Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Resumen

El estrés oxidativo es un evento importante en condiciones fisiológicas y patológicas. En este estudio, demostramos cómo cuantificar el estrés oxidativo midiendo las especies de oxígeno reactivo total (ROS) utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción en líneas celulares de cáncer colorrectal como ejemplo. Este protocolo describe los pasos detallados, incluida la preparación de la solución DCFH-DA, la incubación de células con solución DCFH-DA y la medición de la intensidad normalizada. La tinción DCFH-DA es una forma sencilla y rentable de detectar ROS en las células. Se puede utilizar para medir la generación de ROS después de un tratamiento químico o modificaciones genéticas. Por lo tanto, es útil para determinar el estrés oxidativo celular sobre el estrés ambiental, proporcionando pistas para estudios mecanicistas.

Introducción

Tres especies principales de oxígeno reactivo (ROS) producidas por el metabolismo celular que son de significado fisiológico son anión superóxido, radical hidroxilo, y peróxido de hidrógeno¹. A bajas concentraciones, participan en procesos celulares fisiológicos, pero a altas concentraciones tienen efectos adversos en las vías de señalización celular¹. Nuestro cuerpo ha desarrollado sistemas antioxidantes, que son eficaces contra el exceso de ROS. Sin embargo, el estrés oxidativo puede ocurrir cuando ROS abruma la capacidad desintoxicante de nuestro cuerpo, lo que contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo inflamación, cáncer, y enfermedad neurodegenerativa^2,,3,4. El propósito de este método es determinar el total de ROS celular en las células adherentes utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción. La razón es que la oxidación de DCFH-DA a 2'-7'diclorofluoresceína (DCF) se ha utilizado ampliamente para la detección total de ROS, incluidos los radicales hidroxilo (•OH) y el dióxido de nitrógeno (•NO₂). Mecánicamente, DCFH-DA es tomado por células donde la esterasa celular se corta fuera de los grupos de acetil, lo que resulta en DCFH. La oxidación de DCFH por ROS convierte la molécula a DCF, que emite fluorescencia verde a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. En comparación con la detección de fluorescencia con citometría de flujo y otros métodos alternativos^5,las ventajas de este método utilizando un microscopio de fluorescencia y un lector de placas son que produce imágenes fluorescentes claramente visibles, y es fácil de realizar, eficiente y rentable. Este método ha sido ampliamente utilizado para detectar ROS celular para el estudio de diversas condiciones^6,7,8. Este protocolo se utiliza para detectar ROS total en células adherentes. El uso de este método para detectar ROS en las células de suspensión puede necesitar algunas modificaciones.

Protocolo

1. Siembra celular

1. Semilla 2 x 10⁵ células de cáncer colorrectal HCT116 por pozo en una placa de 24 pozos y mantener las células en el medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco durante la noche a 37 oC.
2. Sustituya el medio de cultivo por o sin sulfato ferroso de 100 m (FS) o doxorubicina (DOX) de 10 oM que contenga medio e incubar durante 24 h.

2. Preparación de la solución DCFH-DA

1. Disolver 4,85 mg de DCFH-DA en 1 ml de dimetilsólfóxido (DMSO) para realizar una solución de 10 mM en stock.
2. Diluir la solución de stock con DMEM precalegado en una solución de trabajo de 10 m justo antes de añadirla a los pozos.
3. Vortex la solución de trabajo para 10 s.

3. Tinción DCFH-DA

1. Retire el medicamento que contiene el medio y lávelo una vez con DMEM.
2. Añadir 500 l de la solución de trabajo DCFH-DA en cada pocóptica e incubar a 37 oC durante 30 min.
3. Quite la solución de trabajo DCFH-DA. Lavar una vez con DMEM y 2x con 1 solución salina tamponada por fosfato (PBS).
4. Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocól.

4. Adquisición de imágenes y medición de intensidad

1. Tome imágenes fluorescentes representativas para cada pozo utilizando el canal de proteína fluorescente verde (GFP) en un microscopio de fluorescencia.
2. Después de tomar imágenes, retire pbS y agregue 200 ml de búfer de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) a cada pocól.
3. Incubar sobre hielo durante 5 min, luego recoger el lysate celular en tubos de 1,5 ml.
4. Centrifugar a 21.130 x g durante 10 min a 4oC.
5. Transfiera 100 l del sobrenadante a una placa negra de 96 pozos y mida la intensidad de la fluorescencia utilizando una fluorescencia de un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
6. Transfiera 1 l del sobrenadante a una placa transparente de 96 pocillos que contenga 100 l de solución de ensayo de proteína 1x para medir la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford⁹.
7. Normalizar las intensidades de fluorescencia con concentraciones de proteínas.

Resultados

Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 m FS o 10 m DOX para inducir estrés oxidativo⁷. Como se muestra en la Figura 1,la fluorescencia verde se incrementó drásticamente tanto por FS como en DOX como se esperaba. Para cuantificar el cambio de intensidad relativa, las células fueronizadas después de tomar imágenes y normalizadas con concentraciones de proteínas. La intensidad de fluorescencia cuantificada se incrementó significativa...

Discusión

El protocolo experimental descrito aquí es fácilmente reproducible para medir el total celular ROS. Los pasos críticos incluyen hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, minimizar las perturbaciones del estado de las células y el lavado extenso de PBS justo antes de tomar imágenes. Para la preparación de la solución de trabajo DCFH-DA, la solución de stock debe añadirse a DMEM precalentado justo antes de añadir en la placa de 24 pozos. La razón es que las soluciones antiguas q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader