Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Resumo

O estresse oxidativo é um evento importante em condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, demonstramos como quantificar o estresse oxidativo medindo a coloração total de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando 2',7'-diclorodihiorescetina diacetato (DCFH-DA) manchando em linhas de células cancerígenas colorretais como exemplo. Este protocolo descreve etapas detalhadas, incluindo a preparação da solução DCFH-DA, a incubação de células com solução DCFH-DA e a medição da intensidade normalizada. A coloração DCFH-DA é uma maneira simples e econômica de detectar ROS nas células. Pode ser usado para medir a geração de ROS após tratamento químico ou modificações genéticas. Portanto, é útil para determinar o estresse oxidativo celular sobre o estresse ambiental, fornecendo pistas para estudos mecanicistas.

Introdução

Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio¹. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular¹. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa^2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2'-7'dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO₂). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos⁵, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições^6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.

Protocolo

1. Semeadura celular

1. Semente 2 x 10⁵ HCT116 células cancerígenas colorretal por poço em uma placa de 24 poços e manter as células no meio águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco durante a noite a 37 °C.
2. Substitua o meio de cultura por ou sem sulfato ferroso de 100 μM (FS) ou 10 μM doxorubicina (DOX) contendo médio e incubado por 24 h.

2. Preparação da solução DCFH-DA

1. Dissolva 4,85 mg de DCFH-DA em 1 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) para fazer uma solução de estoque de 10 mM.
2. Diluir a solução de estoque com DMEM pré-aquecido em uma solução de trabalho de 10 μM logo antes de adicioná-la aos poços.
3. Vórtice a solução de trabalho para 10 s.

3. Coloração DCFH-DA

1. Remova a droga que contém meio e lave uma vez com DMEM.
2. Adicione 500 μL da solução de trabalho DCFH-DA em cada poço e incubar a 37 °C por 30 min.
3. Remova a solução de trabalho DCFH-DA. Lave uma vez com DMEM e 2x com soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS).
4. Adicione 500 μL de 1x PBS a cada poço.

4. Aquisição de imagens e medição de intensidade

1. Pegue imagens fluorescentes representativas para cada poço usando o canal de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio de fluorescência.
2. Depois de tirar imagens, remova o PBS e adicione 200 μL de buffer de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a cada poço.
3. Incubar no gelo por 5 minutos, depois coletar lysate celular em tubos de 1,5 mL.
4. Centrifugar a 21.130 x g por 10 min a 4 °C.
5. Transfira 100 μL do supernante para uma placa de poço 96 preta e meça a intensidade da fluorescência usando uma fluorescência de um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
6. Transfira 1 μL do supernante para uma placa clara de 96 poços contendo 100 μL de solução de ensaio de proteína 1x para medir a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford⁹.
7. Normalizar intensidades de fluorescência com concentrações proteicas.

Resultados

As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 μM FS ou 10 μM DOX para induzir o estresse oxidativo⁷. Como mostrado na Figura 1,a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada tanto por FS quanto pelo DOX, como esperado. Para quantificar a mudança de intensidade relativa, as células foram lístidas após a realização de imagens e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade de fluorescência quantificada foi significativamen...

Discussão

O protocolo experimental descrito aqui é facilmente reproduzível para medir ros total celular. As etapas críticas incluem tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, minimizar a perturbação do estado celular e a extensa lavagem de PBS logo antes de tirar imagens. Para a preparação da solução de trabalho DCFH-DA, a solução de estoque deve ser adicionada em DMEM pré-aquecido logo antes de adicionar na placa de poço 24. A razão é que soluções antigas que geram fluorescência de fundo el...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader