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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que produce sobreentrenamiento e incubación del miedo en ratas. Este protocolo implica una sola sesión de entrenamiento con 25 emparejamientos de choque de tono (es decir, sobreentrenamiento) y una comparación de las respuestas de congelación condicionadas durante las pruebas de contexto y cue 48 h (corto plazo) y 6 semanas (a largo plazo) después del entrenamiento.

Resumen

La memoria emocional se ha estudiado principalmente con paradigmas de acondicionamiento del miedo. El condicionamiento del miedo es una forma de aprendizaje a través de la cual las personas aprenden las relaciones entre los eventos aversivos y los estímulos neutrales. Los procedimientos más utilizados para estudiar recuerdos emocionales implican el condicionamiento del miedo en ratas. En estas tareas, el estímulo no condicionado (EE.UU.) es un footshock presentado una o varias veces a través de una o varias sesiones, y la respuesta condicionada (CR) se está congelando. En una versión de estos procedimientos, llamados acondicionamiento del miedo cued, un tono (estímulo condicionado, CS) se empareja con los reposapiés (EE.UU.) durante la fase de entrenamiento. Durante la primera prueba, los animales se exponen al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento, y las respuestas de congelación se prueban en ausencia de tornillos y tonos (es decir, una prueba de contexto). Durante la segunda prueba, la congelación se mide cuando se cambia el contexto (por ejemplo, manipulando el olor y las paredes de la cámara experimental) y el tono se presenta en ausencia de reposapiés (es decir, una prueba de cue). La mayoría de los procedimientos de acondicionamiento del miedo implican pocos emparejamientos de choque de tono (por ejemplo, 1-3 ensayos en una sola sesión). Existe un interés creciente en las versiones menos comunes que implican un gran número de emparejamientos (es decir, sobreentrenamiento) relacionados con el efecto duradero llamado incubación del miedo (es decir, las respuestas al miedo aumentan con el tiempo sin una mayor exposición a eventos aversivos o estímulos condicionados). Las tareas de acondicionamiento del miedo extendidas han sido clave para entender los aspectos conductuales y neurobiológicos de la incubación del miedo, incluida su relación con otros fenómenos psicológicos (por ejemplo, trastorno de estrés postraumático). Aquí, describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que produce sobreentrenamiento y la incubación del miedo en ratas. Este protocolo implica una sola sesión de entrenamiento con 25 emparejamientos de choque de tono (es decir, sobreentrenamiento) y una comparación de las respuestas de congelación condicionadas durante las pruebas de contexto y cue 48 h (corto plazo) y 6 semanas (a largo plazo) después del entrenamiento.

Introducción

La memoria es un proceso psicológico que abarca diferentes fases: adquisición de información, consolidación (permite la estabilidad de la información adquirida) y recuperación (evidencia para el proceso de consolidación)1. Durante la fase de consolidación, se produce el establecimiento de nuevas conexiones sinápticas y la modificación de conexiones preexistentes. Esto sugiere la necesidad de un período de tiempo durante el cual se producen eventos moleculares y fisiológicos responsables de estos cambios1,2. Estos cambios fisiológicos o moleculares varían si los eventos recuperados están cargados emocionalmente o no (es decir, memoria emocional). Por ejemplo, la investigación ha demostrado que el núcleo lateral y el complejo basolateral de la amígdala son particularmente relevantes para la memoria emocional3,4,5.

Los fenómenos de memoria emocional se han estudiado principalmente con paradigmas de condicionamiento del miedo5,,6. El condicionamiento del miedo es una forma de aprendizaje a través de la cual las personas aprenden las relaciones entre los eventos aversivos y los estímulos neutros7. Los paradigmas de acondicionamiento del miedo producen cambios moleculares, celulares y estructurales en la amígdala. Además, el condicionamiento del miedo modifica la conectividad del hipocampo durante los procesos de consolidación y recuperación de la memoria emocional.

Uno de los procedimientos más utilizados para estudiar los recuerdos del miedo es el acondicionamiento clásico (Pavlovian) en ratas. Este procedimiento normalmente utiliza footshock (EE.UU.) como el estímulo aversivo, que se entrega una o varias veces a través de una o varias sesiones. La respuesta condicionada (CR) de las ratas expuestas a este procedimiento es la congelación (es decir, "inmovilidad generalizada causada por una respuesta tónica generalizada de la musculatura esquelética de los animales, excepto los músculos utilizados en la respiración"7 ). Esta respuesta podría evaluarse en dos tipos de pruebas: pruebas de contexto y cue. Para la prueba de contexto, el sujeto se somete a un número determinado de reposapiés durante la sesión de entrenamiento, y luego se retira de la cámara experimental durante un tiempo definido. Durante la prueba, el sujeto vuelve al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento y se recogen diferentes medidas de congelación en ausencia de tornillos (por ejemplo, duración, porcentaje o frecuencia de los episodios de congelación), y en comparación con los niveles basales establecidos durante la fase de entrenamiento. Para el segundo tipo de prueba, cue test, un estímulo (normalmente un tono) se empareja con los reposapiés durante la fase de entrenamiento (es decir, estímulo condicional, CS). Una vez completado el entrenamiento, el animal se retira del contexto de entrenamiento durante un tiempo definido y posteriormente se coloca en un contexto modificado (por ejemplo, una cámara experimental diferente que tiene diferentes formas de paredes y olor diferente). A continuación, se presenta la cue un número determinado de veces, y las respuestas de congelación a la cue se miden y se comparan con los niveles basales recopilados durante el entrenamiento. La versión más común de este paradigma utiliza emparejamientos de choque de tono de 1 a 3 durante una sola sesión de entrenamiento, seguido de pruebas de contexto y cue realizadas una serie de horas o unos días más tarde.

Otros procedimientos de acondicionamiento del miedo menos frecuentemente implementados implican un gran número de emparejamientos de choque -cue (es decir, ensayos), que a menudo se han llamado procedimientos de sobreentrenamiento8. Un interés creciente en estas tareas está relacionado con sus efectos de memoria duraderos y aumentados llamados incubación del miedo (es decir, las respuestas al miedo condicionadas aumentan con el tiempo en ausencia de una mayor exposición a eventos aversivos o estímulos condicionados)9,,10,,11. Un ejemplo de estos procedimientos de sobreentrenamiento implica una fase de entrenamiento de 100 emparejamientos de choque de tono distribuidos en 10 sesiones, seguido de pruebas de contexto y cue realizadas 48 h y 30 días después11,,12. Para evitar una amplia formación distribuida a lo largo de varios días, Maren (1998) informó que el sobreentrenamiento podría establecerse y optimizarse en una sola sesión con 25 emparejamientos8. El efecto de incubación se evidencia en niveles significativamente más altos de miedo condicionado en ratas probadas 31 días después del entrenamiento, en comparación con ratas probadas 48 h después. Las tareas de acondicionamiento del miedo extendidas han sido clave para la comprensión de los aspectos conductuales y neurobiológicos subyacentes a la incubación del miedo, incluyendo su relación con otros fenómenos psicológicos (por ejemplo, trastorno de estrés postraumático de inicio retrasado)11,12,13.

Aquí, describimos un protocolo de acondicionamiento de miedo extendido que induce el sobreentrenamiento y la incubación del miedo en ratas. A diferencia de otros paradigmas que requieren varios días de entrenamiento11,el protocolo actual se centra en una sola sesión de entrenamiento8. Utilizamos 25 emparejamientos de choque de tono para producir respuestas de congelación condicionadas más altas durante el contexto y las pruebas de cue realizadas 6 semanas después del entrenamiento, en comparación con las pruebas realizadas 48 h después.

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Protocolo

El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). Se respetaron la declaración universal de derechos de los animales emitida por la Liga Internacional de Derechos de los Animales, Ginebra, Suiza (1989), y los principios éticos de experimentación con los animales emitidos por el ICLAS.

1. Preparación del sujeto

  1. Seleccione ratas Wistar adultas machos (n.o 12). Alojarlos en grupos de cuatro por jaula durante tres días de aclimatación, antes del inicio del protocolo de entrenamiento y pruebas. Proporcionar a las ratas acceso gratuito al agua durante todo el experimento. Controlar la temperatura ambiente entre 20oC y 25oC, bajo un ciclo claro-oscuro de 12 horas (luces encendidas a las 07:00 h).
    NOTA: Las cepas de rata habían mostrado un rendimiento diferencial durante el acondicionamiento del miedo. Por ejemplo, Schaap et al. (2013) informaron que las cepas Wistar y Lewis mostraron duraciones más largas de comportamiento de congelación en comparación con las ratas Fawn Hooded y Brown Norway12. Por lo tanto, se deben evaluar las diferencias en el dolor y el umbral térmico para ajustar la intensidad y duración de los shocks.
  2. Mantener las ratas en el 85% de sus pesos de alimentación libre (peso normal entre 350-400 g) dando acceso restringido a los alimentos a la misma hora todos los días. Pesar las ratas todos los días a la misma hora durante el ciclo de luz. Calcula el peso ad lib (100% de peso) durante tres días antes del inicio del entrenamiento de acondicionamiento de miedo extendido.
    NOTA: Los animales utilizados en el presente experimento fueron probados en pruebas instrumentales adicionales que no se informan aquí. Se requirió la privación de alimentos para esas pruebas adicionales. Esta variación de procedimiento se supone que es probable que amplíe el alcance del presente procedimiento, ya que sugiere la posibilidad de pruebas combinadas de miedo instrumental. Sin embargo, los estudios que solo utilizan pruebas de acondicionamiento del miedo no requerirán privación de alimentos.
  3. Asignar aleatoriamente sujetos a uno de los siguientes grupos: pruebas emocionales 6 semanas después del entrenamiento (n a 6); pruebas emocionales 48 h después del entrenamiento (n.o 6).
  4. Realizar entrenamientos y pruebas a horas similares, durante la fase de luz del ciclo de luz oscura. Asigne a los animales a la misma cámara experimental y mantenga el mismo orden de los animales durante el entrenamiento y las pruebas.
    NOTA: Un control adicional que podría implementarse es contrarrestar el orden de los animales durante las fases de entrenamiento y prueba. Se recomienda usar esta técnica cuando se evalúan varios grupos, o se aplican diferentes tareas en todos los experimentos, para reducir un posible efecto del orden de tareas en el comportamiento.

2. Ajuste del aparato y calibración de choques

  1. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  2. Conecte el equipo a un ordenador mediante un cable USB e inicie el equipo del sistema de detección de congelación: la CPU, el gabinete de control, la luz infrarroja, el estimulador/scrambler aversivo y el calibrador de intensidad de choque.
    NOTA: Aunque este protocolo se ejecutó utilizando instrumentos disponibles comercialmente (Tabla de Materiales), se pueden utilizar equipos y software de diferentes marcas. El aparato consiste en una cámara cuadrada acrílica interna (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, llamada cámara experimental) incrustada en una caja de madera cubierta con plástico formico. Las puertas externas permiten el aislamiento de sonido, ruido o luz (puertas de caja atenuantes). La cámara se encuentra lateralmente en la parte interna de la puerta externa. La caja de acrílico interna con rejillas metálicas de suelo (36 varillas de acero inoxidable, cada una de 3 mm de diámetro y espaciada de 8 mm, de centro a centro) permite la entrega de reposapiés. En una de las paredes laterales internas, un altavoz se encuentra a 6 cm del suelo para presentar una señal auditiva.
  3. Conecte los clips rojos y negros del calibrador de intensidad de choque (es decir, conectores positivos y negativos) a dos varillas diferentes en el suelo de la rejilla. Conecte el cable USB al puerto correspondiente del ordenador. Asegúrese de conectar los clips rojos y negros a las barras separadas por otra barra.
    NOTA: En esta sección se describe el proceso de calibración de la intensidad de los golpes utilizando una marca específica de equipos mencionada en la Tabla de materiales. Sin embargo, el proceso de calibración se puede realizar utilizando diferentes marcas de equipos. Se recomienda calibrar la intensidad del choque en tres sectores del suelo de la rejilla para verificar que es consistente. Además, retire siempre los residuos de orina y fecales del suelo de la rejilla para evitar interferencias durante la entrega del choque.
  4. Inicie el software calibrador de intensidad de choque (Tabla de materiales). Elija una intensidad de 1,0 mA en la aplicación haciendo clic en la flecha de rango. A continuación, cambie el interruptor Ejecutar/Detener a Ejecutar.
    NOTA: Proponemos 1.0 mA basado en nuestros estudios con modelos de roedores en nuestro laboratorio y literatura que reporta un rango de 0.75 mA a 1.5 mA como adecuado para estudios de miedo condicionando33,,34,,35.
  5. Encienda el estimulador aversivo o el equipo utilizado para entregar los reposapiés y observe la intensidad de choque que se muestra en el panel de la aplicación. Si es necesario, ajuste la intensidad a 1,0 mA con la perilla del estimulador aversivo.
    NOTA: El estimulador aversivo debe establecerse en "OUT" para probar, calibrar y ejecutar adecuadamente el experimento.

3. Calibración del sistema de detección de congelación

  1. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido. No introduzca el animal en este punto, ya que se colocará en la cámara después de que se haya completado la calibración del sistema de detección de congelación. Compruebe que la intensidad de la luz dentro de la caja está entre 20 y 30 lux.
  2. Inicie el software del sistema de detección de congelación y abra la ventana de diálogo Configuración de experimento. Introduzca los detalles de cada asunto (como el número de identificación del sujeto, la fecha y el grupo) y cargue el archivo titulado "Protocolo de entrenamiento VFC.pro" (disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    NOTA: Las pruebas de contexto y cue utilizan una configuración de programa diferente; por lo tanto, asegúrese de utilizar el archivo correcto en cada prueba. En este punto, el archivo correcto corresponde a "Protocolo de entrenamiento VFC.pro". Recuerde que durante las fases de prueba el archivo correspondiente será diferente a la sesión de entrenamiento.
  3. Elija las cámaras correspondientes y marque la opción Guardar vídeo (si es necesario). Establezca el Umbral de movimiento en 100 y Duración mínima de congelación en 30 fotogramas.
    NOTA: Este valor de Umbral de movimiento se basa en el tamaño de la especie utilizada (basado en el número de píxeles). El fabricante recomienda el valor de Duración mínima de congelación. Estos valores se utilizan para garantizar el reconocimiento adecuado del animal en la cámara.
  4. Compruebe que la transmisión en directo de las cámaras elegidas aparezca en la pantalla, junto con el gráfico de umbral de movimiento y la línea de tiempo de los diferentes estímulos que se presentan durante el entrenamiento (por ejemplo, sonido y choque).
    NOTA: Utilizando una marca diferente, la configuración del equipo debe ofrecer la posibilidad de medir los movimientos del animal para detectar un "índice" de movimiento que debe permitir comparaciones sobre la cantidad de tiempo que el animal se está moviendo o congelando. Otra posibilidad es utilizar un software que con sólo la fuente de vídeo (durante o después del experimento) puede detectar la cantidad de tiempo que el animal está en movimiento o congelación, como el software libre ImageFZ13,caja de herramientas de código abierto en Matlab14,o un clasificador libre de comportamiento animal como JAABA15.
  5. Haga clic en la opción Calibrar tres veces, mientras comprueba que el índice de movimiento permanece por debajo de 100 (umbral). A continuación, configure el equipo para que se bloquee haciendo clic en el botón correspondiente en la pantalla.
    NOTA: En esta sección se describe un proceso de calibración del sistema de detección de congelación utilizando una marca específica de equipos enumerados en la Tabla de materiales. Como se mencionó anteriormente, el proceso de calibración se puede llevar a cabo utilizando diferentes marcas de equipos (para una revisión de diferentes opciones en equipos y software véase Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Entrenamiento extendido de acondicionamiento del miedo

  1. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen, cubiertas con un paño, desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual en el laboratorio. Evite la exposición al ruido o a las condiciones generadoras de estrés durante el transporte de animales a la sala de entrenamiento conductual. Si varios animales son transportados al mismo tiempo, sólo traiga a los animales para ser probados y mantenga otras ratas en una sala de retención para mejorar el control experimental. Manipule suavemente a los animales durante 2 minutos antes de comenzar el entrenamiento.
    NOTA: En el protocolo, los animales fueron manipulados cada día durante 2 minutos antes del entrenamiento conductual. Después de la manipulación, los animales fueron introducidos en la cámara experimental. Recomendamos manipular animales para hacer que las ratas habitulen al investigador.
  2. Introducir la rata a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  3. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Deje que la rata se aclimate a la cámara durante 3 minutos. Este período de 3 minutos es el estándar recomendado por el fabricante del equipo y sirve como línea de base y tiempo de habituación a la cámara.
  4. Ofrezca veinticinco emparejamientos de choque de tono (pruebas) con un intervalo de pruebas (ITI) de 60 s, a partir del minuto 3 de la sesión. Presente el tono (estímulo condicionado – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) durante los últimos 10 s de cada ITI, y el choque (estímulo no condicionado – US) durante los últimos 2 s de cada ITI.
    NOTA: La activación del botón Grabar está condicionada a que las cámaras estén correctamente calibradas y bloqueadas.
  5. Retire la rata de la cámara experimental cuando termine la sesión de 28 minutos. Devuelva a los animales a la jaula de origen respectiva. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen cubiertas con un paño desde la sala de entrenamiento conductual hasta el centro de cuidado de animales.
  6. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1-3.5) y el acondicionamiento del miedo (pasos 4.1 y 4.3) para entrenar a todos los sujetos.
    NOTA: Recomendamos encarecidamente recalibrar el sistema de detección de cada animal para asegurarse de que el software mantiene los mismos parámetros cuando procesa la información para la detección de congelación.
  7. Período de descanso: Durante este período, pida a los animales que descansen individualmente en sus jaulas de origen. Monitorear el peso de los animales dos veces por semana durante las 6 semanas del período de incubación. Manipule suavemente a cada animal durante dos minutos mientras se ponderan.

5. Prueba de contexto – sesión única de 10 minutos

  1. Después de la fase de entrenamiento, exponga a los animales a la primera prueba de memoria llamada prueba de contexto. Durante esta fase de 10 min, exponga a las ratas al mismo contexto en el que se llevó a cabo el entrenamiento pero no presentaran señales ni choques. Transportar a las ratas en sus jaulas cubiertas del hogar (por ejemplo, con un paño) desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual. Tenga en cuenta que los animales se dividieron en grupos, por lo tanto un grupo se prueba 48 h después de la fase de entrenamiento y el otro grupo se prueba 6 semanas después del entrenamiento (ver Figura 1).

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Figura 1: Línea de tiempo del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  2. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1 a 3.5). Abra la ventana de diálogo Configuración del experimento y cargue el archivo denominado "protocol.pro de prueba de contexto", que está disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: Este archivo contiene la configuración de esta fase experimental que consta de ningún choque o tono.
  3. Introducir el animal a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  4. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Durante esta sola sesión de prueba de contexto de 10 minutos, no se presentan estímulos (no se puede impactar ni sonido).
  5. Retire el sujeto de la cámara experimental cuando la sesión de 10 minutos haya terminado. Devolver a los animales a sus respectivas jaulas y transportar a las ratas en sus jaulas cubiertas desde la sala de entrenamiento conductual al centro de cuidado de animales. Repita los pasos 5.2-5.5 para probar todos los sujetos.

6. Prueba Cue – sesión individual de 13 min

  1. Un día después de la prueba de contexto, pida a los animales que se sometan a la segunda prueba de memoria llamada cue test. Durante esta fase, las ratas estarán en un contexto diferente de entrenamiento durante 13 min;; se presentan señales (tonos), pero no se emiten choques. Transportar a las ratas en sus jaulas de origen cubiertas con una cubierta desde el centro de cuidado de animales a la sala de entrenamiento conductual. Pruebe un grupo 72 h después del entrenamiento de acondicionamiento del miedo, y pruebe a otro grupo 6 semanas y un día después del entrenamiento (Figura 1).
    NOTA: Se podría implementar un sistema diferente de transporte (desde el centro de cuidado de animales hasta la sala experimental) para diferenciar más el contexto y las pruebas de referencia. Dado que los animales fueron transportados a la sesión de entrenamiento y sesión de prueba de contexto en sus jaulas de origen, se podría utilizar una jaula de transporte diferente, ropa de cama y/o cubierta durante el transporte a la sesión de prueba.
  2. Limpie todas las superficies internas de la cámara experimental y el suelo de rejilla de acero inoxidable con un 10% de etanol. Repita antes de probar cada animal.
  3. Para cambiar el contexto visual, inserte la pared circundante de plástico en la cámara experimental.
  4. Para cambiar el contexto olfativo, aplicar 1% de ácido acético a un hisopo con punta de algodón, y colocarlo en la bandeja metálica debajo del piso de rejilla17,18,19.
  5. Repita la calibración del sistema de detección de congelación (pasos 3.1-3.5). Cargue el archivo denominado archivo "Cue test protocol.pro", que está disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    NOTA: Este archivo contiene la configuración de esta fase experimental, que consiste en la entrega de los mismos tonos presentados durante la fase de entrenamiento (CS), pero en ausencia de choques (EE.UU.).
  6. Introducir el animal a la cámara experimental. Manéjelo suavemente por la base de su cola y colóquelo en el centro de la cámara. Cierre la cámara experimental y las puertas de la caja que atenúan el sonido.
  7. Inicie la sesión haciendo clic en el botón Grabar. Durante la sola sesión de prueba cue de 13 minutos, el estímulo CS (tono) se presenta 10 veces, comenzando en el minuto 3 de la sesión.
    NOTA: Los primeros 3 minutos corresponden a la línea de base de esta sesión, seguido de 10 ensayos de prueba (es decir, 10 s cada uno) entregados con 50 s de ITIs en ausencia de choques. La entrega de tonos es automática, mediante el uso del archivo previamente cargado.
  8. Retire al animal de la cámara experimental cuando termine la sesión de 13 minutos. Devolver los animales a la jaula respectiva y transportarlos cubiertos a la instalación de cuidado de animales. Repita los pasos 6.2 a 6.5 para probar todos los sujetos.

7. Análisis de datos

  1. Obtenga el índice de actividad general (es decir, índice de movimiento) que se deriva de la secuencia de vídeo mediante el software del sistema de detección de congelación. Este software transforma automáticamente el índice de movimiento para proporcionar el porcentaje de tiempo de congelación por sesión y el número de episodios de congelación. Establezca el umbral de congelación en el ajuste predeterminado Duración mínima de congelación del sistema (1 s a 30 fotogramas).
  2. Utilice el programa personalizado adicional (archivo disponible en http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ)para obtener:
    1. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación durante los tres primeros minutos de la sesión de entrenamiento (es decir, congelación de línea de base, ya que no se presentaron choques o tonos antes o durante ese período de 3 minutos) y durante los tres primeros minutos de la sesión de prueba cue.
    2. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación para cada uno de los ocho contenedores de 3 minutos de la sesión de entrenamiento.
    3. Utilice el programa para determinar el porcentaje de congelación durante las presentaciones cue (es decir, congelación durante los tonos) y períodos sin cue (intervalos intertriales; IT), tanto para sesiones de capacitación como de pruebas de cue.
  3. Para obtener estos datos, abra el software del sistema de detección de congelación.
    1. Seleccione Archivo ?? Informes ? Resumen de componentes por lotes.
    2. Seleccione el archivo con extensión . CMP disponible a partir de http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Asigne un nombre al archivo de salida y cambie Umbral de movimiento a 100. A continuación, haga clic en Aceptar.
    4. Seleccione los archivos que desea analizar (extensión . RAW). Estos archivos se generan automáticamente a partir del software del sistema de detección de congelación cuando la sesión ha terminado y corresponden a los datos sin procesar de cada sesión. Inicialmente, los archivos se guardan en el escritorio del ordenador, pero se pueden almacenar en una carpeta personalizada (por ejemplo, condicionamiento documentos-miedo) para facilitar su posterior identificación y apertura cuando necesitan ser analizados.
    5. Abra los archivos de salida (extensión . CSV). Se pueden editar en un software de hoja de cálculo para su posterior análisis. Este archivo contiene los resultados de la congelación durante la sesión experimental.
      NOTA: Para obtener el porcentaje total de congelación, divida el tiempo que el sujeto pasó inmóvil durante el tiempo total de la sesión. El número de episodios de congelación se puede calcular contando el número de eventos de congelación a través de la sesión. En ambos casos, es necesario definir un umbral de movimiento basado en una duración mínima de congelación. Este es el criterio temporal que define si se registra un episodio de congelación. Los sistemas automatizados de grabación pueden utilizar cierta cantidad de fotogramas por segundo (fps) como medida de la duración mínima de congelación. Por ejemplo, con una frecuencia de muestreo de 30 fps, una duración mínima de congelación de 15 fotogramas registrará como congelación de una instancia de inmovilidad que dura 30 s.
  4. Calcula la duración media de cada episodio de congelación para cada sesión (entrenamiento y ambas pruebas, contexto y cue) dividiendo la duración total de congelación (en segundos) sobre el número total de episodios de congelación.

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Resultados

Se analizaron variaciones en el porcentaje de tiempo de congelación durante las diferentes etapas de la sesión de entrenamiento para todas las asignaturas (n a 12) utilizando una prueba t dependiente (Tabla 1). Los animales fueron activos y exploraron la cámara experimental durante los primeros tres minutos de la sesión de entrenamiento (primer día del protocolo), tiempo durante el cual no se entregaron tonos o choques (es decir, línea de base-BL). Como se mues...

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Discusión

El actual protocolo de acondicionamiento del miedo extendido es un enfoque eficiente y válido para evaluar la memoria emocional en períodos cortos (48 h) y largo plazo (6 semanas). Por lo tanto, el protocolo permite estudiar fenómenos de sobreentrenamiento y miedo de incubación en ratas. Entre las diferentes ventajas de este protocolo se encuentran las siguientes. Ofrece dos tipos de pruebas de memoria, a saber, context y cue, que permiten identificar el efecto diferencial de dos retrasos (48 h y 6 semanas) a través...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por la Fundación Universitaria Konrad Lorenz - número de subvención 9IN15151. Los autores quieren agradecer al Departamento de Comunicaciones de la Universidad Konrad Lorenz su ayuda en la grabación y edición del vídeo, en particular Natalia Rivera y Andrés Serrano (Productores). También, Nicole Pfaller-Sadovsky y Lucía Medina por sus comentarios sobre el manuscrito, y Johanna Barrero, decano de Corporacion Universitaria Iberoamericana, para colaboración institucional. Los autores no tienen conflictos de intereses.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid (ethanoic acid)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current PackageMED Associates IncENV-420https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall InsertMED Associates IncVFC-008-CWIhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.ziphttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control BoxMED Associates IncNIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for MouseMED Associates IncENV-005FPU-Mhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power SupplyMED Associates IncSG-6080Dhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz)MED Associates IncENV-414Shttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning ChamberMED Associates IncVFC-008https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for RatMED Associates IncMED-VFC-SCT-Rhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

Referencias

  1. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
  2. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
  3. Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
  4. Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
  5. LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
  6. Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
  7. Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
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