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  • Discusión
  • Divulgaciones
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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.

Resumen

Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H+- y O2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.

Introducción

La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células1,2,3,4,5.

Los espermatozoides son células móviles altamente especializadas; cuya tarea es entregar el genoma paterno al ovocitos. Los espermatozoides que salen del tracto reproductivo masculino después de la eyaculación siguen siendo funcionalmente inmaduros y no pueden fertilizar el ovocitos porque son incapaces de penetrar las vestiduras de los ovocitos. Los espermatozoides adquieren competencia de fertilización a medida que transitan por el tracto reproductivo femenino en un proceso de maduración conocido como capacitación6,7. Los espermatozoides o espermatozoides recién eyaculados diseccionados del epidídimo cauda pueden ser capacitados in vitro por incubación en medios de capacitación definidos que contengan Ca2+,bicarbonato (HCO3-) o un análogo de campo permeable a las células (por ejemplo, dibutiryl-cAMP), un aceptador de colesterol (por ejemplo, albúmina de suero de la bolina bovina, BSA) y una fuente de energía (por ejemplo, glucosa). Durante la capacitación, los espermatozoides modifican su patrón de motilidad en un latido flagelante asimétrico, representando un modo de natación llamado hiperactivación8,9, y se vuelven competentes para someterse a la reacción acrosomesa7, donde se liberan enzimas proteolíticas que digieren las vestiduras de los ovocitos. Estos procesos requieren energía, y similar a las células somáticas, espermatozoides generan ATP y otros compuestos de alta energía a través de la glucólisis, así como ciclo de TCA mitocondrial y fosforilación oxidativa (oxfos)10. Mientras que múltiples estudios demuestran que la glucólisis es necesaria y suficiente para apoyar la capacitación de espermatozoides11,12,13,14, la contribución de la oxfos es menos clara. A diferencia de otros tipos de células donde la glucólisis está físicamente acoplada al ciclo TCA, los espermatozoides están altamente compartimentados y se cree que mantienen estos procesos en compartimentos flagelantes separados: la pieza media concentra la maquinaria mitocondrial, mientras que las enzimas clave de la glucólisis parecen limitarse a la pieza principal15,16. Esta compartimentación da lugar a un debate en curso sobre si el piruvato producido en la pieza principal por glicólisis puede soportar oxfos mitocondriales en la pieza media, y si la ATP producida por los buperos en la pieza media sería capaz de difundirse lo suficientemente rápidamente a lo largo de la longitud del flagelo para apoyar los requisitos energéticos en partes distales de la pieza principal17,18,19. También hay apoyo de un papel para el oxfos en la capacitación de espermatozoides. El oxfos no sólo es más favorable energéticamente que la glucólisis, generando 16 veces más ATP que la glucólisis, sino que el volumen de la pieza media y el contenido mitocondrial están directamente relacionados con la aptitud reproductiva en las especies de mamíferos que presentan mayores grados de competencia entre los machos por las parejas20. Abordar estas preguntas requiere métodos para examinar las contribuciones relativas de la glucólisis y el oxfos durante la capacitación de los espermatozoides.

Tourmente et al. aplicaron un analizador de flujo extracelular de 24 polos para comparar el metabolismo energético de especies de ratones estrechamente relacionadas con parámetros de rendimiento de espermatozoides significativamente diferentes21. En lugar de reportar los valores basales de ECAR y OCR de espermatozoides no capacitados, aquí, adaptamos su método usando un analizador de flujo extracelular de 96 polos para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides de ratón en tiempo real. Desarrollamos un método que permite monitorear simultáneamente la glucólisis y el oxfos en tiempo real en esperma con la batida flagelos en hasta doce condiciones experimentales diferentes midiendo el flujo de oxígeno (O2)y protones (H+) (Figura 1A). Debido a la descomposición del piruvato para lactato durante la glucólisis y la producción de CO2 a través del ciclo TCA, los espermatozoides no capacitados y capacitados extruyen H+ en los medios de ensayo que son detectados por el analizador de flujo extracelular a través de fluoróforos sensibles A+-inmovilizados a la punta de la sonda de un cartucho de sensor. Paralelamente, el consumo de O2 por fosforilación oxidativa se detecta a través de fluoróforos sensibles a O2inmovilizados a la misma punta de sonda(Figura 1B). La detección efectiva del H+ liberado y o2 consumido requiere un búfer de espermatozoides modificado con baja capacidad de amortiguación sin bicarbonato o fenol rojo. Por lo tanto, para inducir la capacitación en ausencia de bicarbonato, adoptamos el uso de un campo analógico permeable a la célula inyectado junto con el inhibidor de PDE de amplio rango IBMX22. Tres puertos de inyección independientes adicionales permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores, lo que facilita la detección en tiempo real de los cambios en la respiración celular y la tasa de glucólisis debido a la manipulación experimental.

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Protocolo

Los espermatozoides se recogen de ratones machos CD-1 de 8-16 semanas de edad. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de Weill Cornell Medicine.

1. Día antes del ensayo

  1. Preparación del cartucho del sensor y calibrador del analizador de flujo extracelular
    1. Para hidratar el cartucho del sensor, retire el cartucho del sensor del kit de ensayo de flujo extracelular XFe96 y coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.
    2. Llene un depósito de solución con 25 ml de Doble Destilado H2O utilizando una pipeta multicanal, agregue 200 ml de H2O a cada pocal de la placa de servicio. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicios públicos e incubar durante la noche en una incubadora de 37 oC que no seaCO2.
      NOTA: El cartucho debe hidratarse durante al menos 4 horas.
    3. Aliquot 25 ml del calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 ml e incubarlo durante la noche en una incubadora no CO2 de 37oC.
  2. Preparación de microplacas recubiertas con ConA
    1. Disolver 2,5 mg de ConA en 5 ml de Doble destilado H2O para preparar un stock de 0,5 mg/ml (p/v).
    2. Con una pipeta multicanal, llene cada pocal de una placa de 96 polos de flujo extracelular con 50 ml de la solución de 0,5 mg/ml con A. Deje la tapa abierta y deje que la placa se seque durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: Se pueden recubrir varias placas de inmediato y almacenarse a 4 oC durante un máximo de cuatro semanas hasta que estén listas para su uso.
  3. Preparación del tampón de esperma
    1. Preparar 250 mL de analizador de flujo extracelular TYH tampón con HEPES bajos que contienen 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM de glucosa y 1 mM HEPES. Caliente el tampón a 37 oC y ajuste el pH a 7,4.

2. Día del ensayo

  1. Preparación para la calibración del cartucho
    1. Sustituya el H2O en la placa de servicios públicos por 200 ml de calibrador XF por pozo e incubar durante al menos 1 h en una incubadora no CO2 37 oC.
      NOTA: En lugar de calibrador, PBS filtrado estérilmente, pH 7.4 se puede utilizar.
    2. Calentar 50 mL de tampón TYH a 37oC.
  2. Generación de una plantilla de onda para el analizador de flujo extracelular
    1. Encienda el analizador de flujo extracelular y permita que la temperatura se estabilice a 37 oC.
    2. Abra el software de oleada y diseñe una nueva plantilla abriendo una plantilla en blanco (consulte Archivo suplementario 1, plantilla de oleada).
    3. Abra la pestaña Definiciones de grupo. Definir medios de ensayo como TYH; pH 7.4 y el tipo de célula como espermatozoides de ratón, deje las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco. Crear grupos diferentes para cada condición de ensayo; en este ejemplo, hay 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) y 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) para inducir la capacitación, 2-desoxiglucosa (2-DG) como inhibidor de la glucólisis, antimicina A (antA) y rotenona (rotena) como inhibidor del complejo III y complejo I de la cadena de transporte de electrones.
      NOTA: Para tener en cuenta la variabilidad entre los pozos, se deben medir paralelamente al menos 7-8 pozos por condición.
    4. Abra la pestaña Mapa de placas y defina el mapa de placas asignando grupos a pozos específicos.
      NOTA: Los cuatro pozos de esquina (A1, A12, H1, H12) se llenarán con tampón TYH (sin espermatozoides) y más tarde se utilizarán para la resta de fondo.
    5. Abra la pestaña Protocolo, agregue 4 ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición(Figura 2, Tabla 1). Resalte la medida después de la inyección y no resalte el equilibrio.
    6. Guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y defina la ubicación de guardado para el archivo de resultados.
  3. Preparación de compuestos para cargar en el cartucho del sensor
    1. Preparar 2 mL de 50 mM db-cAMP disolviendo 9,8 mg de compuesto en el búfer TYH y añadir IBMX a una concentración final de 5 mM.
      NOTA: IBMX tiene la tendencia a precipitarse después de ser diluido en el búfer TYH. Los precipitados se pueden disolver vórtice e incubando la solución TYH/db-cAMP/IBMX en un bloque de calor de 37 oC durante 5 min.
    2. Preparar 1 mL de 500 mM 2-DG disolviendo 82,1 mg de compuesto en tampón TYH.
    3. Preparar 1 mL de 5 m de AntA/Rot diluyendo ambos fármacos en el tampón TYH.
      NOTA: Los compuestos se diluyen 10 veces por inyección en el cartucho analizador de flujo extracelular; por lo tanto, asegúrese de que las soluciones de inyección están 10 veces más concentradas.
  4. Aislamiento de espermatozoides de ratón
    1. Anestesiar 3 ratones machos entre 8 y 16 semanas por isoflurano y sacrificar a los ratones por luxación cervical después de que no se detectó respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo. Retire las epididimides cauda y la deferentia vasa.
    2. Coloque cada cauda en 500 l de tampón TYH precalentado en un pozo de placa de 24 pocillos, inmovilice el cauda en la parte inferior de la placa usando un par de fórceps y abra el tejido haciendo 5-7 pequeñas incisiones con tijeras de plumas.
    3. Transfiera la placa inmediatamente a una incubadora no CO2 37 oC y deje que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.
  5. Carga del cartucho del sensor
    1. El kit Extracellular Flux proporciona dos guías de carga de puertos para los puertos A y D y los puertos B y C. Para cargar un puerto específico, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Durante la inyección, utilice las yemas de los dedos de la mano no inyectable para mantener la guía de carga del puerto en su lugar e inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto.
    2. Puerto A: Con una pipeta multicanal, inyecte 20 l del búfer TYH en cada columna.
    3. Puerto B: Inyectar 22 sL de tampón TYH en la columna 1-4, inyectar 22 ml de 500 mM 2-DG en la columna 5-8, y 25 l de 5 m anta/Rot en la columna 9-12.
    4. Puerto C: Inyecte 25 sL de búfer TYH en cada columna con números impares, inyecte 25 sL de 10 mM db-cAMP/ 500 m IBMX en cada columna con números pares.
    5. Coloque el cartucho del sensor con la placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tarda de 10 a 15 minutos.
  6. Preparación de placas de esperma
    1. Disolver 45 mg de BSA en 15 ml de tampón TYH (3 mg/ml p/v) y preparar tres alícuotas de 3 ml de solución BSA/TYH cada una en tubos de centrífuga de 5 ml.
    2. Combine dos pozos de esperma cada uno en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, cuente los espermatozoides usando un hematitómetro y diluya el esperma a una concentración de 2 x 107 espermatozoides/ml.
      NOTA: Utilice puntas de pipeta cortadas para pipetear espermatozoides para evitar dañar las células.
    3. Centrifugar el esperma durante 3 min a 700 x g,eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de tampón TYH. Repita el paso de centrifugación, retire el sobrenadante y transfiera cada alícuota de suspensión de espermatozoides a un tubo centrífugo de 5 ml con 3 ml de BSA/TYH.
    4. Coloque 180 l de tampón TYH en cada pozo de esquina (A1, A12, H1, H12) de una placa recubierta de ConA. Coloque 180 l de suspensión de espermatozoides en cada pozo vacío de la placa recubierta con consa (1,2 x 106 espermatozoides/pozo).
    5. Centrifugar la placa de esperma a 250 x g durante 1 min, girar la placa 180o y volver a centrifugar a 250 x g durante 1 min (velocidad de frenado más baja 1).
    6. Retire la placa de calibración del analizador de flujo extracelular y agregue la placa de esperma. Continúe el ensayo.
  7. Extracción y análisis de datos
    1. Después de finalizar el ensayo, retire el cartucho, abra el archivo de resultados, haga clic en la pestaña Exportar y exporte la ejecución completada como un archivo GraphPad Prism (Archivo suplementario 2:Datos de ejemplo primarios utilizados para la Figura 3).
    2. Duplica el archivo ECAR y OCR haciendo clic en la pestaña Nuevo y luego en la pestaña Duplicar familia... (Figura 3A).
    3. Elimine las primeras 7 filas de datos(Figura 3B).
    4. Normalice el punto de datos antes de la inyección de cAMP/IBMX por línea base restando la fila 1. Haga clic en la pestaña Analizar y, a continuación, en la ficha Eliminar línea base y columna matemáticas. Haga Click en Ok (Figura 3C).

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Resultados

Este método utiliza un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la tasa de glucólisis y oxfos durante la capacitación del esperma del ratón. La Figura 4 muestra un experimento ejemplar donde los espermatozoides fueron capacitados en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-DG y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. El sustrato de energía en el tampón de flujo extracelular TYH y ...

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Discusión

La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular,...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el apoyo del Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu en el Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD83752-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI7018IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin ASigma-AldrichA8674AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albuminSigma-AldrichA1470BSA
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)Sigma-AldrichL7381ConA
GlucoseSigma-AldrichG7528
HepesSigma-AldrichH0887
IsothesiaHenry Schein Animal Health1169567761Isoflurane
Magnesium sulfateSigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium saltSigma-AldrichD0627db-cAMP
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333KCl
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP5655KH2PO4
RotenoneCayman Chemical Company13995Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761NaHCO3-
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μLeppendorfES-12-100
12 channel pipette 50-300 μLvwr613-5257
37 °C, non-CO2 incubatorvwr1545
5 mL cetrifuge tubeseppendorf30119380
50 mL conical centrifuge tubesvwr76211-286
Centrifuge with plate adapterThermo ScientificIEC FL40R
Dissection kitWorld Precision InstrumentsMOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objectiveNikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, dividedThomas Scientific1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, dividedThomas Scientific1159X95
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

Referencias

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  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
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