2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

要約

ここでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。

要約

酸化ストレスは、生理学的および病理学的条件下で重要な事象である。本研究では、2',7'ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全活性酸素種(ROS)を測定し、大腸癌細胞系で染色を行い、酸化ストレスを定量する方法を例に示す。このプロトコルはDCFH-DA溶液の調製、DCFH-DA溶液による細胞のインキュベーション、および正規化された強度の測定を含む詳細なステップを記述する。DCFH-DA染色は、細胞内のROSを検出するためのシンプルで費用対効果の高い方法です。これは、化学処理または遺伝子改変後のROS生成を測定するために使用することができる。そのため、環境ストレス時の細胞酸化ストレスを決定するのに有用であり、機械学的研究の手がかりを提供する。

概要

生理的意味を持つ細胞代謝によって産生される3つの主要な活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び過酸化水素¹である。低濃度では、それらは生理学的細胞プロセスに関与するが、高濃度では細胞シグナル伝達経路¹に悪影響を及ぼす。私たちの体は、過剰なROSに対して有効である抗酸化システムを開発しました。しかし、酸化ストレスは、炎症、癌、および神経変性疾患^,,2、3、4を含む多くの病的状態に寄与する、ROSが私たちの体の解毒能力を圧倒²するときに発生する可能性^{があります}。この方法の目的は、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)染色を使用して、接着細胞における総細胞ROSを決定することです。その根拠は、DCFH-DAから2'-7'ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化が、ヒドロキシルラジカル(•OH)および二酸化窒素(•NO₂₎を含む総ROS検出のために広く使用されてきたということです。機械学的に、DCFH-DAは、細胞エステラーゼがアセチル基を切断する細胞によって取り込まれるため、DCFHが得られます。ROSによるDCFHの酸化は、分子をDCFに変換し、励起波長485nmで緑色蛍光を放出し、発光波長は530nmです。フローサイトメトリーと他の代替方法⁵で蛍光の検出と比較すると、この方法の利点は、蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、それが明確に目に見える蛍光画像を生成し、かつ、効率的かつ費用対効果が高く、実行が容易である。この方法は、様々^,な条件^6、7、87を研究⁶するための細胞ROSを検出するために広く使用されている。⁸このプロトコルは、接着細胞の総ROSを検出するために使用されます。この方法を使用して懸濁液細胞のROSを検出するには、いくつかの変更が必要な場合があります。

プロトコル

1. 細胞の播種

1. 種子2 x 10⁵ HCT116大腸癌細胞は24ウェルプレートでウェルあたり、37°Cで一晩ダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)の細胞を維持します。
2. 培地を含む100μMの硫酸第一鉄(FS)または10μMドキソルビシン(DOX)を含む培地とインキュベートを24時間使用するか、または含まない培地を交換してください。

2. DCFH-DA溶液の調製

1. DCFH-DAの4.85mgをジメチルスルホキシド(DMSO)の1 mLに溶解し、10mMストック溶液を作ります。
2. あらかじめ温めたDMEMでストック溶液を10 μMの作業ソリューションに希釈してから、ウェルに追加します。
3. 10 sのための働く解決を渦。

3. DCFH-DA染色

1. 培地を含む薬物を取り除き、DMEMで一度洗います。
2. DCFH-DAの各井戸に500 μLのDCFH-DA作業溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。
3. DCFH-DA の動作ソリューションを削除します。DMEMで1回、1倍のリン酸緩衝生理食塩(PBS)で2倍洗います。
4. 各ウェルに500 μLの1x PBSを加えます。

4. 画像収集と強度測定

1. 蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質(GFP)チャネルを使用して、各ウェルの代表的な蛍光画像を撮影します。
2. 画像を撮った後、PBSを取り除き、各ウェルに200μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを加えます。
3. 氷上で5分間インキュベートし、1.5mLチューブに細胞ライセートを集める。
4. 遠心分離機 21,130 x gで 4 °C で 10 分間
5. 上清の100μLを黒い96ウェルプレートに移し、485nmの励起波長と530nmの発光波長でマイクロプレートリーダーの蛍光を使用して蛍光強度を測定します。
6. 1xタンパク質アッセイ溶液の100μLを含む透明な96ウェルプレートに上清の1μLを移し、ブラッドフォードアッセイ⁹を用いてタンパク質濃度を測定する。
7. タンパク質濃度で蛍光強度を正規化します。

結果

HCT116大腸癌細胞を100 μM FSまたは10 μM DOXで処理し、酸化ストレス⁷を誘導した。図1に示すように、期待通りFSとDOXの両方により緑色蛍光が劇的に増加した。相対的な強度変化を定量化するために、細胞を画像を撮った後にリセドし、タンパク質濃度で正規化した。定量された蛍光強度は、HCT116細胞におけるFSまたはDOXによって有意に増加した。

ディスカッション

ここで説明する実験プロトコルは、細胞総ROSを測定するために容易に再現可能である。重要なステップには、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を回避し、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行う必要があります。DCFH-DA作業ソリューションの調製のために、ストック溶液は24ウェルプレートに追加する前に、事前に温められたDMEMに追加する必要があります。その理由?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader