Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges

Résumé

La cartographie de circuit assistée par la chaînerhodopsine (CRACM) est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée entre les groupes anatomiques et/ou génétiquement identifiés des neurones. Ici, nous décrivons comment utiliser CRACM pour cartographier les connexions auditives du tronc cérébral, y compris l’utilisation d’une opsine rouge décalée, ChrimsonR.

Résumé

Lors de l’étude des circuits neuronaux, une limitation standard de l’approche de pince de correction in vitro est que les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile d’isoler les entrées de sources individuelles avec stimulation électrique. Cependant, en utilisant la cartographie assistée de circuit de canalrhodopsine (CRACM), cette limitation peut maintenant être surmontée. Ici, nous rapportons une méthode pour employer CRACM pour cartographier les entrées ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral et des entrées commissural à une classe identifiée de neurones dans le colliculus inférieur (IC), le noyau de midbrain du système auditif. Dans l’IC, les axones locaux, commissuraux, ascendants et descendants sont fortement entrelacés et donc indiscernables avec la stimulation électrique. En injectant une construction virale pour conduire l’expression d’un canalrhodopsin dans un noyau presynaptique, suivi de l’enregistrement de pince de correction pour caractériser la présence et la physiologie des entrées synaptiques channelrhodopsin-exprimant, projections d’une source spécifique à une population spécifique de neurones IC peut être cartographié avec une précision spécifique au type cellulaire. Nous montrons que cette approche fonctionne à la fois avec Chronos, une canalrhodopsine activée par la lumière bleue, et ChrimsonR, une canalrhodopsine à décalée rouge. Contrairement aux rapports précédents de l’avant-cerveau, nous constatons que ChrimsonR est solidement trafiqué dans les axones des neurones principaux du noyau cochléaire dorsal, ce qui indique que ChrimsonR peut être un outil utile pour les expériences CRACM dans le tronc cérébral. Le protocole présenté ici comprend des descriptions détaillées de la chirurgie par injection de virus intracrânien, y compris des coordonnées stéréotaxiques pour cibler les injections au noyau cochléaire dorsal et ic des souris, et comment combiner l’enregistrement de pince de patch cellulaire entier avec l’activation de channelrhodopsine pour étudier des projections à longue portée aux neurones ic. Bien que ce protocole soit conçu pour caractériser les apports auditifs à l’IC, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres projections à long terme dans le tronc cérébral auditif et au-delà.

Introduction

Les connexions synaptiques sont essentielles à la fonction du circuit neuronal, mais la topologie et la physiologie précises des synapses dans les circuits neuronaux sont souvent difficiles à sonder expérimentalement. C’est parce que la stimulation électrique, l’outil traditionnel de l’électrophysiologie cellulaire, active sans discernement les axones près du site de stimulation, et dans la plupart des régions du cerveau, les axones de différentes sources (locales, ascendantes et/ou descendantes) s’entremêlent. Cependant, en utilisant channelrhodopsine cartographie de circuit assisté (CRACM)^1,2, cette limitation peut maintenant être surmontée³. Channelrhodopsin (ChR2) est une lumière activée, canal d’ions cation-sélectif à l’origine trouvé dans l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 peut être activé par la lumière bleue d’une longueur d’onde autour de 450-490 nm, dépolarisant la cellule par l’afflux de cation. ChR2 a été décrit pour la première fois et exprimé dans les ovocytes Xenopus par Nagel et ses collègues⁴. Peu de temps après, Boyden et ses collègues⁵ ont exprimé le ChR2 dans les neurones mammifères et ont montré qu’ils pouvaient utiliser des impulsions lumineuses pour contrôler de façon fiable les pointes sur une échelle de temps milliseconde, induisant des potentiels d’action de 10 ms après l’activation de ChR2 avec la lumière bleue. Des canaux optogénétiques avec des cinétiques encore plus rapides ont été trouvés récemment (par exemple, Chronos⁶).

L’approche de base d’une expérience CRACM est de transfect une population de neurones présynaptiques putatifs avec un virus adéno-associé recombinant (rAAV) qui porte l’information génétique pour une canalrhodopsine. La transfection des neurones avec le rAAV conduit à l’expression de la channelrhodopsine codée. Typiquement, la canalrhodopsine est marquée avec une protéine fluorescente comme GFP (protéine fluorescente verte) ou tdTomato (une protéine fluorescente rouge), de sorte que la transfection des neurones dans la région cible peut facilement être confirmée avec l’imagerie de fluorescence. Parce que les rAAV sont non pathogènes, ont un faible potentiel inflammatoire et l’expression génique de longue durée^7,8, ils sont devenus une technique standard pour livrer des canalrhodopsines aux neurones. Si, après transfection d’une population présynaptique putative de neurones, l’activation d’une canalrhodopsine par des éclairs de lumière suscite des potentiels ou des courants postsynaptiques dans les neurones cibles, c’est l’évidence d’une connexion axonale du noyau transfecté à la cellule enregistrée. Puisque les axones coupés dans des expériences de tranche de cerveau peuvent être conduits pour libérer le neurotransmetteur par l’activation de canalrhodopsine, les noyaux qui se trouvent en dehors de la tranche aigue mais envoient des axones dans la région de cerveau postsynaptic peuvent être identifiés avec CRACM. La puissance de cette technique est que la connectivité et la physiologie des entrées synaptiques à longue portée identifiées peuvent être étudiées directement.

En plus de channelrhodopsines qui sont excitables par la lumière bleue, les enquêteurs ont récemment identifié plusieurs canalrhodopsines rouges décalées^9,10, y compris Chrimson et son plus rapide analogique ChrimsonR, qui sont tous deux excités par la lumière rouge de 660 nm⁶. Les opsines à décalé rouge sont d’intérêt parce que la lumière rouge pénètre le tissu mieux que la lumière bleue, et la lumière rouge peut avoir une cytotoxicité inférieure à la lumière bleue^10,11,12. Les canalrhodopsines décalées rouges ouvrent également la possibilité d’expériences CRACM à double couleur, où la convergence des axones de différents noyaux sur le même neurone peut être testée dans une expérience^6,13,14. Cependant, les opsines rouges actuelles présentent souvent une activation croisée non désirée avec une lumière bleue^15,16,17, ce qui rend deux expériences de couleur difficiles. En outre, certains rapports ont indiqué que ChrimsonR subit un trafic axonal limité, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de ChrimsonR pour les expériences du CRACM^16,17.

Presque toutes les projections ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral convergent dans le colliculus inférieur (IC), le centre de cerveau moyen de la voie auditive centrale. Cela comprend les projections du noyau cochléaire (CN)^18,19, la plupart du complexe olivaire supérieur (SOC)²⁰, et le dorsal (DNLL) et ventral (VNLL) noyaux du lemniscus latéral²¹. En outre, une grande projection descendante du cortex auditif se termine dans l’IC^{18,19,20,21,22}, et les neurones IC eux-mêmes synapse largement dans les lobes locaux et contralatéraux de l’IC²³. L’entremêlement d’axones provenant de nombreuses sources a rendu difficile la sonde des circuits IC à l’aide de la stimulation électrique²⁴. En conséquence, même si les neurones de l’IC effectuent des calculs importants pour la localisation sonore et l’identification de la parole et d’autres sons de communication^25,26, l’organisation des circuits neuronaux dans l’IC est largement inconnue. Nous avons récemment identifié les neurones VIP comme la première classe de neurones moléculairement identifiables dans l’IC²⁷. Les neurones VIP sont des neurones stellates glutamatergiques qui projettent à plusieurs cibles à longue portée, y compris le thalamus auditif et colliculus supérieur. Nous sommes maintenant en mesure de déterminer les sources et la fonction des entrées locales et à longue portée aux neurones VIP et de déterminer comment ces connexions de circuit contribuent au traitement du son.

Le protocole présenté ici est conçu pour étudier les apports synaptiques aux neurones VIP dans l’IC des souris, en particulier de l’IC contralatéral et le DCN (Figure 1). Le protocole peut être facilement adapté à différentes sources d’entrée, un type de neurone différent ou une région différente du cerveau tout à fait. Nous montrons également que ChrimsonR est une canalrhodopsine rouge-décalée efficace pour la cartographie à longue distance de circuit dans le tronc cérébral auditif. Cependant, nous démontrons que ChrimsonR est fortement activé par la lumière bleue, même à faible intensité, et donc, pour combiner ChrimsonR avec Chronos dans des expériences CRACM bicolores, des contrôles prudents doivent être utilisés pour empêcher l’activation croisée de ChrimsonR.

Protocole

Obtenir l’approbation du Comité local de soins et d’utilisation des animaux en établissement (IACUC) et adhérer aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par l’IACUC de l’Université du Michigan et étaient conformes aux lignes directrices des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparations chirurgicales

1. Effectuer des chirurgies dans des conditions aseptiques. Autoclave/stériliser tous les outils et matériaux de chirurgie avant la chirurgie. Portez une robe de chirurgie et un masque pour la chirurgie.
2. Assainiz la zone de chirurgie (vaporiser et essuyer avec 70% d’éthanol), et placez des rideaux stériles de serviette pour couvrir la zone de chirurgie.
3. Préparer la cage de récupération. Enlever la literie de la cage pour limiter le risque d’asphyxie. Placez un coussin chauffant sous la cage. Fournir une source de nourriture et d’eau.
4. Tirez un capillaire en verre pour le nanoinjecteur sur un puller pipette. La chaleur intense du filament de chauffage pendant le processus de traction stérilisera le capillaire en verre. Couper ou casser la pointe pour obtenir une ouverture d’environ 5 m de diamètre.
5. Léguez la pointe capillaire à un angle d’environ 30 degrés pour améliorer la pénétration des tissus et réduire l’engorgement. Remblayez le capillaire avec de l’huile minérale et insérez-le dans un injecteur de nanolitres.
6. Obtenir un aliquot de la rAAV de channelrhodopsin-encodage souhaitée et diluer au tter désiré utilisant le PBS stérile.
   REMARQUE : Nous avons constaté que les rAAV de sérotype 1 fonctionnent bien pour la transfection des noyaux auditifs de tronc cérébral. Plus précisément, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (blue light-activated channelrhodopsin) et rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (red-shifted channelrhodopsin), qui sont disponibles à partir de dépôts accessibles au public et les cœurs vectoriels, rendement constant des niveaux d’expression élevés et du bon trafic axonal à longue portée de canalrhodopsines nécessaires aux expériences du CRACM.
7. Suivez les instructions de l’injecteur pour remplir le capillaire avant avec 1-3 L de rAAV en PBS stérile.

2. Chirurgie

1. Mettre l’animal dans une chambre d’induction et induire l’anesthésie avec 3% d’isoflurane dans l’oxygène livré via un vaporisateur d’isoflurane calibré. Observez la souris jusqu’à ce que la respiration devienne profonde et lente et qu’un réflexe de pincement des orteils soit absent, environ 3-5 min.
2. Transférer l’animal dans un cadre stéréotaxique. Sécurisez la tête de l’animal en mettant sa bouche sur une barre de palais avec un masque d’anesthésie à gaz et en positionnant des barres d’oreilles non perforantes dans les deux canaux auditifs.
3. Insérez une sonde de température rectale et allumez le contrôleur de température homéostatique.
4. Appliquer une pommade ophtalmique pour empêcher les yeux de se dessécher.
5. Administrer un analgésique préventif (p. ex., injection sous-cutanée de 5 mg/kg de carprofène).
6. Ajuster l’isoflurane à 1-2,5%, selon la profondeur de l’état anesthésié. Surveillez la température, la respiration et la couleur des muqueuses au moins toutes les 15 minutes pendant l’intervention.
7. Raser le cuir chevelu avec des tondeuses électriques. Préparer aseptiquement le cuir chevelu avec trois écouvillons alternés de povidone-iode et 70% d’éthanol.
8. Faire une incision dans le cuir chevelu le long de la ligne médiane en commençant entre les oreilles et en continuant rostral aux yeux, en exposant les sutures lambda et bregma. Poussez la peau sur le côté et retirez le périosteume de l’os exposé si nécessaire.
9. Marquer la suture lambda avec un marqueur chirurgical stérile, positionner la pointe du nanoinjecteur de sorte qu’il est juste toucher lambda, et zéro les coordonnées micromanipulateur. Utilisez la pointe nanoinjecteur et le micromanipulateur pour mesurer la différence d’altitude entre les sutures lambda et bregma. Ajuster la hauteur de la barre de bouche pour amener lambda et bregma à moins de 100 m de hauteur.
10. Cartographiez le site d’injection à l’aide de la pointe nanoinjecteur et du système de coordonnées micromanipulateurs et marquez le site à l’aide d’un marqueur chirurgical stérile. Pour injecter l’IC ou le DCN des souris P21-P30, utilisez des coordonnées par rapport à la suture lambda, comme le montre le tableau 1. Notez que la profondeur Z dans nos coordonnées est mesurée à partir de la surface du crâne à lambda.
11. Utilisez une perceuse micromotrice avec une bavure stérile de 0,5 mm pour effectuer une craniotomie au-dessus du site d’injection.
12. Pour assurer une transfection large des neurones dans le noyau cible, faire des injections à différentes profondeurs dans le tissu(tableau 1, coordonnées Z), et, dans le cas de plus grandes régions du cerveau comme l’IC, faire des injections au cours de deux pénétrations ou plus à différentes coordonnées X et Y(tableau 1, pénétration ic droite 1 et pénétration IC droit 2).
13. Effectuer des injections. Pour les injections d’IC, déposez 20 nL de virus dans des intervalles de 250 m le long de l’axe Z (profondeur d’injection) entre 2 250 et 1750 m de profondeur. Pour les injections de DCN, déposez 20 nL de virus à une profondeur de 4 750 m et 4 550 m, respectivement.
14. Après l’injection à chaque coordonnées Z, attendez 2-3 min avant de déplacer l’injecteur à la prochaine coordonnées Z. Cela donnera le temps au virus de se diffuser loin du site d’injection, ce qui réduira la probabilité que le virus soit aspiré dans le tractus d’injection lorsque le nanoinjecteur sera repositionné.
15. Après la dernière injection dans une pénétration, attendre 3-5 min avant de rétracter nanoinjecteur du cerveau.
16. Lorsque le nanoinjecteur est retiré du cerveau entre les pénétrations et entre les animaux, éjecter un petit volume de virus de la pointe pour vérifier que la pointe n’a pas obstrué.
17. Après les injections, utiliser du PBS stérile pour mouiller les bords coupés du cuir chevelu, puis déplacer doucement la peau vers la ligne médiane. Fermez la plaie avec de simples sutures interrompues à l’aide de sutures en nylon 6-0 (0,7 métrique).
18. Appliquer 0,5-1 ml de gel de lidocaïne de 2% sur la plaie.
19. Retirez les barres d’oreille et la sonde de température, éteignez l’isoflurane, retirez la souris de la barre du palais et transférez-la dans la cage de récupération.
20. Surveillez la récupération de près. Une fois que l’animal est complètement éveillé, se déplaçant, et ne montrant aucun signe de douleur ou de détresse, transférez-le de nouveau dans sa cage et retournez la cage au vivarium.
21. Si des chirurgies seront effectuées sur plusieurs animaux en une journée, utilisez un stérilisateur à perles chaudes pour assainir les outils de chirurgie et forer la bavure avant la prochaine chirurgie.

3. Suivi chirurgical

1. Vérifiez les animaux tous les jours pour vérifier la fermeture des plaies, l’infection ou des signes de douleur ou de détresse au cours des 10 prochains jours, en adhérant aux lignes directrices de l’établissement en matière de soins aux animaux.
2. Attendez 3-4 semaines avant d’utiliser les animaux dans des expériences pour permettre l’expression optimale des channelrhodopsines.

4. Préparation de tranche de cerveau et confirmation de la cible d’injection

1. Pour le CRACM, utiliser des tranches de cerveau préparées de façon aigue à partir d’animaux transfectés dans des expériences d’électrophysiologie in vitro standard, décrites ici brièvement (voir Goyer et al., 2019 pour une description plus détaillée²⁷).
2. Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 12,5 D-glucose, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1,5 CaCl₂, 1 MgSO₄. Bulle ACSF à un pH de 7,4 avec 5% CO₂ dans 95% O₂.
3. Effectuez toutes les étapes suivantes, y compris l’électrophysiologie in vitro, dans la quasi-obscurité ou la lumière rouge pour limiter l’activation des channelrhodopsines.
4. Anesthésiez profondément la souris avec l’isoflurane et la décapitez rapidement. Disséquez le cerveau rapidement dans un ACSF de 34 oC.
5. Couper les tranches coronales (200-250 m) contenant l’IC en ACSF à 34 oC avec un microtome vibrant et incuber les tranches à 34 oC pendant 30 min dans une chambre de retenue remplie d’ACSF bouillonné de 5% de CO₂ à 95% O₂. Après l’incubation, conserver les tranches à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour les enregistrements.
6. Si la cible d’injection n’était pas l’IC, couper des tranches coronales supplémentaires de la région du cerveau injectée et vérifier la transfection du noyau cible sous un microscope à fluorescence. S’il n’y a pas de transfection dans le noyau cible ou de transfection supplémentaire dans différentes régions du cerveau, ne continuez pas l’expérience.

5. In Vitro Recording et CRACM Expérience

REMARQUE : Pour fournir la stimulation optique de Chronos et de ChrimsonR, nous utilisons des LED couplées au port d’épifluorescence du microscope. Cependant, les lasers peuvent être utilisés au lieu de LED. Si vous utilisez des lasers, obtenez l’approbation préalable des responsables de la sécurité des établissements et suivez les lignes directrices appropriées pour une utilisation sécuritaire au laser.

1. Tirez des électrodes du verre borosilicate à une résistance de 3,5 à 4,5 M. La solution interne d’électrode devrait contenir (en mM) : 115 K-gluconate, 7,73 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ phosphocreatine, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, complété par 0,1% de biocytine (w/v), pH ajusté à 7,3 avec KOH et osmolality à 290 mOs/kgucrose.
2. Pour faire des enregistrements, utilisez des méthodes standard de pince de correction. Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement sous un microscope droit à stade fixe et perfuser continuellement avec l’ACSF à 2 ml/min. Conduire des enregistrements près de la température physiologique (34-36 oC).
3. Patch neurones sous contrôle visuel à l’aide d’un amplificateur de pince de patch approprié. Correct pour la résistance de série, la capacité de pipette et le potentiel liquide de jonction.
4. Pendant les enregistrements de cellules entières, activez Chronos en livrant de brèves impulsions (1-5 ms) de 470 nm de lumière ou ChrimsonR par de brèves impulsions de 580 nm de lumière grâce à des LED disponibles dans le commerce. Déterminer le seuil d’activation de l’opsine et utiliser un protocole de stimulation minimal pour obtenir des potentiels postsynaptiques. En général, utilisez la durée de stimulation la plus courte qui suscite un PSP, et fixez la puissance optique à 120% de la puissance de seuil requise pour obtenir PSPs.
5. Pour confirmer que les changements enregistrés dans le potentiel membranaire sont en effet des entrées synaptiques dans le neurone, les antagonistes standard pour les récepteurs postsynaptiques excitateurs/inhibiteurs peuvent être lavés pendant l’expérience. Pour étudier différentes contributions des récepteurs à un PSP (p. ex. récepteurs NMDA vs AMPA), les antagonistes des récepteurs appropriés peuvent être lavés. Pour chaque antagoniste des récepteurs, les effets des médicaments doivent s’inverser après le lavage.
6. Utilisez la latence, la nervosité et la fiabilité des PSP pour confirmer que les entrées synaptiques activées par la lumière proviennent de l’activation directe et optique des synapses sur le neurone enregistré, par opposition à l’activation des synapses exprimant la nérhodopsine sur une intervention neurone qui synapses sur le neurone enregistré. En général, faible latence (lt;2 ms), faible nervosité (écart standard de 1 ms en latence) et grande fiabilité (-gt;50%) indiquer une connexion synaptique directe de la channelrhodopsine exprimant le neurone presynaptic au neurone enregistré.

Résultats

Nous avons croisé des souris VIP-IRES-Cre(Vip^tm1(cre)Zjh/J) et Ai14 Cre-reporter souris (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J) pour générer la progéniture F1 dans laquelle les neurones VIP expriment la protéine fluorescente tdTomato. F1 progéniture de l’un ou l’autre sexe ont été utilisés, le jour postnatal âgé (P) 21 à P70. Au total, 22 animaux ont été utilisés dans cette étude.

Discussion

Nous avons constaté que CRACM est une technique puissante pour identifier et caractériser les entrées synaptiques à longue portée aux neurones de la souris IC. En suivant le protocole détaillé ici, nous avons réalisé une transfection robuste des neurones dans le DCN et IC ainsi que le trafic axonal fiable de Chronos et ChrimsonR aux terminaux synaptiques dans l’IC. En outre, nous avons démontré que cette technique permet la mesure et l’analyse des événements postsynaptiques, y compris l’amplitude PSP, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH	Addgene	59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Addgene	59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson Laboratory	stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-B4
Carproject (carprofen)	Henry Schein Animal Health	59149
Drummond glas capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3	Drummond Scientific Company	3-300-207
Electrode beveler	Sutter Instrument	FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures	Ethicon	local pharmacy
Fixed stage microscope	any	n/a
Gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments	933-B
General surgery tools	Fine Science Tools	N/A
Golden A5 pet clipper	Oster	078005-010-003
Heating pad	Custom build	N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system	Patterson Scientific	78917760
Hot bead sterilizer Steri 250	Inotech	IS-250
Iodine solution 10%	MedChoice	local pharmacy
Isoflurane vaporizer	Patterson Scientific	07-8703592
Lidocain topical jelly 2%	Akorn	local pharmacy
Micro motor drill 1050	Henry Schein Animal Health	7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm	Fine Science Tools	19007-05
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears	Akorn	local pharmacy
P-1000 electrode puller	Sutter Instrument	P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software	any	n/a
Portable anethesia machine	Patterson Scientific	07-8914724
Small animal steroetaxic frame	David Kopf Instruments	930-B
Standard chemicals	local vendors	N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical marker	Fine Science Tools	18000-30
Temperature controller	Custom build	N/A
Vibratome	any	n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)	Jackson Laboratory	stock #010908
Water bath	any	n/a