Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins

Резюме

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) является точным методом для функционального картирования проекций нейронов дальнего радиуса действия между анатомически и/или генетически идентифицированными группами нейронов. Здесь мы описываем, как использовать CRACM для картирования слуховых соединений ствола мозга, включая использование красного сдвига опсина, ChrimsonR.

Аннотация

При исследовании нейронных цепей, стандартное ограничение подхода зажима зажима in vitro что аксоны от множественных источников часто смешаны, делая его трудным изолировать входы от индивидуальных источников с электрической стимуляцией. Однако, с помощью каналаrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM), это ограничение теперь может быть преодолено. Здесь мы сообщаем о методе использования CRACM для картирования восходящих входов от нижних слуховых ядер ствола мозга и коммистуральных входов к идентифицированному классу нейронов в нижнем колликуле (IC), ядре среднего мозга слуховой системы. В IC, местные, комиссионерские, восходящие и нисходящие аксоны сильно переплетены и поэтому неотличимы с электрической стимуляцией. Путем впрыскивания вирусной конструкции для того чтобы управлять выражением channelrhodopsin в presynaptic ядре, последовано заработка зажима зажима для того чтобы охарактеризовать присутсвие и физиологию channelrhodopsin-выражая синаптические входы, прогнозы от специфического источника к определенной популяции нейронов IC можно отображать с точностью типа клетки. Мы показываем, что этот подход работает как с Chronos, синий свет активированный каналrhodopsin, и ChrimsonR, красный сдвиг channelrhodopsin. В отличие от предыдущих докладов с передних мозгов, мы находим, что ChrimsonR надежно проданы вниз аксоны дорсального кохлеарного ядра основных нейронов, указывая, что ChrimsonR может быть полезным инструментом для экспериментов CRACM в стволе мозга. Представленный здесь протокол включает в себя подробные описания хирургии инъекций внутричерепного вируса, включая стереотаксические координаты для таргетинга инъекций в рстное кохлеарное ядро и IC мышей, а также как комбинировать запись зажима цельного клеточного зажима с активацией channelrhodopsin для исследования дальних проекций на IC нейронов. Хотя этот протокол адаптирован для характеристики слуховых входов в IC, он может быть легко адаптирован для изучения других долгосрочных прогнозов в слуховом стволе мозга и за его пределами.

Введение

Синаптические связи имеют решающее значение для нейронной цепи функции, но точная топология и физиология синапсов в нейронных цепей часто трудно зондировать экспериментально. Это потому, что электрическая стимуляция, традиционный инструмент клеточной электрофизиологии, без разбора активирует аксоны вблизи места стимуляции, и в большинстве областей мозга, аксоны из различных источников (местные, восходящие, и / или нисходящие) переплетаются. Однако, с помощью channelrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM)^1,2, это ограничение теперь можно преодолеть³. Channelrhodopsin (ChR2) является свет активирован, катиционно-селективный ионный канал, первоначально найденный в зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 может быть активирован синим светом длины волны около 450-490 нм, деполяризовать клетку через приток катиона. ChR2 был впервые описан и выражен в ооцитах Xenopus Нагелем и коллегами⁴. Вскоре после этого, Бойден и его коллеги⁵ выразили ChR2 в нейронах млекопитающих и показали, что они могут использовать световые импульсы, чтобы надежно контролировать пики на миллисекундный тайм-масштаб, вызывая потенциалдействия 10 мс после активации ChR2 с синим светом. Оптогенетические каналы с еще более быстрой кинетикой были найдены в последнее время (например, Chronos⁶).

Основной подход к эксперименту CRACM заключается в том, чтобы трансфектировать популяцию пресинаптических нейронов с рекомбинантным адено-ассоциированным вирусом (RAAV), который несет генетическую информацию для канала. Трансфекция нейронов с РААВ приводит к выражению закодированного каналародопсин. Как правило, channelrhodopsin помечены флуоресцентным белком, как GFP (Зеленый флуоресцентный белок) или tdTomato (красный флуоресцентный белок), так что трансфекция нейронов в целевой области может быть легко подтверждена с флуоресценции изображений. Поскольку RAAVs не патогенные, имеют низкий воспалительный потенциал и длительное выражение^гена7,8, они стали стандартной техникой для доставки channelrhodopsins к нейронам. Если после трансфекции пресинаптической популяции нейронов активация канала через вспышки света вызывает постсинаптические потенциалы или токи в целевых нейронах, это свидетельствует о аксональной связи от трансинфицированного ядра к записанной клетке. Потому что разорванные аксоны в экспериментах ломтик мозга могут быть обусловлены выпустить нейромедиатор через активации channelrhodopsin, ядра, которые лежат за пределами острого ломтика, но отправить аксоны в постсинаптической области мозга могут быть определены с CRACM. Сила этого метода заключается в том, что связь и физиология выявленных синаптических входов дальнего радиуса действия могут быть непосредственно исследованы.

В дополнение к channelrhodopsins, которые возбудимы синим светом, следователи недавно определили несколько красных сдвига channelrhodopsins^9,10, в том числе Chrimson и его быстрее аналог ChrimsonR, оба из которых возбуждены с красным светом 6^. Красный сдвиг opsins представляют интерес, потому что красный свет проникает ткани лучше, чем синий свет, и красный свет может иметь более низкую цитотоксичность, чем синий свет^10,11,12. Красно-сдвигаемые каналродопсины также открывают возможность двухцветных экспериментов CRACM, где сближение аксонов из разных ядер на одном и том же нейроне может быть проверено в одном эксперименте^6,13,14. Тем не менее, текущие красно-сдвигаемые опсины часто демонстрируют нежелательные перекрестные активации с синим светом^15,16,17, что затрудняет два цветных эксперимента. Кроме того, некоторые сообщения показали, что ChrimsonR подвергается ограниченной аксональной торговли, что может сделать его сложным использовать ChrimsonR для экспериментов CRACM^16,17.

Почти все восходящие проекции из нижних слуховых ядер ствола сходятся в нижнем колликуле (IC), центре среднего мозга центрального слухового пути. Это включает в себя прогнозы из кохлеарного ядра (CN)^18,19, большинство из превосходного оливари комплекса (SOC)²⁰, и дорсальный (DNLL) и вентрал (VNLL) ядра бокового лемниска²¹. Кроме того, большая нисходящая проекция от слуховой коры заканчивается в IC^{18,19,20,21,22,}и IC нейроны сами синапсы широко в пределах местных и контралатеральных долей IC²³. Смешение аксонов из многих источников затрудняет зондирование IC схем с помощью электрической стимуляции^24. В результате, даже несмотря на то, что нейроны в IC выполняют вычисления, важные для локализации звука и идентификации речевых и других коммуникационных звуков^25,26,организация нейронных цепей в ИК в значительной степени неизвестна. Недавно мы определили VIP нейронов в качестве первого молекулярно идентифицируемого класса нейронов в IC²⁷. VIP нейроны являются глутаматергических нейронов стеллата, которые проектируют на несколько дальних целей, в том числе слуховой таламус и превосходный колликул. Теперь мы можем определить источники и функции локальных и дальних входов в VIP-нейроны и определить, как эти соединения цепи способствуют обработке звука.

Протокол, представленный здесь, с учетом расследования синаптических входов в VIP-нейронов в IC мышей, в частности, от контралатерального IC и DCN (Рисунок 1). Протокол может быть легко адаптирован к различным источникам ввода, другой тип нейронов или другой области мозга в целом. Мы также показываем, что ChrimsonR является эффективным красным сдвигом channelrhodopsin для дальнего диапазона отображения в слуховом стволе мозга. Тем не менее, мы демонстрируем, что ChrimsonR сильно активируется синим светом, даже при низкой интенсивности, и, таким образом, чтобы объединить ChrimsonR с Chronos в двухцветных экспериментах CRACM, тщательный контроль должен быть использован для предотвращения перекрестной активации ChrimsonR.

протокол

Получить одобрение от местного Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и придерживаться руководящих принципов NIH для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры в этом протоколе были одобрены IACUC Мичиганского университета и были в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Хирургические препараты

1. Выполняйте операции в асептических условиях. Автоклав/стерилизовать все хирургические инструменты и материалы перед операцией. Носите хирургическое платье и маску для операции.
2. Обезвитрить область хирургии (распылить и протрите вниз с 70% этанола), и место стерильные шторы полотенце для покрытия области хирургии.
3. Подготовьте клетку восстановления. Удалите постельные принадлежности клетки, чтобы ограничить риск удушья. Положите грелку под клетку. Обеспечить источник пищи и воды.
4. Потяните стеклянный капилляр для наноинжектора на выдвижной пипетке. Интенсивная жара нагревающей нити во время процесса вытягивания будет стерилизовать стеклянный капилляр. Отрежьте или оторвите кончик, чтобы получить отверстие примерно 5 мкм в диаметре.
5. Освоить капиллярный наконечник примерно на 30 градусов, чтобы улучшить проникновение тканей и уменьшить засорение. Заполните капилляр минеральным маслом и вставьте в нанолитровый инжектор.
6. Получить аликвот желаемого каналаrhodopsin-кодирования РААВ и разбавить до желаемого титра с помощью стерильных PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что серотип 1 rAAVs хорошо работать для трансфекции слуховых ядер ствола мозга. В частности, rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (синий свет активированный каналродопсин) и rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (красно-сдвинчатый каналродопсин), которые доступны из общедоступных репозиториев и ядер, последовательно дают высокие уровни экспрессии и хорошей дальней аксональной торговли channelrhodopsins, необходимых для экспериментов CRACM.
7. Следуйте инжекторам инструкции перед заполнением капилляра с 1-3 Л RAAV в стерильных PBS.

2. Хирургия

1. Положите животное в индукционную камеру и вызвать анестезию с 3% изофлуран в кислороде, поставляемом через калиброванный испаритель изофлуран. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока дыхание не станет глубоким и медленным и не будет рефлекса, около 3-5 мин.
2. Перенесите животное в стереотаксию. Защищайте голову животного, положив рот на бар с неба с газовой анестезией маски и позиционирование неперфорирующих ушных прутьев в обоих ушных каналов.
3. Вставьте ректальный зонд температуры и включите гомеостатический контроллер температуры.
4. Нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз.
5. Администрирование упреждающего анальгетика (например, подкожная инъекция 5 мг/кг карпрофена).
6. Отрегулируйте изолюран до 1-2,5%, в зависимости от глубины анестезируемого состояния. Мониторинг температуры, дыхания и цвета слизистых оболочек не реже чем каждые 15 минут во время процедуры.
7. Бритье кожи головы с электрическими клиперами. Асептически подготовить кожу головы с тремя чередующимися мазками повидон-йода и 70% этанола.
8. Сделайте разрез в коже головы вдоль средней линии, начиная между ушами и продолжая рострал к глазам, подвергая лямбда и bregma швы. Нажмите кожу в сторону и удалить периостеум из открытых костей, если это необходимо.
9. Отметьте шов лямбда стерильным хирургическим маркером, поместите кончик наноинжектора так, чтобы он просто касался лямбды, и обнуляет координаты микроманипулятора. Используйте наконечник наноинжектора и микроманипулятор для измерения разницы в высоте между швами лямбда и брегма. Отрегулируйте высоту бар неба, чтобы принести lambda и bregma в пределах 100 мкм разница в высоте.
10. Карта места инъекции с помощью наконечника наноинжектор и микроманипулятор координации системы и пометить сайт с стерильным хирургическим маркером. Для введения IC или DCN из P21-P30 мышей, использовать координаты относительно шва лямбда, как показано в таблице 1. Обратите внимание, что глубина в наших координатах измеряется с поверхности черепа на лямбде.
11. Используйте микромоторную дрель со стерильной буровой заусенкой 0,5 мм для выполнения краниотомии над местом инъекции.
12. Для обеспечения широкого трансфекции нейронов в ядре мишени, сделать инъекции на различных глубинах в ткани(Таблица 1, координаты), а в случае больших областей мозга, как IC, сделать инъекции в течение двух или более проникновений в различных X и Y координаты(Таблица 1, Право IC проникновения 1 и право IC проникновения 2).
13. Выполняйте инъекции. Для инъекций IC, депозит 20 нл вируса в интервалах 250 мкм вдоль оси (глубина инъекций) между 2250 мкм и 1750 мкм глубины. Для инъекций DCN, депозит 20 нл вируса на глубине 4750 мкм и 4,550 мкм, соответственно.
14. После впрыска в каждой координате, подождите 2-3 минуты, прежде чем перейти инжектор к следующему координату. Это позволит вирусу рассеяться вдали от места инъекции, уменьшая вероятность того, что вирус будет всасываться в инъекционный тракт, когда наноинжектор будет перемещен.
15. После последней инъекции в проникновении, подождите 3-5 минут, прежде чем вытягивать наноинжектор из мозга.
16. Когда наноинжектор удаляется из мозга между проникновением и между животными, выбрасывайте небольшой объем вируса из кончика, чтобы проверить, что кончик не засорен.
17. После инъекций используйте стерильные PBS, чтобы промокнуть края головы, а затем осторожно переместить кожу обратно к средней линии. Закройте рану простыми прерванными швами, используя 6-0 (0,7 метрических) нейлоновые швы.
18. Нанесите 0,5-1 мл 2% лидокаина гель на рану.
19. Удалить ушные прутья и температурный зонд, выключить изолюран, удалить мышь из бара неба и перенести его в клетку восстановления.
20. Внимательно следите за восстановлением. Как только животное полностью проснется, перемещаясь и не показывая никаких признаков боли или бедствия, перенесите его обратно в клетку и верните клетку в вивариум.
21. Если операции будут выполнены на нескольких животных в один день, использовать горячий стерилизатор бисера для дезинфекции инструментов хирургии и буровой заусенцы до следующей операции.

3. Хирургическое наблюдение

1. Проверяйте животных ежедневно на наличие замыкания ран, инфекции или признаков боли или бедствия в течение следующих 10 дней, придерживаясь руководящих принципов по уходу за животными в учреждении.
2. Подождите 3-4 недели, прежде чем использовать животных в экспериментах, чтобы обеспечить оптимальное выражение каналодопсинов.

4. Подготовка ломтика мозга и подтверждение цели инъекций

1. Для CRACM используйте остро подготовленные кусочки мозга от трансинфицированных животных в стандартных экспериментах по электрофизиологии in vitro, описанных здесь лишь кратко (см. Гойер и др. 2019 для более подробного описания²⁷).
2. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), содержащей (в ММ): 125 NaCl, 12,5 D-глюкозы, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 1,25₂PO₄, 1.5 CaCl₂, 1 MgSO₄. Пузырь ACSF до рН 7,4 с 5% CO₂ в 95% O₂.
3. Выполните все следующие шаги, в том числе в пробирке электрофизиологии, в ближней темноте или красный свет, чтобы ограничить активацию channelrhodopsins.
4. Глубоко обезвитрить мышь с изофлуран и обезглавить его быстро. Вскрыть мозг быстро в 34 градусов по Цельсию ACSF.
5. Вырезать корональные ломтики (200-250 мкм), содержащий IC в 34 c ACSF с вибрирующим микротомом и инкубировать ломтики при 34 градусов по Цельсию в течение 30 минут в камере проведения заполнены acSF пузырились с 5% CO₂ в 95% O₂. После инкубации храните ломтики при комнатной температуре до использования для записи.
6. Если целью инъекции не был IC, вырежьте дополнительные корональные ломтики впрыскиваемых областей мозга и проверьте трансфекцию ядра мишени под флуоресцентным микроскопом. Если нет трансфекции в ядре мишени или дополнительного трансфекции в различных областях мозга, не продолжайте эксперимент.

5. В пробирке Запись и CRACM Эксперимент

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения оптической стимуляции Chronos и ChrimsonR, мы используем светодиоды в сочетании с эпифлюоресценции порт микроскопа. Тем не менее, лазеры могут быть использованы вместо светодиодов. При использовании лазеров, получить предварительное одобрение от институциональных должностных лиц безопасности и следовать соответствующим руководящим принципам для безопасного использования лазера.

1. Вытяните электроды из боросиликатного стекла до сопротивления 3,5-4,5 МЗ. Электродное внутреннее решение должно содержать (в ММ): 115 K-глюконат, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ фосфокреатин, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, дополненный 0.1% биоцитином (w/v), рН скорректированный до 7.3 с KOH и osmolality до 290 mOsm/kg с сахарозой.
2. Для записи используйте стандартные методы зажима патча. Поместите срез в камеру звукозаписи под фиксированным сценическим вертикальном микроскопом и непрерывно нанизать с ACSF на 2 мл/ мин. Проведение записей вблизи физиологической температуры (34-36 градусов по Цельсию).
3. Патч нейронов под визуальным контролем с помощью подходящего усилителя патч зажим. Правильно для устойчивости серии, емки пипетки и потенциала жидкого соединения.
4. Во время целых записей ячейки активируйте Chronos, доставляя краткие импульсы (1-5 мс) 470 нм света или ChrimsonR с помощью кратких импульсов 580 нм света через коммерчески доступные светодиоды. Определите порог активации опсина и используйте минимальный протокол стимуляции для выяснения постсинаптических потенциалов. В целом, используйте кратчайшую продолжительность стимула, который вызывает PSP, и установить оптическую мощность до 120% от пороговой мощности, необходимой для получения PSPs.
5. Чтобы подтвердить, что зарегистрированные изменения в мембранном потенциале действительно синаптические входы в нейрон, стандартные антагонисты для возбуждающие / ингибиторные постсинаптические рецепторы могут быть вымыты в ходе эксперимента. Для исследования различных рецепторов вклад ас-ПСП (например, NMDA против рецепторов АМРА), подходящие антагонисты рецепторов могут быть промывают дюйма Для каждого антагониста рецепторов, эффекты препарата должны обратить вспять после вымывания.
6. Используйте задержку, дрожь и надежность PSPs, чтобы подтвердить, что свет активированный синаптических входов происходят от прямой, оптической активации синапсов на записанном нейроне, в отличие от активации каналродопсин-выражения синапсов на промежуточных нейрон, который синапсирует на записанном нейроне. В целом, низкая задержка (злот;2 мс), низкая испуг (зlt;1 мс стандартное отклонение в задержке) и высокая надежность (0,50%) указать прямую синаптической связи от каналаrhodopsin выражения пресинаптический нейрон в записанный нейрон.

Результаты

Мы пересекли VIP-IRES-Cre мышей(Vip^{tm1 (cre) JH}/J) и Ai14 Cre-репортер мышей (B6. Cg-Gt (ROSA)26Sor^{tm14 (CAG-tdTomato)Hze}/J) для генерации потомства F1, в котором VIP нейроны выражают флуоресцентный белок tdTomato. F1 потомство обоих полов были использованы, в возрасте послеродового дня (P) 21 до ...

Обсуждение

Мы обнаружили, что CRACM является мощным методом для выявления и характеристики синаптических входов дальнего радиуса действия в нейроны мыши IC. Следуя описанному здесь протоколу, мы добились надежной трансфекции нейронов в DCN и IC, а также надежной аксональной торговли Chronos и ChrimsonR синапт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH	Addgene	59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH	Addgene	59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson Laboratory	stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED	Luxeon Star LEDs	SP-01-B4
Carproject (carprofen)	Henry Schein Animal Health	59149
Drummond glas capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3	Drummond Scientific Company	3-300-207
Electrode beveler	Sutter Instrument	FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures	Ethicon	local pharmacy
Fixed stage microscope	any	n/a
Gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments	933-B
General surgery tools	Fine Science Tools	N/A
Golden A5 pet clipper	Oster	078005-010-003
Heating pad	Custom build	N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system	Patterson Scientific	78917760
Hot bead sterilizer Steri 250	Inotech	IS-250
Iodine solution 10%	MedChoice	local pharmacy
Isoflurane vaporizer	Patterson Scientific	07-8703592
Lidocain topical jelly 2%	Akorn	local pharmacy
Micro motor drill 1050	Henry Schein Animal Health	7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm	Fine Science Tools	19007-05
Motorized Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears	Akorn	local pharmacy
P-1000 electrode puller	Sutter Instrument	P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software	any	n/a
Portable anethesia machine	Patterson Scientific	07-8914724
Small animal steroetaxic frame	David Kopf Instruments	930-B
Standard chemicals	local vendors	N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical marker	Fine Science Tools	18000-30
Temperature controller	Custom build	N/A
Vibratome	any	n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J)	Jackson Laboratory	stock #010908
Water bath	any	n/a