Asignación de circuito asistida por Channelrhodopsin de largo alcance de neuronas coliculus inferiores con Channelrhodopsins de cambio azul y rojo

Resumen

El mapeo de circuitos asistidos por Cifrodonina (CRACM) es una técnica de precisión para el mapeo funcional de proyecciones neuronales de largo alcance entre grupos de neuronas identificadas anatómicamente y/o genéticamente. Aquí, describimos cómo utilizar craCM para mapear las conexiones del tronco cerebral auditivo, incluyendo el uso de una opsin de cambio rojo, ChrimsonR.

Resumen

Al investigar los circuitos neuronales, una limitación estándar del enfoque de abrazadera de parche in vitro es que los axones de múltiples fuentes a menudo se mezclan, lo que dificulta aislar las entradas de fuentes individuales con estimulación eléctrica. Sin embargo, mediante el uso de la asignación de circuitos asistidos de channelrhodopsin (CRACM), esta limitación ahora se puede superar. Aquí, informamos de un método para utilizar el CRACM para mapear las entradas ascendentes de núcleos de tronco cerebral auditivo inferior y entradas commissurales a una clase identificada de neuronas en el colículo inferior (IC), el núcleo cerebral medio del sistema auditivo. En el IC, los axones locales, comisarios, ascendentes y descendentes están fuertemente entrelazados y, por lo tanto, son indistinguibles con la estimulación eléctrica. Mediante la inyección de una construcción viral para impulsar la expresión de una canalizarpsina en un núcleo presináptico, seguido de la grabación de abrazaderas de parche para caracterizar la presencia y fisiología de entradas sinápticas que expresan la canalizar, proyecciones de una fuente específica a una población específica de neuronas IC se puede mapear con precisión específica del tipo de célula. Mostramos que este enfoque funciona tanto con Chronos, un canal rhodopsin activado por luz azul, como con ChrimsonR, un canal de cambio rojo. A diferencia de los informes anteriores del anteceleo, encontramos que ChrimsonR se trafica sólidamente por los axones de las neuronas principales del núcleo coclear dorsal, lo que indica que ChrimsonR puede ser una herramienta útil para los experimentos CRACM en el tronco cerebral. El protocolo presentado aquí incluye descripciones detalladas de la cirugía de inyección de virus intracraneal, incluyendo coordenadas estereolíticas para apuntar las inyecciones al núcleo coclear dorsal y el IC de los ratones, y cómo combinar la grabación de la abrazadera de parche de células enteras con activación de la cdicrodona para investigar proyecciones de largo alcance a las neuronas IC. Aunque este protocolo está diseñado para caracterizar las entradas auditivas del IC, se puede adaptar fácilmente para investigar otras proyecciones de largo alcance en el tronco cerebral auditivo y más allá.

Introducción

Las conexiones sinápticas son críticas para la función del circuito neural, pero la topología precisa y la fisiología de las sinapsis dentro de los circuitos neuronales a menudo son difíciles de sondear experimentalmente. Esto se debe a que la estimulación eléctrica, la herramienta tradicional de la electrofisiología celular, activa indiscriminadamente los axones cerca del sitio de estimulación, y en la mayoría de las regiones cerebrales, los axones de diferentes fuentes (locales, ascendentes y/o descendentes) se entrelazan. Sin embargo, mediante el uso de channelrhodopsin asignación de circuito asistido (CRACM)^1,2, esta limitación ahora se puede superar³. Channelrhodopsin (ChR2) es un canal iónico activado por la luz, selectivo de cationes originalmente encontrado en la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 se puede activar por luz azul de una longitud de onda alrededor de 450-490 nm, despolarizando la célula a través de la afluencia catiónica. ChR2 fue descrito y expresado por primera vez en ovocitos de Xenopus por Nagel y sus colegas^4. Poco después, Boyden y sus colegas⁵ expresaron ChR2 en neuronas de mamíferos y demostraron que podían usar pulsos de luz para controlar de forma fiable el pico en una escala de tiempo de milisegundos, induciendo potenciales de acción de 10 ms después de la activación de ChR2 con luz azul. Recientemente se han encontrado canales optogenéticos con cinética aún más rápida (por ejemplo, Chronos⁶).

El enfoque básico de un experimento craCM es transfectar una población de neuronas hipotápticas putativas con un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que lleva la información genética para un canalrhodopsin. La transfección de las neuronas con rAAV conduce a la expresión de la canalrodonina codificada. Típicamente, la canalrhodopsina se etiqueta con una proteína fluorescente como GFP (Proteína Fluorescente Verde) o tdTomato (una proteína fluorescente roja), por lo que la transfección de las neuronas en la región objetivo se puede confirmar fácilmente con imágenes de fluorescencia. Debido a que los ARV no son patógenos, tienen un bajo potencial inflamatorio y expresión génica de larga duración^7,8, se han convertido en una técnica estándar para entregar clasrodoninas a las neuronas. Si, después de la transfección de una población presináptica putativa de neuronas, la activación de una cedrodrodina a través de destellos de luz provoca potenciales o corrientes postsinápticas en las neuronas objetivo, esto es evidencia de una conexión axonal desde el núcleo transfected a la célula registrada. Debido a que los axones cortados en experimentos de corte de cerebro pueden ser conducidos a liberar neurotransmisor a través de la activación de la cifrodonina, los núcleos que se encuentran fuera de la rebanada aguda pero envían axones a la región del cerebro postsináptico se pueden identificar con CRACM. El poder de esta técnica es que la conectividad y la fisiología de las entradas sinápticas de largo alcance identificadas se pueden investigar directamente.

Además de las cedrodoninas que son excitables por la luz azul, los investigadores han identificado recientemente varias channelrhodopsins de cambio rojo^9,10,incluyendo Chrimson y su ChrimsonR analógico más rápido, los cuales están excitados con luz roja de 660 nm⁶. Las opsins de cambio rojo son de interés porque la luz roja penetra mejor en el tejido que la luz azul, y la luz roja puede tener una citotoxicidad inferior a la luz azul^10,11,12. Las cardrepsinas de cambio rojo también abren la posibilidad de experimentos CRACM de doble color, donde la convergencia de axones de diferentes núcleos en la misma neurona se puede probar en un experimento^6,13,14. Sin embargo, las operaciones actuales de cambio rojo a menudo exhiben activación cruzada no deseada con luz azul^15,16,17, lo que dificulta dos experimentos de color. Además, algunos informes han indicado que ChrimsonR se somete a un tráfico axonal limitado, lo que puede dificultar el uso de ChrimsonR para experimentos CRACM^16,17.

Casi todas las proyecciones ascendentes de los núcleos del tronco cerebral auditivo inferior convergen en el colículo inferior (IC), el centro del cerebro medio de la vía auditiva central. Esto incluye proyecciones del núcleo coclear (CN)^18,19, la mayor parte del complejo olivar superior (SOC)^20,y los núcleos dorsal (DNLL) y ventral (VNLL) del lemnisco lateral^21. Además, una gran proyección descendente de la corteza auditiva termina en el IC^{18,19,20,21,22,}y las neuronas IC sí mismas sinapsis ampliamente dentro de los lóbulos locales y contralaterales del IC²³. La mezcla de axónes de muchas fuentes ha hecho difícil sondear circuitos IC utilizando la estimulación eléctrica^24. Como resultado, a pesar de que las neuronas en el IC realizan cálculos importantes para la localización del sonido y la identificación del habla y otros sonidos de comunicación^25,26, la organización de los circuitos neuronales en el IC es en gran medida desconocida. Recientemente identificamos las neuronas VIP como la primera clase de neuronas identificables molecularmente en el IC^27. Las neuronas VIP son neuronas estelares glutamatérgicas que se proyectan a varios objetivos de largo alcance, incluyendo el tálamo auditivo y el colículo superior. Ahora somos capaces de determinar las fuentes y la función de las entradas locales y de largo alcance a las neuronas VIP y determinar cómo estas conexiones de circuito contribuyen al procesamiento de sonido.

El protocolo presentado aquí está diseñado para investigar las entradas sinápticas a las neuronas VIP en el IC de los ratones, específicamente desde el IC contralateral y el DCN(Figura 1). El protocolo se puede adaptar fácilmente a diferentes fuentes de entrada, un tipo de neurona diferente o una región cerebral diferente en conjunto. También mostramos que ChrimsonR es un canal de cambio rojo eficaz para el mapeo de circuitos de largo alcance en el tronco encefálico auditivo. Sin embargo, demostramos que ChrimsonR está fuertemente activado por la luz azul, incluso a bajas intensidades, y por lo tanto, para combinar ChrimsonR con Chronos en experimentos CRACM de dos colores, se deben utilizar controles cuidadosos para evitar la activación cruzada de ChrimsonR.

Protocolo

Obtener la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y adherirse a las directrices de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por la Universidad de Michigan IACUC y estaban de acuerdo con las directrices de NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparaciones de cirugía

1. Realizar cirugías en condiciones asépticas. Autoclave/esterilizar todas las herramientas y materiales de cirugía antes de la cirugía. Use bata de cirugía y máscara para la cirugía.
2. Desinfecte el área de la cirugía (rocíe y limpie con 70% de etanol) y coloque cortinas de toalla estériles para cubrir el área de la cirugía.
3. Preparen la jaula de recuperación. Retire la ropa de cama de la jaula para limitar el riesgo de asfixia. Pon una almohadilla de calentamiento debajo de la jaula. Proporcione una fuente de alimentos y agua.
4. Tire de un capilar de vidrio para el nanoinyector en un tirador de pipeta. El intenso calor del filamento calefactor durante el proceso de extracción esterilizará el capilar de vidrio. Cortar o romper la punta para obtener una abertura de aproximadamente 5 m de diámetro.
5. Bisele la punta capilar a un ángulo de aproximadamente 30o para mejorar la penetración del tejido y reducir la obstrucción. Rellene el capilar con aceite mineral e insértelo en un inyector de nanolitros.
6. Obtener una alícuota del rAAV de codificación channelrhodopsin deseado y diluir al titer deseado utilizando PBS estéril.
   NOTA: Hemos encontrado que el serotipo 1 de los rAAV funcionan bien para la transfección de núcleos auditivos del tronco encefálico. Específicamente, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (canalrhodopsin activado por luz azul) y rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (canalrhodopsin de desplazamiento rojo), que están disponibles en repositorios y núcleos vectoriales accesibles públicamente, producir constantemente los altos niveles de expresión y el buen tráfico axonal de largo alcance de las cedrodoninas necesarias para los experimentos craCM.
7. Siga las instrucciones del inyector para rellenar el capilar frontal con 1-3 l de rAAV en PBS estéril.

2. Cirugía

1. Poner al animal en una cámara de inducción e inducir anestesia con 3% de isoflurano en oxígeno entregado a través de un vaporizador de isoflurano calibrado. Observe el ratón hasta que la respiración se vuelva profunda y lenta y un reflejo de pellizcar del dedo del pie esté ausente, alrededor de 3-5 min.
2. Transfiera el animal a un marco estereotaxico. Asegure la cabeza del animal poniendo su boca en una barra del paladar con una máscara de anestesia de gas y colocando las barras del oído no perforantes en ambos canales auditivos.
3. Inserte una sonda de temperatura rectal y encienda el controlador de temperatura homeostático.
4. Aplicar pomada oftálmica para evitar que los ojos se sequen.
5. Administrar analgésico preventivo (p. ej., inyección subcutánea de 5 mg/kg de carprofeno).
6. Ajuste el isoflurano a 1-2.5%, de acuerdo con la profundidad del estado anestesiado. Controlar la temperatura, la respiración y el color de las membranas mucosas al menos cada 15 minutos durante el procedimiento.
7. Afeitado el cuero cabelludo con cortadoras eléctricas. Preparar asépticamente el cuero cabelludo con tres hisopos alternados de povidona-yodo y 70% de etanol.
8. Hacer una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media comenzando entre las orejas y continuaros a los ojos, exponiendo las suturas lambda y bregma. Empuje la piel hacia un lado y retire el periosteo del hueso expuesto si es necesario.
9. Marque la sutura lambda con un marcador quirúrgico estéril, coloque la punta del nanoinyector de modo que esté tocando lambda, y cero las coordenadas del micromanipulador. Utilice la punta del nanoinyector y el micromanipulador para medir la diferencia de elevación entre las suturas lambda y bregma. Ajuste la altura de la barra del paladar para llevar la lambda y el bregma a una diferencia de altura de 100 m.
10. Mapee el lugar de inyección utilizando la punta del nanoinyector y el sistema de coordenadas del micromanipulador y marque el sitio con un marcador quirúrgico estéril. Para inyectar el IC o DCN de ratones P21-P30, utilice las coordenadas relativas a la sutura lambda, como se muestra en la Tabla 1. Tenga en cuenta que la profundidad Z en nuestras coordenadas se mide desde la superficie del cráneo en lambda.
11. Utilice un taladro micromotor con una rebaba de perforación estéril de 0,5 mm para realizar una craneotomía sobre el lugar de inyección.
12. Para asegurar una amplia transfección de las neuronas en el núcleo objetivo, realice inyecciones a varias profundidades en el tejido(Tabla 1, Coordenadas Z) y, en el caso de regiones cerebrales más grandes como el IC, realice inyecciones en el transcurso de dos o más penetraciones en diferentes coordenadas X e Y(Tabla 1, Penetración IC derecha 1 y Penetración IC derecha 2).
13. Realizar inyecciones. Para las inyecciones de IC, deposite 20 nL de virus en intervalos de 250 m a lo largo del eje Z (profundidad de inyección) entre 2.250 y 1750 m de profundidad. Para las inyecciones de DCN, deposite 20 nL de virus a una profundidad de 4.750 m y 4.550 m, respectivamente.
14. Después de la inyección en cada coordenada Z, espere 2-3 minutos antes de mover el inyector a la siguiente coordenada Z. Esto permitirá que el virus se difunda lejos del lugar de inyección, reduciendo la probabilidad de que el virus se succione por el tracto de inyección cuando se reposiciona el nanoinyector.
15. Después de la última inyección en una penetración, esperar 3-5 minutos antes de retraer nanoinyector del cerebro.
16. Cuando el nanoinyector se extrae del cerebro entre penetraciones y entre animales, expulse un pequeño volumen de virus de la punta para comprobar que la punta no se ha obstruido.
17. Después de las inyecciones, utilice PBS estéril para mojar los bordes cortados del cuero cabelludo y luego mover suavemente la piel hacia la línea media. Cierre la herida con simples suturas interrumpidas usando suturas de nylon 6-0 (0.7 métricas).
18. Aplicar 0,5-1 ml de 2% gel de lidocaína a la herida.
19. Retire las barras de los oídos y la sonda de temperatura, apague el isoflurano, retire el ratón de la barra del paladar y transfiéralo a la jaula de recuperación.
20. Supervise de cerca la recuperación. Una vez que el animal esté completamente despierto, moviéndose y sin signos de dolor o angustia, transfiéralo de nuevo a su jaula y devuelva la jaula al vivario.
21. Si las cirugías se realizarán en varios animales en un día, utilice un esterilizador de cuentas calientes para desinfectar las herramientas de cirugía y perforar rebabas antes de la próxima cirugía.

3. Seguimiento quirúrgico

1. Revise diariamente a los animales en busca de cierre de heridas, infección o signos de dolor o angustia durante los próximos 10 días, adhirándose a las pautas de cuidado animal de la institución.
2. Espere 3-4 semanas antes de usar animales en experimentos para permitir la expresión óptima de las clasrodoninas.

4. Preparación de la rebanada cerebral y confirmación del objetivo de inyección

1. Para el CRACM, utilice rebanadas cerebrales agudamente preparadas de animales transpetes en experimentos de electrofisiología in vitro estándar, descritos aquí sólo brevemente (consulte Goyer et al. 2019 para una descripción más detallada²⁷).
2. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga (en mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucosa, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1,5 CaCl₂, 1 MgSO₄. Burbuja ACSF a un pH de 7,4 con 5% CO₂ en 95% O₂.
3. Realice todos los siguientes pasos, incluida la electrofisiología in vitro, en luz casi oscura o roja para limitar la activación de las cedrodoninas.
4. Anestetiza profundamente el ratón con isoflurano y decapita rápidamente. Diseccionar el cerebro rápidamente en 34 oC ACSF.
5. Cortar las rodajas coronales (200-250 m) que contienen el IC en ACSF de 34 oC con un microtome vibratorio e incubar las rodajas a 34 oC durante 30 minutos en una cámara de retención llena de ACSF burbujeado con 5% de CO₂ en 95% O₂. Después de la incubación, guarde las rodajas a temperatura ambiente hasta que las use para grabaciones.
6. Si el objetivo de inyección no era el IC, corte rebanadas coronales adicionales de la región cerebral inyectada y compruebe la transfección del núcleo objetivo bajo un microscopio de fluorescencia. Si no hay transfección en el núcleo objetivo o transfección adicional en diferentes regiones cerebrales, no continúe con el experimento.

5. In Vitro Recording y CRACM Experiment

NOTA: Para proporcionar estimulación óptica de Chronos y ChrimsonR, utilizamos LEDs acoplados al puerto de epifluorescencia del microscopio. Sin embargo, los láseres se pueden utilizar en lugar de LEDs. Si utiliza láseres, obtenga la aprobación previa de los funcionarios de seguridad institucionales y siga las pautas apropiadas para un uso seguro del láser.

1. Tire de los electrodos del vidrio de borosilicato a una resistencia de 3,5-4,5 M. La solución interna del electrodo debe contener (en mM): 115 K-gluconato, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ fosfocreatina, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, complementado con 0.1% biocitina (p/v), pH ajustado a 7.3 con KOH y osmolalidad a 290 mOsm/kg con sacarosa.
2. Para realizar grabaciones, utilice métodos de abrazadera de parche estándar. Coloque la rebanada en una cámara de grabación bajo un microscopio vertical de etapa fija y percértela continuamente con ACSF a 2 ml/min. Realice grabaciones cerca de la temperatura fisiológica (34-36 oC).
3. Parche las neuronas bajo control visual utilizando un amplificador de abrazadera de parche adecuado. Correcto para resistencia en serie, capacitancia de pipetas y potencial de unión líquida.
4. Durante las grabaciones de células enteras, active Chronos entregando pulsos breves (1-5 ms) de luz de 470 nm o ChrimsonR mediante pulsos breves de luz de 580 nm a través de LED disponibles en el uso comercial. Determinar el umbral de activación de opsin y utilizar un protocolo de estimulación mínimo para provocar potenciales postsinápticos. En general, utilice la duración de estímulo más corta que provoca un PSP y establezca la potencia óptica en el 120% de la potencia de umbral necesaria para provocar PSPs.
5. Para confirmar que los cambios registrados en el potencial de la membrana son de hecho entradas sinápticas a la neurona, los antagonistas estándar para los receptores postsinápticos excitatorios/inhibidores pueden ser lavados durante el experimento. Para investigar diferentes contribuciones de receptores a un PSP (por ejemplo, receptores NMDA vs AMPA), se pueden lavar los antagonistas de receptores adecuados. Para cada antagonista del receptor, los efectos del fármaco deben revertirse después del lavado.
6. Utilice la latencia, el nerviosismo y la fiabilidad de los PSP para confirmar que las entradas sinápticas activadas por la luz se originan a partir de la activación directa y óptica de las sinapsis en la neurona registrada, en lugar de la activación de las sinapsis de expresión de la cedrepsina en una intervención neurona que sinapsis en la neurona registrada. En general, baja latencia (<2 ms), baja fluctuación (<1 ms de desviación estándar en la latencia) y alta confiabilidad (>50%) indicar una conexión sináptica directa desde la canalrhodopsin a la neurona presináptica a la neurona registrada.

Resultados

Cruzamos ratones VIP-IRES-Cre (Vip^tm1(cre)Zjh/J) y Ai14 Cre-reporter ratones (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J) para generar descendencia F1 en la que las neuronas VIP expresan la proteína fluorescente tdTomato. Se utilizaron descendencia F1 de ambos sexos, envejecida del día postnatal (P) 21 a P70. Un total de 22 animales fueron utilizados en este estudio.

Inyección estereot...

Discusión

Hemos encontrado que craCM es una técnica poderosa para identificar y caracterizar entradas sinápticas de largo alcance a las neuronas en el IC del ratón. Siguiendo el protocolo detallado aquí, logramos una transfección robusta de las neuronas en el DCN y el IC, así como el tráfico axonal confiable de Chronos y ChrimsonR a terminales sinápticos en el IC. Además, demostramos que esta técnica permite la medición y el análisis de eventos postsinápticos, incluyendo amplitud de PSP, medio ancho, tiempo de decaimi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH	Addgene	59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Addgene	59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson Laboratory	stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-B4
Carproject (carprofen)	Henry Schein Animal Health	59149
Drummond glas capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3	Drummond Scientific Company	3-300-207
Electrode beveler	Sutter Instrument	FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures	Ethicon	local pharmacy
Fixed stage microscope	any	n/a
Gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments	933-B
General surgery tools	Fine Science Tools	N/A
Golden A5 pet clipper	Oster	078005-010-003
Heating pad	Custom build	N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system	Patterson Scientific	78917760
Hot bead sterilizer Steri 250	Inotech	IS-250
Iodine solution 10%	MedChoice	local pharmacy
Isoflurane vaporizer	Patterson Scientific	07-8703592
Lidocain topical jelly 2%	Akorn	local pharmacy
Micro motor drill 1050	Henry Schein Animal Health	7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm	Fine Science Tools	19007-05
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears	Akorn	local pharmacy
P-1000 electrode puller	Sutter Instrument	P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software	any	n/a
Portable anethesia machine	Patterson Scientific	07-8914724
Small animal steroetaxic frame	David Kopf Instruments	930-B
Standard chemicals	local vendors	N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical marker	Fine Science Tools	18000-30
Temperature controller	Custom build	N/A
Vibratome	any	n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)	Jackson Laboratory	stock #010908
Water bath	any	n/a