Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha

Resumo

O mapeamento de circuitoassistido pela canaldopsina (CRACM) é uma técnica de precisão para o mapeamento funcional de projeções neuronais de longo alcance entre grupos anatomicamente e/ou geneticamente identificados de neurônios. Aqui, descrevemos como utilizar o CRACM para mapear conexões cérebros auditivas, incluindo o uso de uma opsina de mudança vermelha, ChrimsonR.

Resumo

Ao investigar circuitos neurais, uma limitação padrão da abordagem do grampo de patch in vitro é que axônons de múltiplas fontes são frequentemente intermisturadas, dificultando a isoposição de entradas de fontes individuais com estimulação elétrica. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM), essa limitação agora pode ser superada. Aqui, relatamos um método para usar o CRACM para mapear entradas ascendentes de núcleos cerebrais auditivos inferiores e entradas commissivas para uma classe identificada de neurônios no colliculus inferior (IC), o núcleo do cérebro médio do sistema auditivo. No IC, axônons locais, comissários, ascendentes e descendentes estão fortemente entrelaçados e, portanto, indistinguíveis com estimulação elétrica. Injetando uma construção viral para conduzir a expressão de uma canaldopsina em um núcleo presinaptico, seguido de gravação de grampo de patch para caracterizar a presença e a fisiologia de entradas sinápticas expressando canaldopsina, projeções de uma fonte específica para uma população específica de neurônios IC pode ser mapeado com precisão específica do tipo celular. Mostramos que essa abordagem funciona com chronos, uma canaldopsina azul ativada pela luz, e ChrimsonR, uma canaldopsina de mudança vermelha. Em contraste com relatórios anteriores do cérebro anterior, descobrimos que ChrimsonR é robustamente traficado para baixo os axôngos de neurônios principais do núcleo coclear dorsal, indicando que chrimsonR pode ser uma ferramenta útil para experimentos CRACM no tronco cerebral. O protocolo aqui apresentado inclui descrições detalhadas da cirurgia intracraniana de injeção de vírus, incluindo coordenadas estereotaxicas para injeções direcionadas ao núcleo coclear dorsal e IC de camundongos, e como combinar gravação completa do grampo de patch celular com a ativação da canaldopsina para investigar projeções de longo alcance para neurônios IC. Embora este protocolo seja adaptado para caracterizar insumos auditivos para o IC, ele pode ser facilmente adaptado para investigar outras projeções de longo alcance no cérebro auditivo e além.

Introdução

As conexões sinápticas são críticas à função do circuito neural, mas a topologia precisa e a fisiologia das sinapses dentro de circuitos neurais são muitas vezes difíceis de sondar experimentalmente. Isso porque a estimulação elétrica, a ferramenta tradicional de eletrofisiologia celular, ativa indiscriminadamente axônhons perto do local de estimulação, e na maioria das regiões cerebrais, axônons de diferentes fontes (local, ascendente e/ou descendente) entrelaçam-se. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM)^1,2, essa limitação agora pode ser superada³. A canaldopsina (ChR2) é um canal de íon seleção ativado originalmente encontrado na alga verde Chlamydomonas reinhardtii. O ChR2 pode ser ativado pela luz azul de um comprimento de onda em torno de 450-490 nm, despolarizando a célula através do fluxo de cisão. ChR2 foi descrito e expresso pela primeira vez em oócitos xenopus por Nagel e colegas⁴. Pouco depois disso, Boyden e seus colegas⁵ expressaram ChR2 em neurônios mamíferos e mostraram que poderiam usar pulsos de luz para controlar de forma confiável o espiamento em uma escala de tempo milissegundos, induzindo potenciais de ação ~10 ms após a ativação do ChR2 com luz azul. Canais optogenéticos com cinética ainda mais rápida foram encontrados recentemente (por exemplo, Chronos⁶).

A abordagem básica de um experimento CRACM é transfectar uma população de neurônios presinapticos putativos com um vírus associado adeno recombinante (rAAV) que carrega as informações genéticas para uma canaldopsina. A transfecção de neurônios com rAAV leva à expressão da canalizopsina codificada. Normalmente, a canaldopsina é marcada com uma proteína fluorescente como GFP (Proteína Fluorescente Verde) ou tdTomato (uma proteína fluorescente vermelha), de modo que a transfecção de neurônios na região alvo pode ser facilmente confirmada com imagens de fluorescência. Como os rAAVs não são patogênicos, têm um baixo potencial inflamatório e expressão genética de longa duração^7,8,eles se tornaram uma técnica padrão para entregar canaldopsinas aos neurônios. Se, após a transfecção de uma população presunnótica putativa de neurônios, a ativação de uma canaldopsina através de flashes de luz provoca potenciais postinapticos ou correntes nos neurônios-alvo, isso é evidência de uma conexão axonal do núcleo transinfectado à célula gravada. Como axôlos cortados em experimentos de fatia cerebral podem ser levados a liberar neurotransmissor através da ativação da canaldopsina, núcleos que ficam fora da fatia aguda, mas enviam axôlos para a região cerebral elástica podem ser identificados com CRACM. O poder desta técnica é que a conectividade e a fisiologia de entradas sinápticas de longo alcance identificadas podem ser investigadas diretamente.

Além das canaldopsinas que são excitáveis pela luz azul, os investigadores identificaram recentemente várias canaldopsinas de mudança vermelha^9,10,incluindo Chrimson e seu ChrimsonR analógico mais rápido, ambos animados com a luz vermelha de ~660 nm⁶. As opsinas de mudança vermelha são de interesse porque a luz vermelha penetra tecido melhor do que a luz azul, e a luz vermelha pode ter uma citotoxicidade menor do que a luz azul^10,11,12. Canalizodopsinas de mudança vermelha também abrem a possibilidade de experimentos de CRACM de dupla cor, onde a convergência de axôlos de diferentes núcleos no mesmo neurônio pode ser testada em um experimento^6,13,14. No entanto, as operações atuais com mudança vermelha muitas vezes exibem ativação cruzada indesejada com luz azul^15,16,17, dificultando dois experimentos de cores. Além disso, alguns relatórios indicaram que chrimsonR sofre tráfico axonal limitado, o que pode tornar desafiador o uso de ChrimsonR para experimentos CRACM^16,17.

Quase todas as projeções ascendentes dos núcleos de troncos auditivos mais baixos convergem no colículo inferior (IC), o centro do cérebro médio da via auditiva central. Isso inclui projeções do núcleo coclear (CN)^18,19, a maioria do complexo olivary superior (SOC)²⁰, e os núcleos dorsal (DNLL) e ventral (VNLL) do lemnisco lateral²¹. Além disso, uma grande projeção descendente do córtex auditivo termina no IC^{18,19,20,21,22}, e os próprios neurônios ic siempse amplamente dentro dos lóbulos locais e contralaterais do IC²³. A mistura de axônons de muitas fontes tornou difícil sondar circuitos ic usando estimulação elétrica²⁴. Como resultado, embora os neurônios do IC realizem cálculos importantes para a localização sonora e a identificação da fala e outras comunicações soem^25,26, a organização de circuitos neurais no IC é amplamente desconhecida. Recentemente identificamos os neurônios VIP como a primeira classe de neurôniomolecular identificável no IC²⁷. Os neurônios VIP são neurônios stellate glutamatergicos que projetam para vários alvos de longo alcance, incluindo o tálamo auditivo e o colículo superior. Agora somos capazes de determinar as fontes e a função das entradas locais e de longo alcance para os neurônios VIP e determinar como essas conexões de circuito contribuem para o processamento de som.

O protocolo aqui apresentado é adaptado para investigar insumos sinápticos aos neurônios VIP no IC dos camundongos, especificamente do IC contralateral e da DCN (Figura 1). O protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes fontes de entrada, um tipo de neurônio diferente ou uma região cerebral completamente diferente. Também mostramos que ChrimsonR é uma canaldopsina de mudança vermelha eficaz para mapeamento de circuitos de longo alcance no tronco auditivo. No entanto, demonstramos que chrimsonR é fortemente ativado pela luz azul, mesmo em baixas intensidades e, assim, para combinar ChrimsonR com Chronos em experimentos CRACM de duas cores, controles cuidadosos devem ser usados para evitar a interativação de ChrimsonR.

Protocolo

Obtenha aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) local e adere às diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos neste protocolo foram aprovados pela Universidade de Michigan IACUC e estavam de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Preparações de cirurgia

1. Realizar cirurgias em condições assépticas. Autoclave/esterilizar todas as ferramentas e materiais de cirurgia antes da cirurgia. Use vestido de cirurgia e máscara para a cirurgia.
2. Higienize a área de cirurgia (pulverizar e limpar com 70% de etanol) e coloque cortinas de toalha estéril para cobrir a área cirúrgica.
3. Prepare a gaiola de recuperação. Remova a cama da gaiola para limitar o risco de asfixia. Coloque uma almofada de aquecimento debaixo da gaiola. Forneça uma fonte de comida e água.
4. Puxe um capilar de vidro para o nanoinjetor em um puxador pipette. O calor intenso do filamento de aquecimento durante o processo de puxar esterilizará o capilar de vidro. Corte ou quebre a ponta para obter uma abertura de aproximadamente 5 μm de diâmetro.
5. Acerte a ponta capilar a um ângulo de aproximadamente 30° para melhorar a penetração do tecido e reduzir o entupimento. Encha o capilar com óleo mineral e insira em um injetor de nanolitro.
6. Obtenha uma alíquota do rAAV de codificação de canaldopsina desejada e diluir ao titer desejado usando PBS estéreis.
   NOTA: Descobrimos que os rAAVs sorotipo 1 funcionam bem para transfecção de núcleos de troncos auditivos. Especificamente, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (canaldopsina ativada pela luz azul) e rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (canaldopsina de mudança vermelha), que estão disponíveis a partir de repositórios e núcleos vetoris acessíveis publicamente, consistentemente produzir os altos níveis de expressão e o bom tráfico axonal de longo alcance de canaldopsinas necessárias para experimentos CRACM.
7. Siga as instruções do injetor para o preenchimento dianteiro capilar com 1-3 μL de rAAV em PBS estéreis.

2. Cirurgia

1. Coloque o animal em uma câmara de indução e induz anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio entregue através de um vaporizador de isoflurano calibrado. Observe o mouse até que a respiração se torne profunda e lenta e um reflexo de pitada de dedo do dedo do dodo do do dodo esteja ausente, cerca de 3-5 min.
2. Transfira o animal para uma moldura estereotaxica. Proteja a cabeça do animal colocando a boca em uma barra de paladar com uma máscara de anestesia a gás e posicionando barras de ouvido não perfurantes em ambos os canais auditivos.
3. Insira uma sonda de temperatura retal e ligue o controlador de temperatura homeostático.
4. Aplique pomada oftalma para evitar que os olhos sequem.
5. Administrar analgésico preventivo (por exemplo, injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno).
6. Ajuste o isoflurano para 1-2,5%, de acordo com a profundidade do estado anestesiado. Monitore a temperatura, a respiração e a cor das membranas mucosas pelo menos a cada 15 minutos durante o procedimento.
7. Raspe o couro cabeludo com cortadores elétricos. Prepare o couro cabeludo com três cotonetes alternados de povido-iodo e 70% de etanol.
8. Faça uma incisão no couro cabeludo ao longo da linha média começando entre as orelhas e continuando rostral aos olhos, expondo as suturas lambda e bregma. Empurre a pele para o lado e remova o periosteum do osso exposto, se necessário.
9. Marque a sutura lambda com um marcador cirúrgico estéril, posicione a ponta do nanoinjetor para que ele esteja apenas tocando lambda, e zero as coordenadas micromanipuladoras. Use a ponta nanoinjetora e o micromanipulador para medir a diferença de elevação entre as suturas lambda e bregma. Ajuste a altura da barra de paladar para levar lambda e bregma para dentro de ± 100 μm de altura diferença.
10. Mapeie o local da injeção usando o sistema de coordenadas nanoinjetor e micromanipulador e marque o local com um marcador cirúrgico estéril. Para injetar o IC ou DCN de camundongos P21-P30, use coordenadas relativas à sutura lambda, como mostrado na Tabela 1. Note que a profundidade Z em nossas coordenadas é medida da superfície do crânio em lambda.
11. Use uma broca micromotora com uma broca estéril de 0,5 mm para realizar uma craniotomia sobre o local da injeção.
12. Para garantir uma grande transfecção de neurônios no núcleo alvo, faça injeções em várias profundidades no tecido (Tabela 1, coordenadas Z), e, no caso de regiões cerebrais maiores como a IC, faça injeções ao longo de duas ou mais penetrações em diferentes coordenadas X e Y (Tabela 1, Penetração de IC direito 1 e penetração de IC direito 2).
13. Faça injeções. Para injeções ic, deposite 20 nL de vírus em intervalos de 250 μm ao longo do eixo Z (profundidade de injeção) entre 2.250 μm e 1750 μm de profundidade. Para injeções DCN, deposite 20 nL de vírus a uma profundidade de 4.750 μm e 4.550 μm, respectivamente.
14. Após a injeção em cada coordenada Z, espere 2-3 min antes de mover o injetor para a próxima coordenada Z. Isso permitirá tempo para o vírus se difundir do local da injeção, reduzindo a probabilidade de que o vírus seja sugado pelo trato de injeção quando o nanoinjetor for reposicionado.
15. Após a última injeção em uma penetração, espere 3-5 min antes de retrair nanoinjetor do cérebro.
16. Quando o nanoinjetor é removido do cérebro entre penetrações e entre animais, ejete um pequeno volume de vírus da ponta para verificar se a ponta não entupiu.
17. Após as injeções, use PBS estéreis para musfar as bordas cortadas do couro cabeludo e, em seguida, mova suavemente a pele de volta para a linha média. Feche a ferida com suturas simples interrompidas usando suturas de nylon 6-0 (0,7 métricas).
18. Aplique 0,5-1 mL de 2% de gel lidocaína na ferida.
19. Remova as barras de ouvido e a sonda de temperatura, desligue isoflurane, retire o mouse da barra de paladar e transfira-o para a gaiola de recuperação.
20. Monitore a recuperação de perto. Uma vez que o animal está totalmente acordado, movendo-se, e não mostrando sinais de dor ou angústia, transfira-o de volta para sua gaiola e devolva a gaiola para o vivarium.
21. Se as cirurgias forem realizadas em vários animais em um dia, use um esterilizador de contas quentes para higienizar ferramentas de cirurgia e perfurar rebarba antes da próxima cirurgia.

3. Acompanhamento cirúrgico

1. Verifique diariamente os animais para fechamento de feridas, infecção ou sinais de dor ou angústia nos próximos 10 dias, aderindo às diretrizes de cuidados com os animais da instituição.
2. Espere 3-4 semanas antes de usar animais em experimentos para permitir a expressão ideal das canaldopsinas.

4. Preparação de fatias cerebrais e confirmação do alvo de injeção

1. Para o CRACM, use fatias cerebrais agudamente preparadas de animais transfeccionados em experimentos de eletrofisiologia in vitro padrão, descritos aqui apenas brevemente (veja Goyer et al. 2019 para uma descrição mais detalhada²⁷).
2. Prepare fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 12,5 D-glicose, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 1,5 CaCl_2,1 MgSO₄. Bubble ACSF a um pH de 7,4 com 5% de CO₂ em 95% O₂.
3. Executar todas as etapas seguintes, incluindo eletrofisiologia in vitro, em quase escuridão ou luz vermelha para limitar a ativação de canaldopsinas.
4. Anestesiaprofundamente o rato com isoflurano e decapitá-lo rapidamente. Disseceu o cérebro rapidamente em ~34 °C ACSF.
5. Corte as fatias coronal (200-250 μm) contendo o IC em ~34 °C ACSF com um microtome vibratório e incubar as fatias a 34 °C por 30 min em uma câmara de espera cheia de ACSF borbulhava com 5% de CO₂ em 95% O₂. Após a incubação, armazene fatias à temperatura ambiente até ser usada para gravações.
6. Se o alvo de injeção não fosse o IC, corte fatias coronais adicionais da região cerebral injetada e verifique a transfecção do núcleo alvo um microscópio de fluorescência. Se não houver transfecção no núcleo alvo ou transfecção adicional em diferentes regiões cerebrais, não continue com o experimento.

5. Gravação in vitro e experimento CRACM

NOTA: Para fornecer estimulação óptica de Chronos e ChrimsonR, usamos LEDs acoplados à porta de epifluorescência do microscópio. No entanto, os lasers podem ser usados em vez de LEDs. Se usar lasers, obtenha aprovação prévia dos oficiais de segurança institucional e siga as diretrizes apropriadas para o uso seguro do laser.

1. Puxe eletrodos do vidro borosilica para uma resistência de 3,5-4,5 MΩ. A solução interna eletrodo deve conter (em mM): 115 K-gluconato, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ fosfócritina, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, complementado com 0,1% de biocitina (w/v), pH ajustado a 7,3 com KOH e osmolalidade a 290 mOsm/kg sucrose com sucrose.
2. Para fazer gravações, use métodos padrão de fixação de patches. Coloque a fatia em uma câmara de gravação um microscópio vertical de estágio fixo e perfume continuamente com ACSF a ~2 mL/min. Realizar gravações perto da temperatura fisiológica (~34-36 °C).
3. Patch neurônios controle visual usando um amplificador de grampo de remendo adequado. Correto para resistência em séries, capacitância de pipeta e potencial de junção líquida.
4. Durante gravações de células inteiras, ative chronos entregando pulsos breves (1-5 ms) de 470 nm de luz ou ChrimsonR por pulsos curtos de luz de 580 nm através de LEDs comercialmente disponíveis. Determine o limiar de ativação de opsina e use um protocolo mínimo de estimulação para provocar potenciais postinapticos. Em geral, use a duração de estímulo mais curta que provoca um PSP e defina a potência óptica para 120% da potência limiar necessária para provocar PSPs.
5. Para confirmar que as alterações registradas no potencial da membrana são de fato entradas sinápticas ao neurônio, antagonistas padrão para receptores ecinéticos excitatórios/inibitórios podem ser lavados durante o experimento. Para investigar diferentes contribuições de receptores para um PSP (por exemplo, receptores NMDA vs AMPA), antagonistas receptores adequados podem ser lavados. Para cada antagonista receptor, os efeitos da droga devem reverter após o lavagem.
6. Use a latência, o nervosismo e a confiabilidade dos PSPs para confirmar que as entradas sinápticas ativadas pela luz são originárias da ativação direta e óptica de sinapses no neurônio gravado, em oposição à ativação de sinapses expressando canaldopsina em uma intervenção neurônio que sinapses no neurônio registrado. Em geral, baixa latência (<2 ms), baixo nervosismo (<1 ms desvio padrão em latência) e alta confiabilidade (>50%) indicar uma conexão sináptica direta da canaldopsina expressando neurônio pré-naptico ao neurônio gravado.

Resultados

Cruzamos os ratos VIP-IRES-Cre (Vip^tm1(cre)Zjh/J) e Ai14 Cre-reporter mice (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14 (CAG-tdTomato)Hze}/J) para gerar filhotes de F1 em que os neurônios VIP expressam a proteína fluorescente tdTomato. Foram utilizadas proles de F1 de ambos os sexos, idade pós-natal (P) 21 a P70. Foram utilizados 22 animais neste estudo.

Injeção estereotaxista de AAV1. Syn.Chronos-GFP.WP...

Discussão

Descobrimos que o CRACM é uma técnica poderosa para identificar e caracterizar entradas sinápticas de longo alcance aos neurônios no IC do camundongo. Seguindo o protocolo detalhado aqui, alcançamos uma transição robusta de neurônios no DCN e no IC, bem como o tráfico axonal confiável de Chronos e ChrimsonR para terminais sinápticos no IC. Além disso, demonstramos que essa técnica permite a medição e análise de eventos postinapticos, incluindo amplitude PSP, meia largura, tempo de decomposição e farmaco...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH	Addgene	59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Addgene	59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson Laboratory	stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-B4
Carproject (carprofen)	Henry Schein Animal Health	59149
Drummond glas capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3	Drummond Scientific Company	3-300-207
Electrode beveler	Sutter Instrument	FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures	Ethicon	local pharmacy
Fixed stage microscope	any	n/a
Gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments	933-B
General surgery tools	Fine Science Tools	N/A
Golden A5 pet clipper	Oster	078005-010-003
Heating pad	Custom build	N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system	Patterson Scientific	78917760
Hot bead sterilizer Steri 250	Inotech	IS-250
Iodine solution 10%	MedChoice	local pharmacy
Isoflurane vaporizer	Patterson Scientific	07-8703592
Lidocain topical jelly 2%	Akorn	local pharmacy
Micro motor drill 1050	Henry Schein Animal Health	7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm	Fine Science Tools	19007-05
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears	Akorn	local pharmacy
P-1000 electrode puller	Sutter Instrument	P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software	any	n/a
Portable anethesia machine	Patterson Scientific	07-8914724
Small animal steroetaxic frame	David Kopf Instruments	930-B
Standard chemicals	local vendors	N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical marker	Fine Science Tools	18000-30
Temperature controller	Custom build	N/A
Vibratome	any	n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)	Jackson Laboratory	stock #010908
Water bath	any	n/a