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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux pour surveiller des changements en temps réel dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris.

Résumé

Le sperme de mammifères acquiert la capacité de fertilisation dans l'appareil reproducteur femelle dans un processus connu sous le nom de capacitation. Les processus associés à la capacitation nécessitent de l'énergie. Il reste un débat continu au sujet des sources générant l'ATP qui alimente la motilité progressive de sperme, la capacitation, l'hyperactivation, et la réaction acrosome. Ici, nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux comme outil pour analyser des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris. À l'aide de h-et O2- fluorophores sensibles, cette méthode permet de surveiller la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel chez les spermatozoïdes non capacitated versus capacitating. L'utilisation de cet analyse en présence de différents substrats énergétiques et/ou d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs peut fournir des informations importantes sur la contribution de différentes voies métaboliques et l'intersection entre les cascades de signalisation et le métabolisme pendant la capacitation des spermatozoïdes.

Introduction

L'application de la spectrométrie de masse a révolutionné l'étude du métabolisme. Le profilage métabolique ciblé et le traçage métabolomique permettent une surveillance précise des changements dans le métabolisme énergétique. Cependant, l'exécution de la métabolomique nécessite une formation approfondie, un personnel expérimenté et des spectromètres de masse coûteux et très sensibles qui ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires. Ces dernières années, l'utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire, comme l'hippocampe XFe96 est devenu populaire comme une méthode de substitution pour mesurer les changements dans le métabolisme énergétique dans divers types de cellules1,2,3,4,5.

Les spermatozoïdes sont des cellules motiles hautement spécialisées; dont la tâche est de livrer le génome paternel à l'ovocyte. Les spermatozoïdes quittant l'appareil reproducteur masculin après l'éjaculation sont encore fonctionnellement immatures et ne peuvent pas féconder l'ovocyte parce qu'ils sont incapables de pénétrer les vêtements des ovocytes. Le sperme acquiert la compétence de fertilisation pendant qu'ils transitent par l'appareil reproducteur femelle dans un processus de maturation connu sous le nom de capacitation6,7. Les spermatozoïdes ou spermatozoïdes fraîchement éjaculés disséqués de l'épididyme cauda peuvent être concoctées in vitro par incubation dans des supports de capacitation définis contenant Ca2,bicarbonate (HCO3-) ou un analogue cAMP perméable à la cellule (p. ex., dibutyryl-cAMP), un accepteur de cholestérol (p. ex. albumine de sérum bovin, BSA) et une source d'énergie (p. ex. glucose). Pendant la capacitation, les spermatozoïdes modifient leur modèle de motilité en un battement asymétrique de flagellaire, représentant un mode de natation appelé hyperactivation8,9, et ils deviennent compétents pour subir la réaction acrosome7, où des enzymes protéolytiques sont libérées qui digèrent les vêtements des ovocytes. Ces processus nécessitent de l'énergie, et similaires aux cellules somatiques, les spermatozoïdes génèrent de l'ATP et d'autres composés à haute énergie par glycolyse ainsi que le cycle mitochondrial TCA et la phosphorylation oxydative (oxphos)10. Tandis que les études multiples démontrent que la glycolyse est nécessaire et suffisante pour soutenir la capacitation de sperme11,12,13,14, la contribution de l'oxphos est moins claire. Contrairement à d'autres types de cellules où la glycolyse est physiquement couplée au cycle TCA, les spermatozoïdes sont très compartimentés et sont pensés pour maintenir ces processus dans des compartiments de flagellateur séparés: la pièce médiane concentre la machinerie mitochondriale, tandis que les enzymes clés de la glycolyse semblent être limitées à la pièce principale15,16. Cette compartimentation se traduit par un débat en cours sur la question de savoir si le pyruvate produit dans la pièce principale par glycolyse peut soutenir les oxphos mitochondriaux dans la pièce médiane, et si l'ATP produit par les oxphos dans la pièce médiane serait en mesure de diffuser suffisamment rapidement le long de la longueur du flagellum pour soutenir les besoins énergétiques dans les parties distales de la pièce principale17,18,19. Il y a également le soutien d'un rôle pour des oxphos dans la capacitation de sperme. Non seulement les oxphos sont plus favorables énergétiquement que la glycolyse, générant 16 fois plus d'ATP que la glycolyse, mais le volume médian et la teneur mitochondriale sont directement corrélés avec la forme reproductive chez les espèces de mammifères qui présentent de plus grands degrés de concurrence entre les mâles pour les compagnons20. Pour répondre à ces questions, il faut des méthodes pour examiner les contributions relatives de la glycolyse et de l'oxphos pendant la capacitation des spermatozoïdes.

Tourmente et coll. ont appliqué un analyseur de flux extracellulaire de 24 puits pour comparer le métabolisme énergétique d'espèces de souris étroitement apparentées avec des paramètres de performance des spermatozoïdes significativement différents21. Au lieu de rapporter les valeurs basales d'ECAR et d'OCR des spermatozoïdes non-capacitated, ici, nous adaptons leur méthode utilisant un analyseur extracellulaire de flux de 96-bien pour surveiller des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris en temps réel. Nous avons développé une méthode qui permet de surveiller simultanément la glycolyse et les oxphos en temps réel dans les spermatozoïdes avec battre flagelle dans jusqu'à douze conditions expérimentales différentes en mesurant le flux d'oxygène (O2) et les protons (H)(Figure 1A). En raison de la décomposition du pyruvate à lactate pendant la glycolyse et de la production de CO2 via le cycle TCA, les spermatozoïdes non capacitatisés et concitatisés extrudent Hdans le support d'analyse qui sont détectés par l'analyseur de flux extracellulaire par l'intermédiaire des fluorophoressensiblesH-sensibles immobilisés à l'extrémité de la sonde d'une cartouche de capteur. En parallèle, la consommation d'O2 par phosphorylation oxydative est détectée par l'intermédiaire de fluorophores sensibles à l'O2immobilisés à la même pointe de la sonde (Figure 1B). La détection efficace de l'O2 libéréet consommé nécessite un tampon de sperme modifié avec une faible capacité tampon sans bicarbonate ou rouge phénol. Ainsi, pour induire la capacitation en l'absence de bicarbonate, nous avons adopté l'utilisation d'un analogue cAMP perméable à la cellule injecté avec l'inhibiteur de la PDE à large portée IBMX22. Trois autres ports d'injection indépendants permettent l'injection d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs, ce qui facilite la détection en temps réel des changements dans la respiration cellulaire et le taux de glycolyse dus à la manipulation expérimentale.

Protocole

Le sperme est recueilli à partir de souris mâles CD-1 de 8-16 semaines. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Weill Cornell Medicine.

1. Jour avant l'assay

  1. Préparation de la cartouche de capteur et de l'analyseur de flux extracellulaire calibrant
    1. Pour hydrater la cartouche du capteur, retirez la cartouche du capteur du kit d'assiduité extracellulaire XFe96 et placez la cartouche du capteur à l'envers à côté de la plaque d'utilité.
    2. Remplir un réservoir de solution avec 25 ml de H2O à double distillation à l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 200 OL de H2O à chaque puits de la plaque d'utilité. Placez la cartouche du capteur dans la plaque d'utilité et incubez toute la nuit dans un incubateur non CO2 de 37 oC.
      REMARQUE: Cartridge doit être hydraté pendant au moins 4 h.
    3. Aliquot 25 ml de l'analyseur de flux extracellulaire calibrant dans un tube conique de 50 ml et l'incuber pendant la nuit dans un incubateur de 37 oC non-CO2.
  2. Préparation de microplaques enduites de ConA
    1. Dissoudre 2,5 mg de ConA dans 5 ml de H2O à double distillation pour préparer un stock de 0,5 mg/mL (w/v).
    2. À l'aide d'une pipette multicanal, remplissez chaque puits d'une plaque d'analyseur de flux extracellulaire de 96 puits avec 50 l l de la solution 0,5 mg/mL Con A. Laissez le couvercle ouvert et laissez sécher la plaque toute la nuit à température ambiante.
      REMARQUE : Plusieurs plaques peuvent être enduites à la fois et entreposées à 4 oC pendant jusqu'à quatre semaines jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.
  3. Préparation de la mémoire tampon de sperme
    1. Préparer 250 mL d'analyseur de flux extracellulaire TYH tampon avec faible HEPES contenant 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM de glucose, et 1 mM HEPES. Chauffer le tampon à 37 oC et ajuster le pH à 7,4.

2. Jour de l'assay

  1. Préparation à l'étalonnage des cartouches
    1. Remplacer le H2O dans la plaque d'utilité par 200 l de calibrant XF par puits et couver pendant au moins 1 h dans un incubateur non-CO2 37 oC.
      REMARQUE : Au lieu d'un PBS calibrant et filtré stérile, le pH 7.4 peut être utilisé.
    2. Chauffer 50 ml de tampon TYH à 37 oC.
  2. Génération d'un modèle d'onde pour l'analyseur de flux extracellulaire
    1. Activez l'analyseur de flux extracellulaire et laissez la température se stabiliser à 37 oC.
    2. Ouvrez le logiciel d'onde et concevez un nouveau modèle en ouvrant un modèle vierge (voir Fichier supplémentaire 1, modèle d'onde).
    3. Ouvrez l'onglet Définitions du Groupe. Définir les supports d'analyse comme TYH; pH 7.4 et type de cellules comme sperme de souris, laisser les stratégies d'injection et les prétraitements vierges. Créer différents groupes pour chaque condition d'assougage; dans cet exemple, il y a 6 groupes différents (TYH, TYH - db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG - db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot - db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) et 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) pour induire la capacitation, 2-deoxyglucose (2-DG) comme inhibiteur de glycolyse, antimycine A (antA) et rotenone (rote) comme inhibiteur de la chaîne complexe III et complexe de transport électronique.
      REMARQUE : Pour tenir compte de la variabilité entre les puits, au moins 7 à 8 puits par condition doivent être mesurés en parallèle.
    4. Ouvrez l'onglet carte plaque et définissez la carte des plaques en attribuant des groupes à des puits spécifiques.
      REMARQUE : Les quatre puits d'angle (A1, A12, H1, H12) seront remplis de tampon TYH (pas de sperme) et seront plus tard utilisés pour la soustraction de fond.
    5. Ouvrez l'onglet Protocole, ajoutez 4 cycles de mesure différents, sélectionnez le port respectif et modifiez les détails de mesure (Figure 2, Tableau 1). Mettre en surbrillance la mesure après l'injection et ne pas mettre en évidence l'équilibre.
    6. Enregistrez le modèle d'analyse, remplissez le résumé du projet et définissez l'emplacement d'enregistrement du fichier de résultats.
  3. Préparation de composés à charger dans la cartouche du capteur
    1. Préparer 2 ml de 50 mM db-cAMP en dissolvant 9,8 mg de composé dans le tampon TYH et ajouter IBMX à une concentration finale de 5 mM.
      REMARQUE : IBMX a tendance à se précipiter après avoir été dilué dans le tampon TYH. Les précipitations peuvent être dissoutes par le vortex et l'incubation de la solution TYH/db-cAMP/IBMX dans un bloc de chaleur de 37 oC pendant 5 min.
    2. Préparer 1 ml de 500 mM 2-DG en dissolvant 82,1 mg de composé dans le tampon TYH.
    3. Préparer 1 ml de 5 Md d'AntA/Rot en diluant les deux médicaments dans le tampon TYH.
      REMARQUE : Les composés sont dilués 10 fois par injection dans la cartouche extracellulaire d'analyseur de flux ; par conséquent, assurez-vous que les solutions d'injection sont 10 fois plus concentrées.
  4. Isolement du sperme de souris
    1. Anesthésier 3 souris mâles entre 8 et 16 semaines par isoflurane et sacrifier les souris par dislocation cervicale après qu'aucune réponse au pincement d'orteil n'ait été détectée. Enlever les épididymides cauda et la vasa deferentia.
    2. Placer chaque cauda dans 500 l de tampon TYH préchauffé dans un puits de 24 puits, immobiliser la cauda au fond de la plaque à l'aide d'une paire de forceps et ouvrir le tissu en faisant 5-7 petites incisions avec des ciseaux à plumes.
    3. Transférer immédiatement la plaque dans un incubateur non-CO2 37 oC et laisser le sperme se disperser pendant 15 min.
  5. Chargement de la cartouche du capteur
    1. Deux guides de chargement portuaire pour les ports A et D et les ports B et C sont fournis dans le kit Flux extracellulaire. Pour charger un port spécifique, retirez le couvercle de la cartouche du capteur et alignez la lettre du guide de chargement port respectif avec le coin supérieur gauche de la cartouche. Pendant l'injection, utilisez le bout des doigts de la main non-injectante pour maintenir le guide de chargement bâbord en place et insérer les pointes de pipette verticalement dans les trous de guidage de chargement bâbord.
    2. Port A : À l'aide d'une pipette multicanal, injecter 20 l de la mémoire tampon TYH dans chaque colonne.
    3. Port B : Injecter 22 l de tampon TYH dans la colonne 1-4, injecter 22 'L de 500 mM 2-DG dans la colonne 5-8, et 25 'L de 5 'M AntA/Rot dans la colonne 9-12.
    4. Port C : Injectez 25 l de tampon TYH dans chaque colonne avec des nombres impairs, injectez 25 'L de 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX dans chaque colonne avec des nombres pair.
    5. Placez la cartouche du capteur avec la plaque d'étalonnage dans l'analyseur de flux extracellulaire et commencez l'analyse. Calibration prend 10 - 15 min.
  6. Préparation des plaques de sperme
    1. Dissoudre 45 mg de BSA dans 15 ml de tampon TYH (3 mg/mL w/v) et préparer trois aliquots de 3 mL de solution BSA/TYH chacun dans des tubes centrifugeurs de 5 ml.
    2. Combinez deux puits de sperme chacun dans un tube centrifugeur de 1,5 mL, comptez le sperme à l'aide d'un hématocytomètre et diluez le sperme à une concentration de 2 x 107 spermatozoïdes/mL.
      REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette coupées pour la pipetage du sperme pour éviter d'endommager les cellules.
    3. Centrifuger le sperme pendant 3 min à 700 x g,retirer le supernatant et ajouter 1 ml de tampon TYH. Répétez l'étape de centrifugation, retirez le supernatant et transférez chaque aliquot de suspension de sperme dans un tube de centrifugeuse de 5 ml avec 3 ml de BSA/TYH.
    4. Placez 180 l de tampon TYH dans chaque puits d'angle (A1, A12, H1, H12) d'une plaque enduite de ConA. Placer 180 l de suspension de sperme dans chaque puits vide de la plaque enduite de ConA (1,2 x 106 spermatozoïdes/puits).
    5. Centrifuger la plaque de sperme à 250 x g pendant 1 min, faire pivoter la plaque de 180 degrés, et centrifuger à nouveau à 250 x g pendant 1 min (taux de freinage le plus bas 1).
    6. Retirez la plaque d'étalonnage de l'analyseur de flux extracellulaire et ajoutez la plaque de sperme. Continuez l'assidu.
  7. Extraction et analyse de données
    1. Après avoir terminé l'essai, retirez la cartouche, ouvrez le fichier des résultats, cliquez sur l'onglet Export et exportez l'exécution terminée sous forme de fichier GraphPad Prism (Fichier supplémentaire 2: Données d'exemple primaire utilisées pour la figure 3).
    2. Duplicate le fichier ECAR et OCR en cliquant sur le nouvel onglet, puis la famille Duplicate... onglet (Figure 3A).
    3. Supprimer les 7 premières lignes de données (Figure 3B).
    4. Normalisez au point de données avant l'injection cAMP/IBMX en soustrayant la ligne 1 de base. Cliquez sur l'onglet Analyse, puis sur l'onglet Supprimer la ligne de base et la colonne mathématiques. Mettre en évidence les lignes sélectionnées (s): Première rangée, Calcul: Ratio:Value/Baseline, et Sous-colonnes: Ignorer la sous-colonne. Cliquez sur OK ( Figure3C).

Résultats

Cette méthode utilise un analyseur de flux extracellulaire pour surveiller les changements en temps réel dans le taux de glycolyse et d'oxphos pendant la capacitation de sperme de souris. La figure 4 montre une expérience exemplaire où les spermatozoïdes ont été concités en présence de glucose comme seul substrat énergétique et 2-DG et antimycine et rotenone comme modulateurs pharmacologiques. Le substrat d'énergie dans le tampon d'analyseur de fl...

Discussion

La perte de la capacitation de sperme en l'absence de certains substrats métaboliques ou enzymes métaboliques critiques a indiqué le métabolisme d'énergie comme facteur clé soutenant la fertilisation réussie. Un commutateur métabolique pendant l'activation cellulaire est un concept bien établi dans d'autres types de cellules, cependant, nous commençons juste à comprendre comment les spermatozoïdes adaptent leur métabolisme à la demande croissante d'énergie pendant la capacitation. À l'aide d'un analyseur ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner le soutien du Dr Lavoisier Ramos-Espiritu au Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD83752-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI7018IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin ASigma-AldrichA8674AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albuminSigma-AldrichA1470BSA
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)Sigma-AldrichL7381ConA
GlucoseSigma-AldrichG7528
HepesSigma-AldrichH0887
IsothesiaHenry Schein Animal Health1169567761Isoflurane
Magnesium sulfateSigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium saltSigma-AldrichD0627db-cAMP
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333KCl
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP5655KH2PO4
RotenoneCayman Chemical Company13995Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761NaHCO3-
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μLeppendorfES-12-100
12 channel pipette 50-300 μLvwr613-5257
37 °C, non-CO2 incubatorvwr1545
5 mL cetrifuge tubeseppendorf30119380
50 mL conical centrifuge tubesvwr76211-286
Centrifuge with plate adapterThermo ScientificIEC FL40R
Dissection kitWorld Precision InstrumentsMOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objectiveNikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, dividedThomas Scientific1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, dividedThomas Scientific1159X95
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

Références

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).

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