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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten Übertraining und Angstinkubation erzeugt. Dieses Protokoll beinhaltet eine einzige Trainingseinheit mit 25 Ton-Schock-Paarungen (d. h. Übertraining) und einen Vergleich der konditionierten Gefrierreaktionen während der Kontext- und Cue-Tests 48 h (kurzfristig) und 6 Wochen (langfristig) nach dem Training.

Zusammenfassung

Emotionales Gedächtnis wurde in erster Linie mit Angst-Konditionierung Paradigmen untersucht. Angstkonditionierung ist eine Form des Lernens, durch die Individuen die Beziehungen zwischen aversiven Ereignissen und ansonsten neutralen Reizen lernen. Die am häufigsten genutzten Verfahren zum Studium emotionaler Erinnerungen beinhalten Angstkonditionierung bei Ratten. Bei diesen Aufgaben ist der unkonditionierte Stimulus (US) ein Fußschock, der ein- oder mehrmals über einzelne oder mehrere Sitzungen hinweg präsentiert wird, und die konditionierte Reaktion (CR) friert ein. In einer Version dieser Verfahren, genannt cued Angst konditionierung, wird ein Ton (konditionierter Stimulus, CS) mit Fußschocks (US) während der Trainingsphase gepaart. Während des ersten Tests werden die Tiere dem gleichen Kontext ausgesetzt, in dem das Training stattgefunden hat, und Frostreaktionen werden in Abwesenheit von Fußschocks und -tönen (d. h. einem Kontexttest) getestet. Während des zweiten Tests wird das Einfrieren gemessen, wenn der Kontext geändert wird (z. B. durch Manipulation des Geruchs und der Wände der Versuchskammer) und der Ton wird in Abwesenheit von Fußschocks (d. h. einem Cue-Test) dargestellt. Die meisten cued Angst Konditionierung Verfahren beinhalten wenige Ton-Schock-Paarungen (z.B. 1-3 Versuche in einer einzigen Sitzung). Das Interesse an weniger häufigen Versionen, die eine große Anzahl von Paarungen (d. h. Übertraining) im Zusammenhang mit dem langanhaltenden Effekt der Angstinkubation beinhalten, wächst (d. h. Angstreaktionen nehmen im Laufe der Zeit zu, ohne dass aversive Ereignisse oder konditionierte Reize ausgesetzt sind). Erweiterte Aufgaben zur Angstkonditionierung waren der Schlüssel zum Verständnis der verhaltens- und neurobiologischen Aspekte der Angstinkubation, einschließlich ihrer Beziehung zu anderen psychologischen Phänomenen (z. B. posttraumatische Belastungsstörungen). Hier beschreiben wir ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten übertrainierenund inkubiert. Dieses Protokoll beinhaltet eine einzige Trainingseinheit mit 25 Ton-Schock-Paarungen (d. h. Übertraining) und einen Vergleich der konditionierten Gefrierreaktionen während der Kontext- und Cue-Tests 48 h (kurzfristig) und 6 Wochen (langfristig) nach dem Training.

Einleitung

Speicher ist ein psychologischer Prozess, der verschiedene Phasen umfasst: Informationserfassung, Konsolidierung (ermöglicht die Stabilität erworbener Informationen) und Abruf (Beweis für den Konsolidierungsprozess)1. Während der Konsolidierungsphase erfolgt der Aufbau neuer synaptischer Verbindungen und die Änderung bereits bestehender Verbindungen. Dies deutet auf die Notwendigkeit für einen Zeitraum hin, in dem molekulare und physiologische Ereignisse auftreten, die für diese Veränderungen verantwortlich sind1,2. Diese physiologischen oder molekularen Veränderungen variieren, ob die abgerufenen Ereignisse emotional geladen sind oder nicht (d. h. emotionales Gedächtnis). Zum Beispiel hat die Forschung gezeigt, dass der laterale Kern und der basolaterale Amygdala-Komplex für das emotionale Gedächtnis besonders relevant sind3,4,5.

Emotionale Gedächtnisphänomene wurden in erster Linie mit Angstkonditionierung Paradigmen5,6untersucht. Angstkonditionierung ist eine Form des Lernens, durch die Individuen lernen die Beziehungen zwischen aversiven Ereignissen und ansonsten neutralen Reizen7. Angstkonditionierung Paradigmen produzieren molekulare, zelluläre, und strukturelle Veränderungen in der Amygdala. Darüber hinaus verändert Angstkonditionierung die Konnektivität des Hippocampus während der Konsolidierungs- und Abholprozesse des emotionalen Gedächtnisses.

Eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zum Studium von Angsterinnerungen ist die klassische (Pavlovian) Konditionierung bei Ratten. Dieses Verfahren verwendet in der Regel Footshock (US) als aversiven Stimulus, der ein- oder mehrmals über eine oder mehrere Sitzungen abgegeben wird. Die konditionierte Reaktion (CR) von Ratten, die diesem Verfahren ausgesetzt sind, ist das Einfrieren (d. h. "generalisierte Immobilität, verursacht durch eine verallgemeinerte tonische Reaktion der Skelettmuskulatur der Tiere mit Ausnahme der Muskeln, die bei der Atmung verwendet werden"7 ). Diese Reaktion könnte anhand von zwei Arten von Tests bewertet werden: Kontext- und Cue-Tests. Für den Kontexttest erfährt das Probanden während der Trainingseinheit eine bestimmte Anzahl von Fußschocks und wird dann für eine definierte Zeit aus der Versuchskammer entfernt. Während der Prüfung wird das Probanden in den gleichen Kontext zurückgeführt, in dem die Ausbildung stattgefunden hat, und es werden verschiedene Maßnahmen des Einfrierens in Abwesenheit von Fußschocks (z. B. Dauer, Prozentsatz oder Häufigkeit von Gefrierepisoden) gesammelt und mit den während der Trainingsphase festgelegten Ausgangswerten verglichen. Für den zweiten Testtyp, den Cue-Test, wird während der Trainingsphase ein Stimulus (typischerweise ein Ton) mit den Fußschocks gepaart (d. h. bedingter Stimulus, CS). Nach Abschluss der Ausbildung wird das Tier für eine definierte Zeit aus dem Trainingskontext entfernt und anschließend in einen modifizierten Kontext gestellt (z.B. eine andere Versuchskammer, die unterschiedliche Wände und unterschiedliche Nriege hat). Der Cue wird dann eine bestimmte Anzahl von Malen angezeigt, und Die Gefrierreaktionen auf den Cue werden gemessen und mit den während des Trainings gesammelten Ausgangswerten verglichen. Die gängigste Version dieses Paradigmas verwendet 1 bis 3 Ton-Schock-Paarungen während einer einzelnen Trainingseinheit, gefolgt von Kontext- und Cue-Tests, die einige Stunden oder ein paar Tage später durchgeführt werden.

Andere weniger häufig implementierte Angstkonditionierungsverfahren beinhalten eine große Anzahl von Schock-Cue-Paarungen (d. h. Studien), die oft alsÜberschulungsverfahren8 bezeichnet wurden. Ein wachsendes Interesse an diesen Aufgaben hängt mit ihren langanhaltenden und erhöhten Gedächtniseffekten zusammen, die als Angstinkubation bezeichnet werden (d.h. bedingte Angstreaktionen nehmen im Laufe der Zeit zu, wenn aversive Ereignisse oder konditionierte Reize nicht mehr ausgesetzt sind)9,10,11. Ein Beispiel für solche Überschulungsverfahren ist eine Trainingsphase von 100 Ton-Schock-Paarungen, verteilt auf 10 Sitzungen, gefolgt von Kontext- und Cue-Tests, die 48 h und 30 Tage später11,12durchgeführt werden. Um ein umfangreiches Training über mehrere Tage zu vermeiden, berichtete Maren (1998), dass Übertraining in einer einzigen Sitzung mit 25 Paarungen8etabliert und optimiert werden konnte. Der Inkubationseffekt zeigt sich in deutlich höheren Konzentrationen von konditionierter Angst bei Ratten, die 31 Tage nach dem Training getestet wurden, im Vergleich zu Ratten, die 48 h danach getestet wurden. Erweiterte Aufgaben zur Angstkonditionierung waren der Schlüssel für das Verständnis von Verhaltens- und neurobiologischen Aspekten, die der Angstinkubation zugrunde liegen, einschließlich ihrer Beziehung zu anderen psychologischen Phänomenen (z. B. verzögerte posttraumatische Belastungsstörung)11,12,13.

Hier beschreiben wir ein erweitertes Angstkonditionierungsprotokoll, das bei Ratten zu Übertraining und Angstinkubation führt. Im Unterscheidet sich von anderen Paradigmen, die mehrere Tage Trainingerfordern 11, das aktuelle Protokoll ist auf eine einzelne Trainingseinheit 8konzentriert. Wir verwendeten 25 Ton-Schock-Paarungen, um höher konditionierte Gefrierreaktionen während Kontext- und Cue-Tests zu erzeugen, die 6 Wochen nach dem Training durchgeführt wurden, im Vergleich zu Tests, die 48 h danach durchgeführt wurden.

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Protokoll

Das folgende Protokoll wurde vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und Nutzung der Stiftung Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL) genehmigt. Die vom Internationalen Tierschutzbund Genf (1989) herausgegebene universelle Erklärung der Tierrechte und die vom ICLAS herausgegebenen ethischen Grundsätze des Experimentierens mit Tieren wurden respektiert.

1. Themenvorbereitung

  1. Wählen Sie männliche erwachsene Wistar Ratten (n = 12). Beherbergen Sie sie in Vierergruppen pro Käfig für drei Tage Akklimatisierung, vor Beginn des Trainings- und Testprotokolls. Bieten Sie Ratten während des gesamten Experiments freien Zugang zu Wasser. Kontrollieren Sie die Raumtemperatur zwischen 20 °C und 25 °C, unter einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus (Licht ein 07:00 h).
    HINWEIS: Rattenstämme hatten bei der Angstkonditionierung unterschiedliche Leistungen gezeigt. Zum Beispiel berichteten Schaap et al. (2013), dass Wistar- und Lewis-Stämme längere Daueren des Gefrierverhaltens zeigten als Fawn Hooded und Brown Norway Ratten12. Daher sollten Die Unterschiede bei Schmerzen und thermischen Schwellenwerten bewertet werden, um die Intensität und Dauer von Schocks anzupassen.
  2. Halten Sie Ratten bei 85% ihres frei fütternden Gewichts (Normalgewicht zwischen 350-400 g) aufrecht, indem Sie jeden Tag zu der gleichen Stunde eingeschränkten Zugang zu Lebensmitteln gewähren. Wiegen Sie Ratten jeden Tag zur gleichen Stunde während des Lichtzyklus. Berechnen Sie das Ad lib Gewicht (100% Gewicht) für drei Tage vor Beginn des erweiterten Angstkonditionierungstrainings.
    HINWEIS: Die im vorliegenden Experiment verwendeten Tiere wurden an weiteren Instrumentaltests getestet, die hier nicht gemeldet sind. Für diese zusätzlichen Tests war Nahrungsmittelmangel erforderlich. Diese Verfahrensänderung dürfte den Anwendungsbereich des vorliegenden Verfahrens erweitern, da sie das Potenzial für kombinierte Tests zwischen Instrumentalangst nahelegt. Studien, die nur Tests zur Konditionierung befürchten, erfordern jedoch keine Nahrungsmittelentzug.
  3. Nach dem Zufallsprinzip Probanden einer der folgenden Gruppen zuordnen: emotionale Tests 6 Wochen nach dem Training (n = 6); emotionale Prüfung 48 h nach dem Training (n = 6).
  4. Führen Sie Schulungen und Tests zu ähnlichen Stunden während der Lichtphase des Dunkellichtzyklus durch. Weisen Sie die Tiere derselben Versuchskammer zu und halten Sie die gleiche Reihenfolge der Tiere während des Trainings und der Prüfung aufrecht.
    HINWEIS: Eine zusätzliche Kontrolle, die implementiert werden könnte, ist das Ausgleichen der Reihenfolge der Tiere während der Trainings- und Testphasen. Es wird empfohlen, diese Technik zu verwenden, wenn Mehrere Gruppen bewertet werden oder verschiedene Aufgaben experimenteübergreifend angewendet werden, um einen möglichen Effekt der Aufgabenreihenfolge auf das Verhalten zu reduzieren.

2. Geräteeinstellung und Stoßkalibrierung

  1. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  2. Schließen Sie das Gerät über ein USB-Kabel an einen Computer an und starten Sie die Gefriererkennungssystemausrüstung: die CPU, den Steuerschrank, das Infrarotlicht, den aversiven Stimulator/Scrambler und den Stoßintensitätskalibrator.
    HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll mit handelsüblichen Instrumenten (Materialtabelle)ausgeführt wurde, können Geräte und Software verschiedener Marken verwendet werden. Das Gerät besteht aus einer inneren Acryl-Quadratkammer (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, genannt Versuchskammer), eingebettet in eine Holzkiste, die mit Kunststoff-Formik bedeckt ist. Die Außentüren ermöglichen die Isolierung von Schall, Lärm oder Licht (Dämpfung von Kastentüren). Die Kamera befindet sich seitlich im inneren Teil der Außentür. Die interne Acrylbox mit Bodenmetallgittern (36 Edelstahlstäbe, jeweils 3 mm Durchmesser und 8 mm Abstand, Mitte zu Mitte) ermöglicht die Fußabschlagabgabe. In einer der innen-seitlichen Wände befindet sich ein Lautsprecher 6 cm vom Boden entfernt, um einen auditiven Hinweis zu präsentieren.
  3. Verbinden Sie die roten und schwarzen Clips des Stoßintensitätskalibrators (d. h. positive und negative Anschlüsse) mit zwei beliebigen beliebigen Stäben auf dem Gitterboden. Schließen Sie das USB-Kabel an den entsprechenden Anschluss des Computers an. Stellen Sie sicher, dass Sie die roten und schwarzen Clips mit Balken verbinden, die durch eine andere Leiste getrennt sind.
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird der Kalibrierungsprozess der Stoßintensität unter Verwendung einer bestimmten Gerätemarke beschrieben, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Der Kalibrierungsprozess kann jedoch mit verschiedenen Gerätemarken durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Intensität des Schocks in drei Sektoren des Gitterbodens zu kalibrieren, um zu überprüfen, ob er konsistent ist. Entfernen Sie außerdem immer Fäkalien- und Urinrückstände aus dem Gitterboden, um Störungen während der Stoßzufuhr zu vermeiden.
  4. Starten Sie die Schockintensitäts-Kalibrator-Software (Tabelle der Materialien). Wählen Sie eine Intensität von 1,0 mA in der Anwendung, indem Sie auf den Bereichspfeil klicken. Ändern Sie dann den Run/Stop-Schalter in Run.
    HINWEIS: Wir schlagen 1,0 mA basierend auf unseren Studien mit Nagetiermodellen in unserem Labor und Literatur, die einen Bereich von 0,75 mA bis 1,5 mA als ausreichend für Studien der Angst konditionierung33,34,35berichtet.
  5. Schalten Sie den aversiven Stimulator oder die Ausrüstung ein, mit der die Fußschocks geliefert werden, und schauen Sie sich die Schockintensität an, die auf dem Bedienfeld der Anwendung angezeigt wird. Stellen Sie bei Bedarf die Intensität mit dem Knopf am aversiven Stimulator auf 1,0 mA ein.
    HINWEIS: Der aversive Stimulator sollte auf "OUT" eingestellt werden, um das Experiment entsprechend zu testen, zu kalibrieren und auszuführen.

3. Kalibrierung des Gefriererkennungssystems

  1. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren. Führen Sie das Tier an dieser Stelle nicht ein, da es nach Abschluss der Kalibrierung des Gefriersystems in die Kammer gelegt wird. Überprüfen Sie, ob die Lichtintensität in der Box zwischen 20 und 30 Lux liegt.
  2. Starten Sie die Software für das Gefriererkennungssystem, und öffnen Sie das Dialogfenster "Experiment-Setup". Geben Sie die Details zu den einzelnen Betreffs ein (z. B. Betreff-Identifikationsnummer, Datum und Gruppe) und laden Sie die Datei mit dem Titel "Trainingsprotokoll VFC.pro" (verfügbar unter http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
    HINWEIS: Kontext- und Cue-Tests verwenden eine andere Programmkonfiguration; Stellen Sie daher sicher, dass Sie bei jedem Test die richtige Datei verwenden. An dieser Stelle entspricht die richtige Datei "Trainingsprotokoll VFC.pro". Denken Sie daran, dass sich die entsprechende Datei während der Testphasen von der Trainingssitzung unterscheidet.
  3. Wählen Sie die entsprechende Kamera(n) aus und aktivieren Sie die Option Video speichern (falls erforderlich). Legen Sie den Bewegungsschwellenwert auf 100 und die Min-Gefrierdauer auf 30 Frames fest.
    HINWEIS: Dieser Bewegungsschwellenwert basiert auf der Größe der verwendeten Art (basierend auf der Anzahl der Pixel). Der Mindestwert für die Gefrierdauer wird vom Hersteller empfohlen. Diese Werte werden verwendet, um eine ordnungsgemäße Erkennung des Tieres in der Kammer zu gewährleisten.
  4. Stellen Sie sicher, dass der Live-Feed der gewählten Kamera(n) zusammen mit dem Bewegungsschwellendiagramm und der Zeitleiste der verschiedenen Reize, die während des Trainings angezeigt werden (z. B. Ton und Schock), auf dem Bildschirm angezeigt wird.
    HINWEIS: Mit einer anderen Marke sollte die Ausrüstungseinrichtung die Möglichkeit bieten, die Bewegungen des Tieres zu messen, um einen "Bewegungsindex" zu erkennen, der Vergleiche über die Zeit ermöglichen sollte, in der sich das Tier bewegt oder einfriert. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung einer Software, die nur mit der Videoquelle (während oder nach dem Experiment) die Zeit, in der sich das Tier in Bewegung befindet oder einfriert, erkennen kann, wie z. B. freie Software ImageFZ13, Open-Source-Toolbox in Matlab14oder ein kostenloser Klassifler tierischen Verhaltens als JAABA15.
  5. Klicken Sie dreimal auf die Option Kalibrieren, während Sie überprüfen, ob der Bewegungsindex unter 100 (Schwellenwert) bleibt. Stellen Sie dann die Zusperrung des Geräts ein, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche auf dem Bildschirm klicken.
    HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Systemzurfrierungssystem beschrieben, bei dem eine bestimmte Gerätemarke verwendet wird, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Wie bereits erwähnt, kann der Kalibrierungsprozess mit verschiedenen Marken von Geräten durchgeführt werden (für eine Überprüfung der verschiedenen Optionen in Ausrüstung und Software siehe Anagnostaras et al. 2010)16.

4. Erweitertes Angstkonditionstraining

  1. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einem Tuch bedeckten Käfigen von der Tierpflegeeinrichtung zum Verhaltenstrainingsraum im Labor. Vermeiden Sie die Exposition gegenüber Lärm oder stresserzeugenden Bedingungen während des Transports von Tieren in den Verhaltenstrainingsraum. Wenn mehrere Tiere gleichzeitig transportiert werden, bringen Sie die Tiere nur zu testen und halten Sie andere Ratten in einem Halteraum, um die experimentelle Kontrolle zu verbessern. Behandeln Sie die Tiere vor Beginn des Trainings vorsichtig 2 min lang.
    HINWEIS: Im Protokoll wurden die Tiere jeden Tag für 2 Minuten vor dem Verhaltenstraining behandelt. Nach der Handhabung wurden die Tiere in die Versuchskammer eingeführt. Wir empfahlen, Tiere zu manipulieren, um Ratten zum Forscher anzugewöhnen.
  2. Stellen Sie die Ratte in die Versuchskammer vor. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  3. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Lassen Sie die Ratte in der Kammer für 3 min akklimatisieren. Diese 3-min-Periode ist der vom Gerätehersteller empfohlene Standard und dient als Ausgangs- und Gewöhnungszeit zur Kammer.
  4. Liefern Sie 25 Ton-Schock-Paarungen (Tests) mit einem 60 s Inter-Trial Interval (ITI), beginnend mit Minute 3 der Sitzung. Präsentieren Sie den Ton (konditionierter Stimulus – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) während der letzten 10 s jedes ITI und den Schock (unkonditionierter Stimulus – US) während der letzten 2 s jedes ITI.
    HINWEIS: Die Aktivierung der Aufnahmetaste ist davon abhängig, dass Kameras ordnungsgemäß kalibriert und gesperrt werden.
  5. Entfernen Sie die Ratte aus der Versuchskammer, wenn die 28 min Sitzung vorbei ist. Bringen Sie die Tiere in den jeweiligen Heimkäfig zurück. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einem Tuch bedeckten Hauskäfigen vom Verhaltenstrainingsraum zur Tierpflegeeinrichtung.
  6. Wiederholen Sie die Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1-3.5) und die Angstkonditionierung (Schritte 4.1 und 4.3), um alle Probanden zu trainieren.
    HINWEIS: Wir empfehlen dringend, das Erkennungssystem für jedes Tier neu zu kalibrieren, um sicherzustellen, dass die Software die gleichen Parameter bei behält, wenn sie Informationen für die Gefriererkennung verarbeitet.
  7. Ruhezeit: Während dieser Zeit lassen Sie die Tiere einzeln in ihren heimischen Käfigen ruhen. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere zweimal pro Woche während der 6 Wochen der Inkubationszeit. Manipulieren Sie jedes Tier vorsichtig für zwei min, während sie gewichtet werden.

5. Kontexttest – Einzelsitzung 10 min

  1. Setzen Sie die Tiere nach der Trainingsphase dem ersten Speichertest namens Kontexttestaus. Setzen Sie die Ratten in dieser 10-min-Phase dem gleichen Kontext aus, in dem das Training stattgefunden hat, aber keine Hinweise oder Schocks aufweisen. Transportieren Sie die Ratten in ihren überdachten Hauskäfigen (z.B. mit einem Tuch) von der Tierpflegeeinrichtung in den Verhaltensübungsraum. Denken Sie daran, dass die Tiere in Gruppen eingeteilt wurden, so dass eine Gruppe 48 h nach der Trainingsphase und die andere Gruppe 6 Wochen nach dem Training getestet wird (siehe Abbildung 1).

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Abbildung 1: Zeitleiste des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  2. Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1 bis 3.5). Öffnen Sie das Dialogfenster "Experiment-Setup", und laden Sie die Datei mit dem Namen "Context test protocol.pro", die ab http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQverfügbar ist.
    HINWEIS: Diese Datei enthält das Setup für diese experimentelle Phase, die aus keinen Stößen oder Tönen besteht.
  3. Führen Sie das Tier in die Versuchskammer ein. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  4. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Während dieser einzigen 10 min Kontext-Test-Sitzung werden keine Reize dargestellt (Schock weder Ton).
  5. Entfernen Sie das Motiv aus der Versuchskammer, wenn die 10-min-Sitzung beendet ist. Bringen Sie die Tiere in ihre jeweiligen Käfige zurück und transportieren Sie die Ratten in ihren überdachten Heimkäfigen vom Verhaltensübungsraum zur Tierpflegeeinrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.5, um alle Probanden zu testen.

6. Cue-Test – Einzel13 min Sitzung

  1. Einen Tag nach dem Kontexttest, lassen Tiere den zweiten Speichertest namens Cue-Testunterziehen. Während dieser Phase werden die Ratten in einem anderen Kontext der Ausbildung während 13 Min.; (Töne) werden präsentiert, aber es werden keine Stöße geliefert. Transportieren Sie die Ratten in ihren mit einer Abdeckung bedeckten Käfigen von der Tierpflegeeinrichtung in den Verhaltenstrainingsraum. Testen Sie eine Gruppe 72 h nach dem Angstkonditionstraining, und testen Sie eine weitere Gruppe 6 Wochen und einen Tag nach dem Training (Abbildung 1).
    HINWEIS: Ein anderes Transportsystem (von der Tierpflegeeinrichtung zum Versuchsraum) könnte implementiert werden, um den Kontext und die Cue-Tests stärker zu differenzieren. Da die Tiere zur Trainingseinheit und Kontextprobe in ihren Heimischenkäfigen transportiert wurden, konnte während des Transports zur Cue-Test-Sitzung ein anderer Transportkäfig, Einstreu und/oder Abdeckung verwendet werden.
  2. Reinigen Sie alle Innenflächen der Versuchskammer und des Edelstahlgitterbodens mit 10% Ethanol. Wiederholen Sie dies, bevor Sie jedes Tier testen.
  3. Um den visuellen Kontext zu ändern, legen Sie die Kunststoff-Umhängewand in die Versuchskammer ein.
  4. Um den olfaktorischen Kontext zu ändern, wenden Sie 1% Essigsäure auf einen Wattestäbchen auf, und legen Sie ihn in die Metallschale unter dem Gitterboden17,18,19.
  5. Wiederholen Sie die Kalibrierung des Gefriererkennungssystems (Schritte 3.1-3.5). Laden Sie die Datei mit dem Namen "Cue test protocol.pro" Datei, die ab http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQverfügbar ist.
    HINWEIS: Diese Datei enthält das Setup für diese experimentelle Phase, die aus der Lieferung der gleichen Töne während der Trainingsphase (CS) besteht, aber in Ermangelung von Schocks (US).
  6. Führen Sie das Tier in die Versuchskammer ein. Behandeln Sie es sanft an der Basis seines Schwanzes und legen Sie es auf der Mitte der Kammer. Schließen Sie die Versuchskammer und schalldämpfende Kastentüren.
  7. Starten Sie die Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken. Während der einzelnen 13-minuten-Cue-Testsitzung wird der CS-Stimulus (Ton) 10 Mal dargestellt, beginnend mit Minute 3 der Sitzung.
    HINWEIS: Die ersten 3 Min entsprechen dem Ausgangswert dieser Sitzung, gefolgt von 10 Cue-Teststudien (d. h. jeweils 10 s), die ohne Schocks mit 50 s ITIs geliefert werden. Die Lieferung von Tönen erfolgt automatisch über die zuvor geladene Datei.
  8. Entfernen Sie das Tier aus der Versuchskammer, wenn die 13-min-Sitzung beendet ist. Bringen Sie die Tiere in den jeweiligen Käfig zurück und transportieren Sie sie bedeckt zur Tierpflegeeinrichtung. Wiederholen Sie die Schritte 6.2 bis 6.5, um alle Probanden zu testen.

7. Datenanalyse

  1. Rufen Sie den allgemeinen Aktivitätsindex (d. h. den Bewegungsindex) ab, der aus dem Videostream mithilfe der Software für das Gefriererkennungssystem abgeleitet wird. Diese Software transformiert automatisch den Bewegungsindex, um den Prozentsatz der Gefrierzeit pro Sitzung und die Anzahl der gefrierenden Episoden bereitzustellen. Legen Sie den Gefrierschwellenwert auf die standardmäßige Einstellung Für mindeste Einfrierendauer des Systems fest (1 s = 30 Frames).
  2. Verwenden Sie das zusätzliche maßgeschneiderte Programm (Datei verfügbar von http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ), um zu erhalten:
    1. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens während der ersten drei Minuten der Trainingseinheit (d. h. das Einfrieren der Baseline, da vor oder während dieser 3-minuten-Periode keine Schocks oder Töne dargestellt wurden) und während der ersten drei Minuten der Cue-Testsitzung zu bestimmen.
    2. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens für jeden der acht 3 Min. der Trainingseinheit zu bestimmen.
    3. Verwenden Sie das Programm, um den Prozentsatz des Einfrierens während der Cue-Präsentationen (d. h. das Einfrieren während der Töne) und die No-Cue-Zeiträume (intertriale Intervalle; ITIs) sowohl für Schulungen als auch für Cue-Test-Sitzungen.
  3. Um diese Daten zu erhalten, öffnen Sie die Software für das Gefriererkennungssystem.
    1. Datei auswählen | Berichte | Batch-Komponenten-Zusammenfassung.
    2. Wählen Sie die Datei mit der Erweiterung . CMP verfügbar bei http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
    3. Benennen Sie die Ausgabedatei, und ändern Sie den Bewegungsschwellenwert in 100. Klicken Sie dann auf OK.
    4. Wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus (Erweiterung . RAW). Diese Dateien werden automatisch aus der Software des Gefriererkennungssystems generiert, wenn die Sitzung beendet ist, und entsprechen den Rohdaten jeder Sitzung. Zunächst werden die Dateien auf dem Desktop des Computers gespeichert, aber sie können in einem benutzerdefinierten Ordner (z.B. Documents-Fear Conditioning) gespeichert werden, um ihre nachfolgende Identifizierung und Öffnung zu erleichtern, wenn sie analysiert werden müssen.
    5. Öffnen Sie die Ausgabedateien (Erweiterung . CSV). Sie können in einer Tabellenkalkulationssoftware zur weiteren Analyse bearbeitet werden. Diese Datei enthält die Ergebnisse des Einfrierens während der experimentellen Sitzung.
      ANMERKUNG: Um den Gesamtprozentsatz des Einfrierens zu erhalten, teilen Sie die Zeit, die das Subjekt unbeweglich verbracht hat, auf die gesamte Sitzungszeit auf. Die Anzahl der gefrierenden Episoden kann berechnet werden, indem die Anzahl der Gefrierereignisse während der Sitzung gezählt wird. In beiden Fällen ist es notwendig, einen Bewegungsschwellenwert auf der Grundlage einer Mindesteinfrierungsdauer zu definieren. Dies ist das zeitliche Kriterium, das definiert, ob eine Freeze-Episode aufgezeichnet wird. Automatisierte Aufzeichnungssysteme können bestimmte Mengen an Frames pro Sekunde (fps) als Maß für die minimale Gefrierdauer verwenden. Bei einer Abtastrate von 30 fps wird beispielsweise eine Mindesteinfrierungsdauer von 15 Frames als Einfrieren einer Unbeweglichkeitsinstanz aufzeichnet, die für 30 s anhält.
  4. Berechnen Sie die durchschnittliche Dauer jeder Gefrierepisode für jede Sitzung (Training und beide Tests, Kontext und Cue), indem Sie die gesamte Gefrierdauer (in Sekunden) über die Gesamtzahl der Gefrierepisoden dividieren.

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Ergebnisse

Die prozentualen Schwankungen der Gefrierzeit in den verschiedenen Phasen der Trainingseinheit wurden für alle Probanden (n = 12) mit einem abhängigen t-Test analysiert (Tabelle 1). Die Tiere waren aktiv und erkundeten die Versuchskammer während der ersten drei Minuten der Trainingseinheit (erster Tag des Protokolls), während der keine Töne oder Schocks abgegeben wurden (d.h. Baseline-BL). Wie in Abbildung 2Adargestellt, Prozentsatz...

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Diskussion

Das derzeit erweiterte Angstkonditionierungsprotokoll ist ein effizienter und gültiger Ansatz zur Beurteilung des emotionalen Gedächtnisses über kurze (48 h) und langfristige Zeiträume (6 Wochen). So erlaubt das Protokoll, Übertraining und Angst inkubationsphänomene bei Ratten zu studieren. Zu den verschiedenen Vorteilen dieses Protokolls gehören die folgenden. Es bietet zwei Arten von Speichertests, nämlich Kontext und Cue, die es ermöglichen, die differenzielle Wirkung von zwei Verzögerungen (48 h und 6 Woche...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde von der Stiftung Universitaria Konrad Lorenz - Fördernummer 9IN15151 - bereitgestellt. Die Autoren danken der Kommunikationsabteilung der Konrad Lorenz Universität für ihre Hilfe bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos, insbesondere Natalia Rivera und Andrés Serrano (Produzenten). Auch Nicole Pfaller-Sadovsky und Lucia Medina für ihre Kommentare zum Manuskript und Johanna Barrero, Dekanin der Corporacion Universitaria Iberoamericana, für institutionelle Zusammenarbeit. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid (ethanoic acid)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid
Aversive Stimulation Current PackageMED Associates IncENV-420https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Contextual test protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Cue test protocol.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Curved Wall InsertMED Associates IncVFC-008-CWIhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Data processing.ziphttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
NIR/White Light Control BoxMED Associates IncNIR-100
Quick Change Floor/Pan Unit for MouseMED Associates IncENV-005FPU-Mhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Small Tabletop Cabinet and Power SupplyMED Associates IncSG-6080Dhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz)MED Associates IncENV-414Shttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Standard Fear Conditioning ChamberMED Associates IncVFC-008https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/
Training protocol VFC.prohttp://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ
Video Fear Conditioning Package for RatMED Associates IncMED-VFC-SCT-Rhttps://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/

Referenzen

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