Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Abstract

Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2',7'-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l'incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell'intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.

Introduzione

Tre principali specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l'anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno¹. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare¹. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui infiammazione, cancro, e malattia neurodegenerativa^2,3^,4.⁴ Lo scopo di questo metodo è quello di determinare il ROS cellulare totale nelle cellule aderenti utilizzando la colorazione di diattato (DCFH-DA) di 2',7'-diclorodiidrofluorescein (DCFH-DA). La logica è che l'ossidazione del DCFH-DA al 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento totale₂del ROS, compresi i radicali idrossili (OH) e il biossido di azoto ( . Meccanicamente, DCFH-DA è occupato da cellule dove cellulare all'espegnimento dei fendi fuori i gruppi di acetil, con conseguente DCFH. L'ossidazione di DCFH da parte di ROS converte la molecola in DCF, che emette fluorescenza verde ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm. Rispetto al rilevamento della fluorescenza con citometria di flusso e altri metodi alternativi⁵, i vantaggi di questo metodo utilizzando un microscopio a fluorescenza e un lettore di lamiere sono che produce immagini fluorescenti chiaramente visibili, ed è facile da eseguire, efficiente e conveniente. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per rilevare ROS cellulare per studiare varie condizioni^6,7,8. Questo protocollo viene utilizzato per rilevare ros totale nelle cellule aderenti. L'utilizzo di questo metodo per rilevare ROS nelle celle delle sospensioni potrebbe richiedere alcune modifiche.

Protocollo

1. Semina delle cellule

1. Seme 2 x 10^{5 cellule} tumorali dell'HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi.
2. Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h.

2. Preparazione della soluzione DCFH-DA

1. Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) per creare una soluzione di riserva di 10 mM.
2. Diluire la soluzione di riserva con DMEM preriscaldato in una soluzione di lavoro da 10 M proprio prima di aggiungerla ai pozzi.
3. Vorticare la soluzione di lavoro per 10 s.

3. Colorazione DCFH-DA

1. Rimuovere il farmaco contenente il mezzo e lavare una volta con DMEM.
2. Aggiungere 500 gradi della soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
3. Rimuovere la soluzione di lavoro DCFH-DA. Lavare una volta con DMEM e 2x con 1x salina con buffer fosfato (PBS).
4. Aggiungere 500 l 1x PBS ad ogni pozzo.

4. Acquisizione dell'imaging e misurazione dell'intensità

1. Prendere immagini fluorescenti rappresentative per ogni pozzo utilizzando il canale di proteina fluorescente verde (GFP) su un microscopio a fluorescenza.
2. Dopo aver scattato le immagini, rimuovere PBS e aggiungere a ciascun pozzo il buffer RIPA (radioimmunoprecipitazionation assay) da 200 l.
3. Incubare sul ghiaccio per 5 min, quindi raccogliere illisato cellulare in tubi da 1,5 mL.
4. Centrifuga a 21.130 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
5. Trasferire 100 l del supernatante su una piastra nera di 96 pozze e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando una fluorescenza un lettore di microplacia ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
6. Trasferire 1 ll del supernatante su una piastra chiara 96 pozzo contenente 100 .L of 1x soluzione di prova proteica per misurare la concentrazione di proteine utilizzando il saggio Bradford⁹.
7. Normalizzare le intensità di fluorescenza con concentrazioni proteiche.

Risultati

Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo⁷. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l'assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L'intensità quantificata della fluorescenza è stata significa...

Discussione

Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l'esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l'ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader