Mappatura del circuito a lungo raggio assistita da Channelrhodopsin dei neuroni Colliculus inferiori con Channelrhodopsins blu e rosso

Riepilogo

La mappatura dei circuiti assistiti da channelrhodopsin (CRACM) è una tecnica di precisione per la mappatura funzionale delle proiezioni neuronali a lungo raggio tra gruppi di neuroni anatomicamente e/o geneticamente identificati. Qui, descriviamo come utilizzare CRACM per mappare le connessioni uditive del tronco, incluso l'uso di un opsin in rosso, ChrimsonR.

Abstract

Quando si studiano i circuiti neurali, una limitazione standard dell'approccio di morsetto patch in vitro è che gli assoni provenienti da più fonti sono spesso intermixed, rendendo difficile isolare gli input da singole fonti con stimolazione elettrica. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assistited circuit mapping (CRACM), questa limitazione può ora essere superata. Qui, riportiamo un metodo per utilizzare CRACM per mappare gli input ascendenti da nuclei del tronco encefalico meno bassi uditivi e input commissurali a una classe identificata di neuroni nel collicolo inferiore (IC), il nucleo midbrain del sistema uditivo. Nell'IC, gli assoni locali, commissri, ascendenti e discendenti sono fortemente intrecciati e quindi indistinguibili dalla stimolazione elettrica. Iniettando un costrutto virale per guidare l'espressione di una channelrhodopsin in un nucleo presintatico, seguita dalla registrazione dei blocchi di patch per caratterizzare la presenza e la fisiologia degli ingressi sinaptici che esprimono channelrhodopsin, proiezioni da una fonte specifica a una popolazione specifica di neuroni IC possono essere mappati con precisione specifica del tipo di cellula. Dimostriamo che questo approccio funziona sia con Chronos, una channelrhodopsin ad attivazione della luce blu, sia con ChrimsonR, una channelrhodopsin con cambio rosso. In contrasto con i precedenti rapporti dal prosencefalo, troviamo che ChrimsonR è robustamente trafficato lungo gli assi dei neuroni principali del nucleo cocleare dorsale, indicando che ChrimsonR può essere uno strumento utile per gli esperimenti CRACM nel tronco encefalico. Il protocollo qui presentato include descrizioni dettagliate della chirurgia di iniezione di virus intracranico, incluse le coordinate stereotassiche per indirizzare le iniezioni al nucleo cocleare dorsale e all'IC dei topi, e come combinare la registrazione dei morsetti a tutta cella con attivazione della channelrhodopsin per studiare le proiezioni a lungo raggio ai neuroni IC. Anche se questo protocollo è adattato per caratterizzare gli input uditivi all'IC, può essere facilmente adattato per studiare altre proiezioni a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo e oltre.

Introduzione

Le connessioni sinaptiche sono fondamentali per la funzione del circuito neurale, ma la topologia precisa e la fisiologia delle sinapsi all'interno dei circuiti neurali sono spesso difficili da sondare sperimentalmente. Questo perché la stimolazione elettrica, lo strumento tradizionale dell'elettrofisiologia cellulare, attiva indiscriminatamente gli assoni vicino al sito di stimolazione, e nella maggior parte delle regioni cerebrali, gli assoni provenienti da fonti diverse (locali, ascendenti e/o discendenti) si intrecciano. Tuttavia, utilizzando channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)^1,2, questa limitazione può ora essere superata³. La channelrhodopsin (ChR2) è un canale ionico selettivo di luce originariamente presente nell'alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 può essere attivato dalla luce blu di una lunghezza d'onda intorno a 450-490 nm, depolarizzando la cellula attraverso l'afflusso di cation. ChR2 è stato descritto ed espresso per la prima volta in Xenopus oocytes da Nagel e colleghi⁴. Poco dopo, Boyden e colleghi⁵ hanno espresso ChR2 nei neuroni mammiferi e hanno dimostrato che potrebbero utilizzare impulsi di luce per controllare in modo affidabile l'abbagliamento su una scala temporale di millisecondi, inducendo potenziali di azione 10 ms dopo l'attivazione di ChR2 con luce blu. I canali optogenetici con cinetica ancora più veloce sono stati trovati di recente (ad esempio, Chronos⁶).

L'approccio di base a un esperimento CRACM è quello di transfetare una popolazione di neuroni pressinaptici putativi con un virus ricombinante adeno-associato (rAAV) che trasporta le informazioni genetiche per una channelrhodopsin. La trasfezione dei neuroni con rAAV porta all'espressione della channelrhodopsin codificata. Tipicamente, la channelrhodopsin è etichettata con una proteina fluorescente come GFP (Green Fluorescent Protein) o tdTomato (una proteina fluorescente rossa), in modo che la trasfezione dei neuroni nella regione bersaglio possa essere facilmente confermata con l'imaging di fluorescenza. Poiché i RAAV sono non patogeni, hanno un basso potenziale infiammatorio e un'espressione genica di lunga durata^7,8, sono diventati una tecnica standard per fornire channelrhodopsins ai neuroni. Se, dopo la trasfezione di una popolazione pressiratica putativa di neuroni, l'attivazione di una channelrhodopsin attraverso lampi di luce suscita potenziali post-sinaptici o correnti nei neuroni bersaglio, questa è la prova di una connessione assonale dal nucleo trascurato alla cellula registrata. Poiché gli assoni recisi negli esperimenti sulle fette cerebrali possono essere spinti a rilasciare il neurotrasmettitore attraverso l'attivazione della channelrhodopsin, i nuclei che si trovano al di fuori della fetta acuta ma inviano assoni nella regione post-sinaptica del cervello possono essere identificati con CRACM. La potenza di questa tecnica è che la connettività e la fisiologia degli input sinaptici a lungo raggio identificati possono essere studiate direttamente.

Oltre alle channelrhodopsins che sono eccitabili dalla luce blu, gli investigatori hanno recentemente identificato diverse channelrhodopsins rosso-shifted^9,10, tra cui Chrimson e la sua più veloce analogico ChrimsonR, entrambi i quali sono eccitati con la luce rossa di 660 nm⁶. Opsins rosso-spostato sono di interesse perché la luce rossa penetra tessuto meglio della luce blu, e la luce rossa può avere una citotossicità inferiore rispetto alla luce blu^10,11,12. Le channelrhodopsins spostate in rosso aprono anche la possibilità di esperimenti CRACM a doppio colore, dove la convergenza di assoni da nuclei diversi sullo stesso neurone può essere testata in un esperimento^6,13,14. Tuttavia, gli attuali opsin rossi spesso presentano un'attivazione incrociata indesiderata con luce blu^15,16,17, rendendo difficili due esperimenti di colore. Inoltre, alcuni rapporti hanno indicato che ChrimsonR subisce un traffico assonale limitato, il che può rendere difficile l'utilizzo di ChrimsonR per esperimenti CRACM^16,17.

Quasi tutte le proiezioni ascendenti dai nuclei del tronco encefalico meno basso convergono nel collicolo inferiore (IC), il centro cerebrale del percorso uditivo centrale. Questo include proiezioni dal nucleo cocleare (CN)^18,19, la maggior parte del complesso di oliva superiore (SOC)²⁰, e i nuclei dorsali (DNLL) e ventrale (VNLL) del lemniscus laterale²¹. Inoltre, una grande proiezione discendente dalla corteccia uditiva termina nei neuroni IC^18,19,20,^21,22e IC stessi si napsi ampiamente all'interno dei lobi locali e contralaterali dell'IC²³. L'intreccio di assoni provenienti da molte fonti ha reso difficile sondare circuiti IC utilizzando la stimolazione elettrica²⁴. Di conseguenza, anche se i neuroni nell'IC eseguono calcoli importanti per la localizzazione del suono e l'identificazione del discorso e di altri suoni di comunicazione^25,26, l'organizzazione dei circuiti neurali nell'IC è in gran parte sconosciuta. Recentemente abbiamo identificato i neuroni VIP come la prima classe di neuroni identificabili molecolarmente nell'IC²⁷. I neuroni VIP sono neuroni stellati glutamatergici che proiettano su diversi obiettivi a lungo raggio, tra cui il talamo uditivo e il collicolo superiore. Ora siamo in grado di determinare le fonti e la funzione degli input locali e a lungo raggio ai neuroni VIP e di determinare come queste connessioni di circuito contribuiscono all'elaborazione del suono.

Il protocollo qui presentato è basato su misura per studiare gli input sinaptici ai neuroni VIP nell'IC dei topi, in particolare dall'IC contralaterale e dal DCN (Figura 1). Il protocollo può essere facilmente adattato a diverse fonti di input, un diverso tipo di neurone o una regione del cervello diversa del tutto. Dimostriamo anche che ChrimsonR è un'efficace channelrhodopsin con spostamento rosso per la mappatura dei circuiti a lungo raggio nel tronco encefalico uditivo. Tuttavia, dimostriamo che ChrimsonR è fortemente attivato dalla luce blu, anche a bassa intensità, e quindi, per combinare ChrimsonR con Chronos in esperimenti CRACM a due colori, è necessario utilizzare controlli accurati per prevenire l'attivazione incrociata di ChrimsonR.

Protocollo

Ottenere l'approvazione del Comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) e attenersi alle linee guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure di questo protocollo sono state approvate dall'Università del Michigan IACUC ed erano conformi alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione Chirurgia

1. Eseguire interventi chirurgici in condizioni asettiche. Autoclave/sterilizzare tutti gli strumenti di chirurgia e materiali prima della chirurgia. Indossare abito chirurgico e maschera per l'intervento chirurgico.
2. Sanificare l'area di chirurgia (spruzzare e pulire con 70% etanolo), e posizionare tende sterili asciugamano per coprire l'area chirurgica.
3. Preparare la gabbia di recupero. Rimuovere la biancheria da letto gabbia per limitare il rischio di asfissia. Mettere un pad di riscaldamento sotto la gabbia. Fornire una fonte di cibo e acqua.
4. Tirare un capillare di vetro per il nanoiniere su un tiratore di pipette. Il calore intenso del filamento riscaldante durante il processo di trazione sterilizzerà il vetro capillare. Tagliare o rompere la punta per ottenere un'apertura di circa 5 m di diametro.
5. Scava la punta capillare con un angolo di circa 30 gradi per migliorare la penetrazione dei tessuti e ridurre l'intasamento. Riempire il capillare con olio minerale e inserirlo in un iniettore di nanolitro.
6. Ottenere un rAAV di codifica channelrhodopsin desiderato e diluire al titer desiderato utilizzando PBS sterile.
   NOTA: Abbiamo scoperto che il sierotipo 1 rAOV funziona bene per la trasfezione dei nuclei del tronco encefalico uditivo. In particolare, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (channelrhodopsin attivato dalla luce blu) e rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (channelrhodopsin, in rosso), disponibili da repository accessibili pubblicamente e da nuclei vettoriali, producendo costantemente gli alti livelli di espressione e un buon traffico assonale a lungo raggio di channelrhodopsins necessari per gli esperimenti CRACM.
7. Seguire le istruzioni per riempire in prima linea il riempimento capillare con 1-3 - L di rAAV in PBS sterile.

2. Chirurgia

1. Mettere l'animale in una camera di induzione e indurre l'anestesia con 3% isoflurane in ossigeno consegnato tramite un vaporizzatore isoflurano calibrato. Osservare il mouse fino a quando la respirazione diventa profonda e lenta e un riflesso pizzico del dito è assente, circa 3-5 min.
2. Trasferire l'animale su un telaio stereotassico. Fissare la testa dell'animale mettendo la bocca su una barra del palato con una maschera di anestesia a gas e posizionando le barre dell'orecchio non perforanti in entrambi i canale uditivi.
3. Inserire una sonda di temperatura rettale e attivare il regolatore di temperatura omeostatico.
4. Applicare unguento oftalmico per evitare che gli occhi si asciughino.
5. Somministrare analgesico preventivo (ad esempio, iniezione sottocutanea di 5 mg/kg di carprofene).
6. Regolare isoflurane a 1-2,5%, in base alla profondità dello stato anestesizzato. Monitorare la temperatura, la respirazione e il colore delle membrane mucose almeno ogni 15 minuti durante la procedura.
7. Rasa cuoio capelluto con clipper elettrici. Preparare apposta il cuoio capelluto con tre tamponi alternati di povidone-iodio e 70% di etanolo.
8. Fare un'incisione nel cuoio capelluto lungo la linea mediana a partire tra le orecchie e continuando rostrale agli occhi, esponendo le suture lambda e bregma. Spingere la pelle di lato e rimuovere il periosteo dall'osso esposto, se necessario.
9. Contrassegnare la sutura lambda con un marcatore chirurgico sterile, posizionare la punta del nanoiniere in modo che tocchi solo l'espressione lambda e azzerare le coordinate del micromanipolatore. Utilizzare la punta del nanoiniere e il micromanipolatore per misurare la differenza di elevazione tra la lambda e le suture di bregma. Regolare l'altezza della barra del palato per portare lambda e bregma entro la differenza di altezza di 100 m.
10. Mappare il sito di iniezione utilizzando la punta del nanoiniere e il sistema di coordinate del micromanipolatore e contrassegnare il sito con un marcatore chirurgico sterile. Per iniettare l'IC o il DCN dei mouse P21-P30, utilizzare le coordinate relative alla sutura lambda, come illustrato nella Tabella 1. Si noti che la profondità di z nelle nostre coordinate viene misurata dalla superficie del cranio in lambda.
11. Utilizzare un trapano micromotore con una bava sterile da 0,5 mm per eseguire una craniotomia sul sito di iniezione.
12. Per garantire un'ampia trasfezione dei neuroni nel nucleo bersaglio, fare iniezioni a varie profondità nel tessuto (Tabella 1, coordinate di z) e, nel caso di regioni cerebrali più grandi come l'IC, fare iniezioni nel corso di due o più penetrazioni in diverse coordinate X e Y (Tabella 1, Destra IC penetrazione 1 e Destra IC penetrazione 2).
13. Eseguire iniezioni. Per le iniezioni di IC, depositare 20 nL di virus in intervalli di 250 m lungo l'asse (profondità di iniezione) compreso tra 2.250 e 1750 m di profondità. Per le iniezioni di DCN, depositare 20 nL di virus ad una profondità di 4.750 e 4.550 m, rispettivamente.
14. Dopo l'iniezione ad ogni coordinata z, attendere 2-3 min prima di spostare l'iniettore alla coordinata successiva. Ciò consentirà al virus di diffondersi lontano dal sito di iniezione, riducendo la probabilità che il virus venga aspirato al tratto di iniezione quando il nanoiniere viene riposizionato.
15. Dopo l'ultima iniezione in una penetrazione, attendere 3-5 min prima di ritrarre nanoiniere dal cervello.
16. Quando il nanoiniere viene rimosso dal cervello tra penetrazioni e tra animali, espellere un piccolo volume di virus dalla punta per verificare che la punta non sia intasata.
17. Dopo le iniezioni, utilizzare PBS sterile per umidare i bordi tagliati del cuoio capelluto e quindi spostare delicatamente la pelle indietro verso la linea mediana. Chiudere la ferita con semplici suture interrotte utilizzando suture di nylon 6-0 (0,7 metriche).
18. Applicare 0,5-1 mL di gel lidocaina 2% alla ferita.
19. Rimuovere le barre dell'orecchio e la sonda di temperatura, spegnere l'isoflurane, rimuovere il mouse dalla barra del palato e trasferirlo nella gabbia di recupero.
20. Monitorare attentamente il ripristino. Una volta che l'animale è completamente sveglio, si muove, e non mostrando segni di dolore o angoscia, trasferirlo di nuovo nella sua gabbia e restituire la gabbia al vivarium.
21. Se gli interventi chirurgici saranno eseguiti su più animali in un giorno, utilizzare uno sterilizzatore di perline caldo per sanificare gli strumenti di chirurgia e trapano burr prima del prossimo intervento chirurgico.

3. Follow-up chirurgico

1. Controlla quotidianamente gli animali per la chiusura delle ferite, l'infezione o i segni di dolore o angoscia nei prossimi 10 giorni, aderendo alle linee guida per la cura degli animali dell'istituzione.
2. Attendere 3-4 settimane prima di utilizzare gli animali negli esperimenti per consentire l'espressione ottimale delle channelrhodopsins.

4. Preparazione della fetta cerebrale e conferma dell'obiettivo di iniezione

1. Per CRACM, utilizzare fette cerebrali preparate acutamente da animali trafitti in esperimenti di elettrofisiologia in vitro standard, descritti qui solo brevemente (vedi Goyer et al. 2019 per una descrizione più dettagliata²⁷).
2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente (in mM): 125 NaCl, 12.5 D-glucose, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 1.25 NaH₂PO₄, 1.5 CaCl₂, 1 MgSO₄. Bolla ACSF a un pH di 7,4 con 5% CO₂ nel 95% O₂.
3. Eseguire tutti i passaggi seguenti, compresa l'elettrofisiologia in vitro, in prossimità dell'oscurità o nella luce rossa per limitare l'attivazione delle channelrhodopsins.
4. Anatema profondamente il topo con l'isoflurane e decapitarlo rapidamente. Dissezionare il cervello rapidamente in ACSF 34 dollari centigradi.
5. Tagliare le fette coronali (200-250 m) contenenti l'IC in ACSF da 34 gradi con un microtoma vibrante e incubare le fette a 34 gradi centigradi per 30 min in una camera di contenimento riempita con ACSF bollata con 5% CO₂ nel 95% O₂. Dopo l'incubazione, conservare le fette a temperatura ambiente fino a quando non vengono utilizzate per le registrazioni.
6. Se l'obiettivo di iniezione non era l'IC, tagliare ulteriori fette coronali della regione del cervello iniettata e controllare la trasfezione del nucleo bersaglio al microscopio a fluorescenza. Se non c'è trasfezione nel nucleo bersaglio o trasfezione aggiuntiva in diverse regioni del cervello, non continuare con l'esperimento.

5. Registrazione in vitro ed esperimento CRACM

NOTA: Per fornire la stimolazione ottica di Chronos e ChrimsonR, utilizziamo i LED accoppiati al porto di epiorescenza del microscopio. Tuttavia, i laser possono essere utilizzati al posto dei LED. Se si utilizzano laser, ottenere l'approvazione preventiva da funzionari della sicurezza istituzionale e seguire le linee guida appropriate per l'uso sicuro del laser.

1. Tirare gli elettrodi dal vetro borosilicate a una resistenza di 3,5-4,5 M. La soluzione interna dell'elettrodo deve contenere (in mM): 115 K-gluconato, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ fosforocreatine, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, integrati con 0,1% biocytin (w/v), pH regolato a 7,3 con KOH e osmolalità a 290 mOsm/kg con saccarosio.
2. Per effettuare registrazioni, utilizzare i metodi standard di blocco patch. Posizionare la fetta in una camera di registrazione al microscopio verticale a stadio fisso e perfuso continuamente con ACSF a 2 mL/min. Condurre registrazioni in prossimità di temperatura fisiologica ( 34-36 gradi centigradi).
3. I neuroni patch sotto controllo visivo utilizzando un amplificatore di morsetto adatto. Corretto per la resistenza alla serie, la capacità pipetta e il potenziale di giunzione liquida.
4. Durante le registrazioni di intere cellule, attivare Chronos fornendo brevi impulsi (1-5 ms) di 470 nm luce o ChrimsonR da brevi impulsi di 580 nm luce attraverso LED disponibili in commercio. Determinare la soglia di attivazione dell'opsina e utilizzare un protocollo di stimolazione minimo per suscitare potenziali post-sinaptici. In generale, utilizzare la durata dello stimolo più breve che suscita un PsSP e impostare la potenza ottica al 120% della potenza soglia necessaria per suscitare PSP.
5. Per confermare che i cambiamenti registrati nel potenziale della membrana sono infatti input sinaptici al neurone, gli antagonisti standard per i recettori post-naptici eccitatori/inibitori possono essere lavati durante l'esperimento. Per studiare diversi contributi del recettore a un PSP (ad esempio recettori NMDA vs AMPA), gli antagonisti recettori adatti possono essere lavati. Per ogni antagonista recettore, effetti farmacologici dovrebbero invertire dopo il washout.
6. Utilizzare la latenza, il jitter e l'affidabilità dei PSP per verificare che gli input sinaptici attivati dalla luce provengano dall'attivazione diretta e ottica delle sinapsi sul neurone registrato, in contrapposizione all'attivazione di sinapsi che esprimono la channelrhodopsin su un'operazione che interviene neurone che si sinapsi sul neurone registrato. In generale, bassa latenza (<2 ms), basso jitter (<1 ms deviazione standard nella latenza) e alta affidabilità (>50%) indicano una connessione sinaptica diretta dalla channelrhodopsin che esprime il neurone pressinaptico al neurone registrato.

Risultati

Abbiamo attraversato topi VIP-IRES-Cre(Vip^{tm1 (cre) -Jh}/J) e topi Cre-reporter Ai14 (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J) per generare la prole F1 in cui i neuroni VIP esprimono la proteina fluorescente tdTomato. È stata usata la prole F1 di entrambi i sessi, il giorno postnatale (P) da 21 a P70. In questo studio sono stati utilizzati in totale 22 animali.

Iniezione stereotassica ...

Discussione

Abbiamo scoperto che CRACM è una tecnica potente per identificare e caratterizzare gli input sinaptici a lungo raggio ai neuroni nel mouse IC. Seguendo il protocollo qui descritto, abbiamo ottenuto una robusta trasfezione dei neuroni nella DCN e nell'IC, nonché un affidabile traffico assonale di Chronos e ChrimsonR nei terminali sinaptici nell'IC. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa tecnica consente la misurazione e l'analisi di eventi post-sinaptici, tra cui ampiezza PSP, mezza larghezza, tempo di decadimento e far...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH	Addgene	59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Addgene	59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson Laboratory	stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-B4
Carproject (carprofen)	Henry Schein Animal Health	59149
Drummond glas capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3	Drummond Scientific Company	3-300-207
Electrode beveler	Sutter Instrument	FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures	Ethicon	local pharmacy
Fixed stage microscope	any	n/a
Gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments	933-B
General surgery tools	Fine Science Tools	N/A
Golden A5 pet clipper	Oster	078005-010-003
Heating pad	Custom build	N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system	Patterson Scientific	78917760
Hot bead sterilizer Steri 250	Inotech	IS-250
Iodine solution 10%	MedChoice	local pharmacy
Isoflurane vaporizer	Patterson Scientific	07-8703592
Lidocain topical jelly 2%	Akorn	local pharmacy
Micro motor drill 1050	Henry Schein Animal Health	7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm	Fine Science Tools	19007-05
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears	Akorn	local pharmacy
P-1000 electrode puller	Sutter Instrument	P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software	any	n/a
Portable anethesia machine	Patterson Scientific	07-8914724
Small animal steroetaxic frame	David Kopf Instruments	930-B
Standard chemicals	local vendors	N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical marker	Fine Science Tools	18000-30
Temperature controller	Custom build	N/A
Vibratome	any	n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)	Jackson Laboratory	stock #010908
Water bath	any	n/a