Обнаружение всего реактивного кислорода видов в клеток-приверженцев 2',7'-Dichlorodihydroflucescein Диацетат окрашивания

Резюме

Здесь мы представляем протокол для обнаружения общего клеточного реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein диацетат (DCFH-DA). Этот метод может визуализировать клеточной локализации ROS в адептовых клеток с флуоресценции микроскопа и количественно ROS интенсивности с флуоресценции пластины читателя. Этот протокол прост, эффективен и рентабельн.

Аннотация

Оксидационный стресс является важным событием как в физиологических, так и в патологических условиях. В этом исследовании мы демонстрируем, как количественно окислительного стресса путем измерения общего реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания в колоректальных раковых клеток линий в качестве примера. Этот протокол описывает подробные шаги, включая подготовку решения DCFH-DA, инкубацию клеток с раствором DCFH-DA и измерение нормализоваем интенсивности. Окрашивание DCFH-DA является простым и экономичный способ обнаружения ROS в клетках. Он может быть использован для измерения поколения ROS после химической обработки или генетических модификаций. Таким образом, это полезно для определения клеточного окислительного стресса на окружающую среду стресс, предоставляя ключи к механистических исследований.

Введение

Три основных реактивных видов кислорода (ROS), вырабатываемых клеточным метаболизмом, которые имеют физиологическое значение, являются супероксидной анионом, гидроксилом радикалом и перекисью^{водорода 1.} При низких концентрациях они участвуют в физиологических клеточных процессах, но при высоких концентрациях они оказывают неблагоприятное воздействие на клеточные сигнальные пути^1. В нашем организме разработаны антиоксидантные системы, которые эффективны против чрезмерного РОС. Тем не менее, окислительный стресс может произойти, когда ROS переполняет детоксикационную способность нашего организма, что способствует многим патологическим состояниям, включая воспаление, рак и нейродегенеративные заболевания^2,,3,,4. Цель этого метода заключается в определении общего клеточного РОС в адептовых клетках с помощью 2'-7'-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания. Обоснование заключается в том, что окисление DCFH-DA до 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) широко используется для общего обнаружения ROS, включая гидроксил-радикалы (ОГ) и диоксид азота (NO₂). Механически, DCFH-DA занимает клетки, где клеточные эстеразы расщепляется от ацетиловых групп, в результате чего DCFH. Окисление DCFH ROS преобразует молекулу в DCF, который испускает зеленую флуоресценцию на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм. По сравнению с обнаружением флуоресценции с цитометрией потока и другими альтернативными методами^5,преимущества этого метода с использованием флуоресценции микроскопа и плиты читателя в том, что он производит четко видимые флуоресцентные изображения, и легко выполнять, эффективным и экономически эффективным. Этот метод широко используется для обнаружения клеточного ROS для изучения различных условий^6,,7,,8. Этот протокол используется для обнаружения общего ROS в клетках-адептах. Использование этого метода для обнаружения ROS в подвесных камерах может потребоваться некоторые изменения.

протокол

1. Посев клеток

1. Семя 2 х 10⁵ ХКТ116 колоректальных раковых клеток на хорошо в 24-хорошо пластины и поддерживать клетки в модифицированной среде Eagle Dulbecco (DMEM) на ночь на 37 градусов по Цельсию.
2. Замените культурную среду или без 100 сульфатов железа (FS) или 10 доксорубицина (DOX), содержащего средний и инкубировать в течение 24 ч.

2. Подготовка решения DCFH-DA

1. Растворите 4,85 мг DCFH-DA в 1 мл диметил сульфоксида (DMSO), чтобы сделать 10 мМ фондовый раствор.
2. Разбавить раствор запаса предварительно разогретым DMEM в 10 ММ рабочий раствор прямо перед добавлением его в скважины.
3. Vortex - рабочее решение для 10 с.

3. Окрашивание DCFH-DA

1. Удалите препарат, содержащий средний и мыть один раз с DMEM.
2. Добавьте 500 мл рабочего решения DCFH-DA в каждый колодец и инкубировать при 37 градусах в течение 30 мин.
3. Удалите рабочее решение DCFH-DA. Вымойте один раз с DMEM и 2x с 1x фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS).
4. Добавьте 500 хл 1x PBS к каждому колодцу.

4. Измерение приобретения и интенсивности визуализации

1. Возьмите репрезентативные флуоресцентные изображения для каждого колодца с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) канала на флуоресценции микроскопа.
2. После съемки снимков удалите PBS и добавьте 200 МЛ буфера радиоиммунопреципионации (RIPA) к каждой скважине.
3. Инкубировать на льду в течение 5 мин, затем собирать лисировать клетки в 1,5 мл труб.
4. Центрифуга при 21 130 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
5. Перенесите 100 мл супернатанта на черную пластину 96 скважин и измерьте интенсивность флуоресценции с помощью флуоресценции микроплиты читателя на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм.
6. Передача 1 л супернатанта на четкую 96-ю хорошо пластину, содержащую 100 мл раствора протеина для измерения концентрации белка с помощью Брэдфордского анализа⁹.
7. Нормализация интенсивности флуоресценции с концентрацией белка.

Результаты

Клеток колоректального рака HCT116 лечили 100 м ФС или 10 МЛ DOX, чтобы вызвать окислительный стресс⁷. Как показано на рисунке 1,зеленая флуоресценция была резко увеличена как FS, так и DOX, как и ожидалось. Для количественной оценки изменения относительной интенсивно?...

Обсуждение

Экспериментальный протокол, описанный здесь, легко воспроизводится для измерения клеточного общего ROS. Критические шаги включают в себя создание решения DCFH-DA свежим и избегание воздействия света, минимизация нарушения состояния клеток и обширная стирка PBS перед съемкой изображений. Д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader