Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Resumo

Descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular para monitorar as mudanças em tempo real na glicolyse e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato.

Resumo

O esperma mamífero adquire a capacidade da fecundação no intervalo reprodutivo fêmea em um processo conhecido como a capacitação. Os processos associados à capacitação requerem energia. Ainda há um debate em curso sobre as fontes que geram o ATP que alimenta a motilidade progressiva do esperma, a capacitação, a hiperativação, e a reação acrógrada. Aqui, descrevemos a aplicação de um analisador de fluxo extracelular como uma ferramenta para analisar as mudanças no metabolismo energético durante a capacitação do esperma do rato. Usando h⁺- e O₂- fluoroforres sensíveis, este método permite monitorar a glicolíse e a fosforilação oxidativa em tempo real em espermatozóides não capacitados versus capacitados. Usar este ensaio na presença de diferentes substratos energéticos e/ou ativadores farmacológicos e/ou inibidores pode fornecer insights importantes sobre a contribuição de diferentes vias metabólicas e a interseção entre sinalização de cascatas e metabolismo durante a capacitação do esperma.

Introdução

A aplicação da espectrometria de massa revolucionou o estudo do metabolismo. Perfil metabólico direcionado e rastreamento metabolômico permitem monitoramento preciso das mudanças no metabolismo energético. No entanto, a realização de metabolômica saem com sucesso requer treinamento extensivo, pessoal experiente e espectrômetros de massa caros e altamente sensíveis não prontamente disponíveis para todos os laboratórios. Nos últimos anos, usando um analisador de fluxo extracelular, como o Seahorse XFe96 tem crescido popular como um método substituto para medir as mudanças no metabolismo energético em vários tipos de células^1,2,3,4,5.

Os espermatozóides são células motil altamente especializadas; cuja tarefa é entregar o genoma paterno ao ócito. O esperma que sae do intervalo reprodutivo masculino após a ejaculação é ainda funcional imaturo e não pode fertilizar o oócito porque são incapazes de penetrar as vestes dos oócitos. O esperma adquire a competência da fecundação enquanto transitam através do intervalo reprodutivo fêmea em um processo da maturação sabido como a capacitação^6,7. Esperma ou esperma recém-ejaculado dissecado do epididímos cauda podem ser capacitados in vitro por incubação em meios de capacitação definido contendo Ca^2+,bicarbonato (HCO₃^-) ou um analógico de axigônta permeável celular (por exemplo, dibutyryl-cAMP), um aceitador de colesterol (por exemplo, albumina de soro bovina, BSA) e uma fonte de energia (por exemplo, glicose). Durante a capacitação, o esperma modifica seu padrão de motilidade em uma batida flagelar assimétrica, representando um modo de natação chamado hiperativação^8,9,e eles se tornam competentes para se submeter à reação acrosome⁷, onde enzimas proteolíticas são liberados que digerem os vestments dos oócitos. Estes processos requerem energia, e semelhante sasmáticas, espermatozóides geram ATP e outros compostos de alta energia através da glicolíse, bem como ciclo de TCA mitocondrial e fosforilação oxidativa (oxphos)¹⁰. Enquanto vários estudos demonstram que a glicolyse é necessária e suficiente para suportar a capacitação de^{espermatozóides 11,12,13,14}, a contribuição do oxphos é menos clara. Ao contrário de outros tipos de células onde a glicolíse é fisicamente acoplado ao ciclo tca, espermatozóides são altamente compartimentados e são pensados para manter esses processos em compartimentos flagelar separados: o midpiece concentra a maquinaria mitocondrial, enquanto as enzimas-chave da glicolíse parecem ser restritas à peça principal^15,16. Esta compartimentação resulta em um debate em curso sobre se o piruvato produzido na peça principal por glicolíse pode suportar oxphos mitocondrial no meio, e se ATP produzido por oxphos no midpiece seria capaz de difundir suficientemente rapidamente ao longo do comprimento do flagellum para suportar as necessidades energéticas em partes^distaisda peça principal 17^,18,19. Há também o apoio de um papel para o oxphos na capacitação de espermatozóides. Não só o oxphos é mais favorável do que a glicolíse, gerando 16 vezes mais ATP do que a glicolíse, mas o volume médio e o conteúdo mitocondrial estão diretamente correlacionados com a aptidão reprodutiva em espécies de mamíferos que apresentam maiores graus de competição entre os machos para os companheiros²⁰. Abordar essas questões requer métodos para examinar as contribuições relativas de glicolíse e oxphos durante a capacitação do esperma.

Tourmente et al. aplicaram um analisador de fluxo extracelular de 24 poços para comparar o metabolismo energético de espécies de camundongos intimamente relacionadas com parâmetros de desempenho de^esperma21significativamente diferentes. Em vez de relatar os valores basal de ECAR e de OCR do esperma non-capacitated, aqui, nós adaptamos seu método usando um analisador extracelular do fluxo de 96 poços para monitorar mudanças no metabolismo de energia durante a capacitação do esperma do rato no tempo real. Desenvolvemos um método que permite monitorar simultaneamente a glicolíse e o oxphos em tempo real em espermatozóides com flagela batendo em até doze condições experimentais diferentes, medindo o fluxo de oxigênio (O₂₎e prótons (H⁺) (Figura 1A). Devido à quebra de piruvato para lactato durante a glicolíse e a produção de CO₂ através do ciclo TCA, espermatozóides não capacitados e capacitados extrude H⁺ nos meios de ensaio que são detectados pelo analisador de fluxo extracelular via H⁺fluorofosfos sensíveis imobilizados para a ponta da sonda de um cartucho de sensor. Em paralelo, o consumo de O₂ por fosforilação oxidativa é detectado via O₂-fluorofóbicos sensíveis imobilizados até a mesma ponta da sonda (Figura 1B). A detecção eficaz do H⁺ liberado e consumiu O₂ requer um amortecedor de esperma modificado com baixa capacidade de tampão sem bicarbonato ou fenol vermelho. Assim, para induzir a capacitação na ausência de bicarbonato, adotamos o uso de um analógico de cAMP permeável celular injetado juntamente com o inibidor de PDE de ampla gama IBMX²². Três portos de injeção independentes adicionais permitem a injeção de ativadores farmacológicos e/ou inibidores, o que facilita a detecção em tempo real de alterações na taxa de respiração celular e glicolíse devido à manipulação experimental.

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Protocolo

Os espermatozóides são coletados de 8-16 semanas de idade CD-1 ratos machos. Experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Weill Cornell Medicine.

1. Dia antes do ensaio

1. Preparação do cartucho do sensor e do calibrador extracelular do analisador do fluxo
   1. Para hidratar o cartucho do sensor, retire o cartucho do sensor do Kit de Ensaio de Fluxo Extracelular XFe96 e coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de serviço público.
   2. Preencha um reservatório de solução com 25 mL de H₂O com destilação dupla usando uma pipeta multicanal, adicione 200 μL de H₂O a cada poço da placa de serviço público. Coloque o cartucho de sensor de volta para a placa de serviço público e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO_2.
      NOTA: Cartucho precisa ser hidratado por pelo menos 4 h.
   3. Aliquot 25 mL do calibrador de analisador de fluxo extracelular em um tubo cônico de 50 mL e incuba-lo durante a noite em uma incubadora de 37 °C não-CO_2.
2. Preparação de microplacas revestidas de
   1. Dissolva 2,5 mg de em 5 mL de H₂O de destilação dupla para preparar um estoque de 0,5 mg/mL (w/v).
   2. Usando uma pipeta multicanal, preencha cada poço de uma placa de fluxo extracelular de 96 poços com 50 μL da solução 0,5 mg/mL Con A. Deixe a tampa aberta e deixe a placa secar durante a noite à temperatura ambiente.
      NOTA: Várias placas podem ser revestidas de uma só vez e armazenadas a 4 °C por até quatro semanas até que estejam prontas para uso.
3. Preparação do amortecedor do esperma
   1. Prepare 250 mL de buffer de fluxo extracelular TYH com baixo HEPES contendo 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl_2,1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO_4,5,6 mM glicose e 1 mM HEPES. Aqueça o buffer a 37 °C e ajuste o pH para 7,4.

2. Dia do ensaio

1. Preparação para calibração de cartuchos
   1. Substitua o H₂O na placa de serviço público com 200 μL de calibrante XF por poço e incubar por pelo menos 1 h em uma incubadora não-CO₂ 37 °C.
      NOTA: Em vez de calibrante, estéril filtrado PBS, pH 7.4 pode ser usado.
   2. Aqueça 50 mL de tampão TYH a 37 °C.
2. Gerando um modelo de onda para o analisador de fluxo extracelular
   1. Ligue o analisador de fluxo extracelular e permita que a temperatura se estabilize para 37 °C.
   2. Abra o software de onda e projete um novo modelo abrindo um modelo em branco (ver Arquivo Suplementar 1,modelo de onda).
   3. Abra a guia de definições do Grupo. Definir a mídia de ensaio como TYH; pH 7.4 e tipo de célula como esperma toque de rato, deixar estratégias de injeção e pré-tratamentos em branco. Criar diferentes grupos para cada condição de ensaio; neste exemplo, existem 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) e 3-Isobutyl-1-metilxanthine (IBMX) para induzir a capacitação, 2-deoxiglucose (2-DG) como inibidor de glicolíse, antimicina A (antA) e rotenone (rot) como inibidor do complexo III e complexo I da cadeia de transporte de elétrons.
      NOTA: Para explicar a variabilidade entre poços, pelo menos 7-8 poços por condição devem ser medidos em paralelo.
   4. Abra a aba do mapa placa e defina o mapa da placa, atribuindo grupos para poços específicos.
      NOTA: Os quatro poços de canto (A1, A12, H1, H12) serão preenchidos com tampão TYH (sem esperma) e mais tarde serão usados para subtração de fundo.
   5. Abra a aba Protocol, adicione 4 ciclos de medição diferentes, selecione a respectiva porta e eite os detalhes de medição(Figura 2, Tabela 1). Destaque medida após injeção e não destacar o equilíbrio.
   6. Salve o modelo de ensaio, preencha o resumo do projeto e defina o local de economia para o arquivo de resultados.
3. Preparação de compostos para carregar em cartucho de sensor
   1. Prepare 2 mL de 50 mM db-cAMP dissolvendo 9,8 mg de composto no buffer TYH e adicione o IBMX a uma concentração final de 5 mM.
      NOTA: IBMX tem a tendência precipitar depois de ser diluído no buffer TYH. Os precipitados podem ser dissolvidos por vórtice e incubação da solução TYH/db-cAMP/IBMX em um bloco de calor de 37 °C por 5 min.
   2. Prepare 1 mL de 500 mM 2-DG dissolvendo 82,1 mg de composto no tampão TYH.
   3. Prepare 1 mL de 5 μM de AntA/Rot diluindo ambas as drogas no buffer TYH.
      NOTA: Os compostos são diluídos 10 vezes por injeção no cartucho de analisador de fluxo extracelular; portanto, certifique-se de que as soluções de injeção são 10x mais concentradas.
4. Isolamento do esperma do rato
   1. Anestesie 3 camundongos machos entre 8 e 16 semanas por isoflurano e sacrificar os ratos por deslocamento cervical após nenhuma resposta ao dedo do dedo do dedo do sexo foi detectado. Retire os epididimides cauda e vasa deferentia.
   2. Coloque cada cauda em 500 μL de tampão TYH pré-aquecido em 24 bem placa, imobilizar o cauda para o fundo da placa usando um par de fórceps e abra o tecido, fazendo 5-7 pequenas incisões com tesoura de penas.
   3. Transfira a placa imediatamente em uma incubadora não-CO₂ 37 °C e deixe o esperma dispersar por 15 min.
5. Carregamento do cartucho do sensor
   1. Dois guias de carregamento portuário para o porto A e D e porto B e C são fornecidos no kit Extracellular Flux. Para carregar uma porta específica, retire a tampa do cartucho do sensor e alinhe a letra do respectivo guia de carregamento da porta com o canto superior esquerdo do cartucho. Ao injetar, use as pontas dos dedos da mão não injetando para manter o guia de carregamento do porto no lugar e inserir as pontas da pipeta verticalmente nos buracos de guia de carregamento do porto.
   2. Porto A: Usando uma pipeta multicanal, injete 20 μL do buffer TYH em cada coluna.
   3. Porto B: Injetar 22 μL de buffer TYH na coluna 1-4, injetar 22 μL de 500 mM 2-DG na coluna 5-8, e 25 μL de 5 μM AntA/Rot na coluna 9-12.
   4. Port C: Injetar 25 μL de buffer TYH em cada coluna com números ímpares, injetar 25 μL de 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX em cada coluna com números pares.
   5. Coloque o cartucho de sensor com a placa de calibração no analisador de fluxo extracelular e inicie o ensaio. A calibração leva de 10 a 15 min.
6. Preparação de placas de esperma
   1. Dissolva 45 mg de BSA em 15 mL de tampão TYH (3 mg/mL w/v) e prepare três alíquotas de 3 mL BSA/TYH solução cada um em 5 mL tubos de centrífuga.
   2. Combine dois poços de esperma cada um em um tubo de centrífuga de 1,5 mL, conte o esperma usando um hematocitometro e diluir o esperma a uma concentração de 2 x 10⁷ esperma/mL.
      NOTA: Use pontas da pipeta do corte para pipetting o esperma para evitar danificar as pilhas.
   3. Centrífuga o esperma para 3 min em 700 x g, remover o supernatant e adicionar 1 mL de tyh buffer. Repita a etapa centrífuga, retire o supernatant, e transfira cada alíquota da suspensão do esperma em um tubo de centrífuga de 5 mL com 3 mL de BSA/TYH.
   4. Coloque 180 μL de tampão TYH em cada poço de canto (A1, A12, H1, H12) de uma placa revestida de. Coloque 180 μL de suspensão de esperma em cada poço vazio da placa revestida de (1,2 x 10⁶ espermatozóides/poço).
   5. Centrífuga a placa de esperma em 250 x g para 1 min, gire a placa por 180°, e centrífuga outra vez em 250 x g para 1 min (a taxa de travagem a mais baixa 1).
   6. Retire a placa de calibração do analisador de fluxo extracelular e adicione o prato de esperma. Continue o ensaio.
7. Extração e análise de dados
   1. Depois de terminar o ensaio, remover o cartucho, abrir o arquivo de resultados, clique na guia Export e exportar a execução concluída como um arquivo Prism GraphPad(Arquivo Suplementar 2:Dados de exemplo primário usado para a Figura 3).
   2. Duplicar o arquivo ECAR e OCR clicando na nova guia e, em seguida, a família duplicada ... guia (Figura 3A).
   3. Excluir as primeiras 7 linhas de dados(Figura 3B).
   4. Normalizar para o ponto de dados antes da injeção de cAMP/IBMX por linha de base subtraindo a linha 1. Clique na aba Analisar e, em seguida, na lista de matemática remove de linha de base e coluna. Destaque a linha selecionada (s): Primeira Linha, Cálculo: Relação:Valor/Linhade Base e Subcolunas: Ignore a Subcoluna. Clique OK (Figura 3C).

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Resultados

Este método usa um analisador de fluxo extracelular para monitorar mudanças em tempo real na taxa de glicolíse e oxphos durante a capacitação de espermatozóides do mouse. A figura 4 mostra um experimento exemplar em que o esperma foi capacitado na presença de glicose como o único substrato de energia e 2-DG e antimicina e rotenone como moduladores farmacológicos. O substrato de energia no amortecedor TYH do analisador de fluxo extracelular e os modul...

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Discussão

A perda de capacitação do esperma na ausência de certos substratos metabólicos ou enzimas metabólicas críticas revelou o metabolismo energético como um fator chave que suporta a fertilização bem sucedida. Um interruptor metabólico durante a ativação celular é um conceito bem estabelecido em outros tipos de células, no entanto, estamos apenas começando a entender como o esperma adapta seu metabolismo à crescente demanda de energia durante a capacitação. Usando um analisador de fluxo extracelular, desenvo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Animal Health	1169567761	Isoflurane
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL	eppendorf	ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL	vwr	613-5257
37 °C, non-CO2 incubator	vwr	1545
5 mL cetrifuge tubes	eppendorf	30119380
50 mL conical centrifuge tubes	vwr	76211-286
Centrifuge with plate adapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissection kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.