養する方法を記載しています。このマトリックスは、サンゴの骨格の粒を培養皿、フラスコ、ガラスカバーガラスに取り付けることによって生成されます。粒子は、細胞を微細な3次元(3D)環境に導入して成長し、組織のような構造を形成することにより、細胞の環境を改善するのに役立ちます。サンゴの骨格によってもたらされる3D環境は、粉砕によって細胞のために最適化することができ、グリア細胞の活性に影響を与えることがわかっている特性である粒子のサイズと密度(すなわち、マトリックスの粗さ)の制御を可能にします。さらに、穀物を使用すると、特に光学顕微鏡を使用する場合に、培養物の観察と分析が容易になります。したがって、プロトコルには、in vitroで神経細胞の維持と機能を改善するためのツールとして、サンゴマトリックスの生成と最適化の手順が含まれています。

概要

解離した神経細胞(この場合は海馬細胞)の培養は、高い細胞分離とアクセス可能性を提供することにより、神経の成長と機能を研究するための貴重な実験モデルです^1,2,3。このタイプの培養は、成長速度と生存率、神経毒性、神経突起の成長とネットワーキング、シナプスの接続性と可塑性、形態学的修飾、神経突起の組織と配線など、収集できる大量の情報のために、神経科学、医薬品開発、および組織工学で頻繁に^{使用されます}1,4,5,6,7。

培養の重要性にもかかわらず、培養細胞は通常、2次元単層のガラスカバーガラス上で成長することを余儀なくされる。ガラスカバーガラスは接着強度の低い非育成基板であり、細胞増殖をサポートする能力が低いため、これらの厳密な環境改変は神経細胞の長期生存能力を著しく低下させます^8,9,10,11。

培養された神経細胞は困難な条件で成長することを余儀なくされるため、生存率を高めるための不可欠なアプローチは、可能な限り自然環境を模倣することです^12,13。これは、マトリックスとして機能し、細胞の細胞外マトリックスを模倣する生体材料を使用して、細胞が組織のような構造を形成し、栄養を助けることを可能にすることによって達成できます¹⁴。

生体材料の使用は、生体適合性の足場として機能し、機械的安定性を提供し、接着、生存、増殖、遊走、形態形成、および分化を含むさまざまな細胞特性を強化するため、細胞培養の改善における有望なアプローチです15,16,17。インビトロで細胞の状態を改善するために、いくつかの種類の生体材料が使用されます。それらの中には、生体高分子、または通常細胞の細胞外マトリックスの一部である生物学的成分がある。これらの生体材料は、主に重合コーティング剤またはヒドロゲル¹⁸、^19、20の形態として使用される。一方では、上記のマトリックスは、細胞に成長するための使い慣れた3D環境を与え、皿への接着を促進し、それらに機械的支持を与える^21、22。他方、それらの重合形態およびヒドロゲル内の細胞の閉じ込めは、増殖培地中に存在する育成成分への細胞のアクセスを妨害し、また顕微鏡的方法による細胞のフォローアップをより困難にする²³。

サンゴの外骨格は、生物学的海洋起源のマトリックスです。それらは炭酸カルシウムでできており、機械的安定性があり、生分解性です。培養中の神経細胞を成長させるためのマトリックスとしてサンゴ骨格を使用した以前の研究では、ガラスカバーガラスと比較して、はるかに大きな接着性が示されています^24,25。さらに、サンゴの骨格上で増殖した神経細胞は、その骨格が構成されているカルシウムを摂取する能力を示し、栄養欠乏の条件下で神経細胞を保護します²⁶。さらに、サンゴの骨格は、神経細胞の生存率を高め、神経ネットワークの形成を促進し、シナプス結合の速度を高め、組織様構造の形成を可能にする支持的で育成的なマトリックスです^27,28。最近の研究では、サンゴ骨格マトリックスの表面トポグラフィーがグリア細胞の分布と活性化に重要な役割を果たしていることも示されています^8,29。また、サンゴ骨格は、培養中の骨細胞³⁰、³¹、肝細胞^、心筋細胞などの他の細胞種の培養のためのマトリックスとして有効である(未発表データ)。

したがって、サンゴの骨格は、in vitroで細胞を培養するための有望なマトリックスです。したがって、以下に詳述するプロトコルは、既存の方法で達成されたものよりも安定して繁栄した神経培養を生産するために、サンゴの骨格上で神経細胞を培養する技術について説明しています。このプロトコルは、心筋細胞、肝細胞、および他の細胞型の培養にも有用であり得る。

プロトコル

このプロトコルでの動物の使用は、全国動物管理使用委員会によって承認されました。

注:炭酸カルシウムサンゴの骨格は、アラゴナイトの結晶形で使用する必要があります。神経培養のためにこれまでにテストされたサンゴの種類は、 ポリテスルテア、スティロフォラピスティラータ、トラ キフィリアジェフロイです。 スケルトンは全体または地上で購入できます。

1.サンゴの骨格片をきれいにする

注意: 以下の手順は、以下に説明する溶液は危険であり、火傷や刺激を引き起こす可能性があるため、化学薬品フード内で室温で実行する必要があります。

1. ハンマーを使ってサンゴの骨格を壊し、それを0.5〜2 cmの断片に分けます。有機および非有機残留物を溶解するには、サンゴの骨格片を10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に10分間浸した後、二重蒸留水(DDW)で1回洗浄します。
2. 残りの有機残留物を除去するには、フラグメントを1M NaOH溶液に5分間浸した後、重水素減少水で1回洗浄します。断片を30%H 2 O₂溶液に10分間浸すことによって有機堆積物の除去を続け、次いで断片をDDWで3倍洗浄する。
3. 余分な重水素減少水をできるだけ取り除き、フード内のサンゴの破片を乾燥させます(1〜8時間)。

2.ガラスカバースリップのクリーニング

1. ガラスカバーガラスを100mmのガラス製ペトリ皿に移します。10 mLの95%エタノールを15分間加えます。
2. エタノールを取り除き、DDW 3xで洗浄し、各洗浄の間に10分間待ちます。DDWが蒸発するまで、80°Cに予熱した加熱プレートに皿を置きます。乾燥中にプレート内のカバーガラスを数回静かにかき混ぜて、互いにくっつかないようにします。
3. カバーガラスをオートクレーブします。

3.サンゴ骨格粒の調製

1. 完全に壊れるまで、乳鉢と乳棒(手動粉砕)を使用してサンゴの骨格の破片を粉砕します。結果は、20μm〜200μmの範囲のサイズの粒子の混合物です。
2. または、電気粉砕機を使用して、1,000 rpmの速度で30秒間、サンゴの骨格の破片を粉砕します(ブレードの長さ= 6 cm、幅= 0.5 cm–1.0 cm)。結果として得られる粒径は、手動粉砕によって生成されるサイズ範囲と同様である。

4.特定のサイズ範囲の穀物の精製

注意: マトリックス内の粒子のサイズを制御する必要がある場合は、次のろ過ベースの粒子精製手順を使用します。

1. グレインを手動または電気式の40 μmフィルターメッシュストレーナーに移します。
2. ストレーナーを通して粒子をふるいにかけて、粒子を2つの特定の範囲に分割します(電気ストレーナーを使用する場合は、次の条件をお勧めします:振とう= 600振幅/分、バウンス= 6 / s)。この手順では、1つは<40 μm、もう1つは>40 μmの2つのグループの粒径を生成します。
   注: 2 つのサイズは、さまざまなメッシュのストレーナーを使用して決定できます。より制限された範囲が必要な場合は、ステップ4.2から異なるメッシュのストレーナーを通して各グループを再ふるいにかけます。
3. 穀物をオートクレーブします。

5.サンゴの穀物でコーティングされた皿またはカバーガラスの準備

1. フラスコ、プレート、またはペトリ皿のコーティング用
   注意: 次の手順は、無菌条件下で実行する必要があります。
   1. サンゴの骨格粒子をハンクス溶液に溶解した20 μg/mLのポリ-D-リジン(PDL)溶液に加えます。推奨される濃度は、1 mL PDL溶液あたり5 mg / 10 mgの穀物です。
   2. 溶液をフラスコとディッシュ(約2 mL/25 cm²)に注ぎ、4°Cで一晩インキュベートします。 穀物は沈み、底に付着します。
   3. 翌日、フラスコと皿を滅菌重水素減少水で一度洗います。フラスコと皿をフードで乾かします。
      注:コーティングしたばかりのフラスコと皿を使用することが好ましい。コーティングされたフラスコとディッシュは、4°Cで保存すれば、コーティング後1週間まで使用できます。 ただし、マトリックスの有効性が損なわれる可能性があります。
2. コーティングガラスカバースリップ(直径12mm、厚さ0.17mm)
   1. サンゴの骨格粒子を任意の所望の濃度で重水素減少水に加える。神経細胞に使用される一般的な密度は、5 mg / mLおよび10 mg / mLです。カバーガラスの中央に40 μLの穀物溶液を注ぎます(図4)。
   2. カバーガラスを80°Cに予熱した加熱プレートに置き、完全に蒸発するのを待ちます(通常15分)。これらの条件下では、穀物はカバーガラスに付着します。コーティングされたカバースリップをオートクレーブします。無菌状態で保管してください。
   3. 培養の前日に、滅菌済みの24ウェルプレートの蓋にカバーガラスを置きます。各カバーガラスに100 μLの20 μg/mL PDL溶液を加えます。先端を使用して、液体が粒子領域全体とカバーガラス表面の残りの部分を覆っていることを確認します。
   4. プレートの底で蓋をします。プレートの側面をパラフィンフィルムで包みます。4°Cで一晩インキュベートします。
   5. 翌日、重水素減少水で一度洗い、フードで乾かします。
      注意: 新しくコーティングされたカバーガラスを使用することをお勧めします。

6. サンゴ骨格粒子被覆ガラスカバーガラス上での海馬解離細胞の培養

注:海馬解離細胞培養の方法は、以前に公開された手順^24、27から変更されました。培養物の調製は、4匹のラットの仔について記載されている。各海馬からの期待収量は1〜1.5 x 10⁶ 細胞です。

1. セットアップ
   1. 空の60 mmペトリ皿を準備します。2 mLの最小必須培地(MEM)を60 mmのペトリ皿に注ぎ、氷の上に置きます。
   2. 2 mLのMEMを35 mmディッシュに注ぎ、37°C、5〜10%CO₂のインキュベーターに入れます。2 mLのMEMを15 mLのチューブに注ぎ、4°Cに保ちます。
   3. 1 mLの初日培地を15 mLチューブに注ぎ、37°C、5〜10%_CO2のインキュベーターに入れます。
      注:初日培地の組成は、 材料の表に記載されています。
   4. 200 μLの2.5%トリプシン溶液を解凍し、37°Cでインキュベートします。
   5. 炎を使用して、直径0.5 mm、0.75 mm、および1.0 mmのヘッドを備えた3つのガラスパスツールピペットを準備します。
   6. 大きなハサミ1本、小さなハサミ2本、大きなピンセット1本、小さなピンセット4本、メス1本など、適切な手術器具を準備します。
   7. フードに実体顕微鏡を用意します。
2. 大きなはさみを使用して、0〜3日齢のSprague Dawleyラットの子犬を、頭を体から切り離して空の60mmペトリ皿に犠牲にします(ステップ6.1.1)。遺体を処分します。
3. 大きなピンセットで口から頭を持って頭を持ち上げます。小さなハサミで頭蓋骨を覆っている皮膚を切ります。
4. きれいなはさみで頭蓋骨の下(小脳の側面)に入り、頭蓋骨を右と左に切断して除去できるようにします。小さなピンセットを使用して、頭蓋骨を脳から剥がします。
5. きれいなピンセットで脳を頭から分離し、60 mLの冷たいMEMを含む2 mmのペトリ皿に入れます(手順6.1.2を参照)。
6. 2本の小さなピンセットを使用して、実体顕微鏡下で海馬を解剖します。海馬をMEMを含む準備された35 mmディッシュ(ステップ6.1.2から)に移します。
   注意: 子犬ごとに手順6.3〜6.6を繰り返す必要があります。
7. メスを使って海馬を約1mmスライスに切ります。200μLのトリプシン溶液(最終濃度0.25%に希釈)を加える。穏やかに混合し、37°C、5〜10%CO₂ で30分間インキュベートします。
8. インキュベーション後、2 mLのコールドMEM(ステップ6.1.2)をディッシュに追加して、トリプシンを失活させます。最大径のガラスパスツールピペットを使用して(ステップ6.1.5)、37°Cに予熱した1 mLの初日培地(ステップ6.1.3)を含む15 mLチューブにトリプシン処理組織を移します。
   注:組織のさらなる処理に最適な培地と組織の比率(v:v)は、1 mL / 8海馬です。培地を組織と一緒に移すことはできるだけ避けてください。
9. 組織を最大直径のガラスピペットに10〜15回通して粉砕します。次に、中径のガラスピペットを使用してこのプロセスを繰り返します。最小直径のピペットで粉砕を続けます。細胞死を減らすために泡立ちを避けてください。
10. 残りの組織片を2〜5分間沈め、上清を別の15 mLチューブに移します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
    注:好ましい細胞密度は200,000〜400,000細胞/ mLです。First Day 培地を使用して、470 x g で希釈または遠心分離し、細胞を濃縮します。
11. 各ガラスカバーガラスに100 μLの細胞を播種します。播種中は、カバーガラス全体を細胞で覆うようにしてください。37°C、5〜10%CO₂でインキュベートします。
12. 翌日、500 μLの神経細胞成長培地をウェルに加えます。
    注:神経細胞成長培地の組成は、 材料の表に記載されています。
13. ピンセットを使用して各カバーガラスを適切なウェルにそっと移し、カバーガラスを傾けて初日培地を取り外します。蓋から残りのメディアを吸引します。
14. 37°C、5〜10%CO 2でインキュベートします_。 インキュベーション中は培地の交換を避けてください。 培養はこれらの条件下で1ヶ月まで維持することができる。主な懸念は湿度です。したがって、インキュベーターを最大限に加湿した状態に維持するようにしてください。

結果

サンゴ骨格マトリックスを調製するために、サンゴ骨格全体(図1A)をハンマーを使用して0.5〜2 cmの断片に分割し(図1B)、10%次亜塩素酸塩溶液、1M NaOH溶液、および30%_H2O2溶液(図1C)を使用して3つのステップ(プロトコルのステップ1)を通じて有機残留物から完全に洗浄しました。サンゴの破片は、骨格の色が茶色(図<...

ディスカッション

ここで紹介する手法は、培養中の神経細胞の維持と機能を改善する方法を説明しています。これは、細胞を育成し、その成長と活動を促進するサンゴの骨格粒子で作られたマトリックスに細胞を接着することによって達成されます。この手法を使用すると、脳内の細胞の環境を模倣する神経培養モデルの能力が向上します。

培養基質としてのマトリックスの導入は、古?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	#A4503
D – glucose	Sigma	#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)	Sigma	#D5796
Electrical sieve	Ari Levy	#3700
Fetal Bovine Serun (FBS)	Biological Industries	#04-007-1A
First Day Medium			85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose.
Flasks	Greiner	#60-690160	25cm^2, Tissue culture treated
Fluoro-deoxy-uridine	Sigma	#F0503
Glass Coverslips	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	Hazardous
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Sigma	#N4888
HANK'S solution	Sigma	#H6648
Kynurenic acid	Sigma	#K3375
L - glutamine	Sigma	#G7513
Manual strainer (40µm)	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)	Sigma	#M2279
Mortar and pestle	De-Groot	4-P090
NaClO (Sodium Hypochlorite)	Sigma	#425044	Hazardous
NaOH	Sigma	#S8045	Hazardous
Neuronal Growth Medium			45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine.
Petri dish	Greiner	#60-628160, #60-627160	60mm, 35mm, respectively.
Poly D – Lysine	Sigma	#P7280
Smart Dentin Grinder	KometaBio	#GR101
Trypsin	Gibco	#15-090-046
Uridine	Sigma	#U3750