Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators zur Überwachung von Echtzeitveränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Mazemazeration der Maus.

Zusammenfassung

Säugetier-Spermien erwerben Befruchtungsfähigkeit im weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Prozess, der als Kapitulation bekannt ist. Capacitation-assoziierte Prozesse benötigen Energie. Es bleibt eine laufende Debatte über die Quellen, die die ATP erzeugen, die Spermien progressive Motilität, Kapitulation, Hyperaktivierung, und Akrosomenreaktion antreibt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines extrazellulären Flussanalysators als Werkzeug, um Veränderungen im Energiestoffwechsel während der Maus-Sperma-Kapazität zu analysieren. Mit H⁺- und_O2- empfindlichen Fluorophoren ermöglicht diese Methode die Überwachung der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung in Echtzeit in nicht-kapazitierten oder kapazitiven Spermien. Die Verwendung dieses Assays in Gegenwart verschiedener Energiesubstrate und/oder pharmakologischer Aktivatoren und/oder Inhibitoren kann wichtige Einblicke in den Beitrag verschiedener Stoffwechselwege und den Schnittpunkt zwischen Signalkaskaden und Stoffwechsel während der Spermienkapitulation liefern.

Einleitung

Die Anwendung der Massenspektrometrie hat die Untersuchung des Stoffwechsels revolutioniert. Gezielte metabolische Profilierung und metatobiomische Tracing ermöglichen eine präzise Überwachung von Veränderungen im Energiestoffwechsel. Die erfolgreiche Durchführung der Metabolomik erfordert jedoch umfangreiche Schulungen, erfahrenes Personal und teure, hochempfindliche Massenspektrometer, die nicht für jedes Labor verfügbar sind. In den letzten Jahren ist die Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators, wie z. B. des Seahorse XFe96, als Ersatzmethode zur Messung von Veränderungen im Energiestoffwechsel in verschiedenen Zelltypen^1,2,3,4,5populär geworden.

Spermien sind hochspezialisierte motile Zellen; deren Aufgabe es ist, das väterliche Genom an die Oozyte zu liefern. Sperma verlassen den männlichen Fortpflanzungstrakt nach der Ejakulation sind noch funktionell unreif und können die Eizelle nicht befruchten, weil sie nicht in der Lage sind, die Gewänder der Eizellen zu durchdringen. Spermien erwerben Befruchtungskompetenz, wenn sie durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt in einem Reifungsprozess, bekannt als Capacitation^6,7,transportiert werden. Frisch ejakulierte Spermien oder Spermien, die aus der Cauda epididymis seziert werden, können in vitro durch Inkubation in definierten Kapazitationsmedien, die Ca²⁺, Bicarbonat (HCO₃^-) oder einen zelldurchlässigen cAMP analog (z. B. Dibutyryl-cAMP), ein Cholesterin-Akzeptor (z. B. Rinderserumalbumin, BSA) und eine Energiequelle (z. B. Glukose). Während der Kapitulation modifizieren Spermien ihr Motilitätsmuster in einen asymmetrischen Flagellar-Beat, der einen Schwimmmodus namens Hyperaktivierung^8,9darstellt, und sie werden kompetent, um die Akrosomenreaktion⁷zu durchlaufen, wo proteolytische Enzyme freigesetzt werden, die die Gewänder der Eizellen verdauen. Diese Prozesse erfordern Energie, und ähnlich wie somatische Zellen, Spermien erzeugen ATP und andere hochenergetische Verbindungen über Glykolyse sowie mitochondrialen TCA-Zyklus und oxidative Phosphorylierung (Oxphos)¹⁰. Während mehrere Studien zeigen, dass Glykolyse notwendig und ausreichend ist, um die Spermien-Kapazität^11,12,13,14zu unterstützen, ist der Beitrag von Oxphos weniger klar. Im Gegensatz zu anderen Zelltypen, bei denen die Glykolyse physikalisch an den TCA-Zyklus gekoppelt ist, sind Spermien stark kompartimisiert und sollen diese Prozesse in separaten Flagellarkomden aufrechterhalten: Das Mittelstück konzentriert die mitochondriale Maschinerie, während die Schlüsselenzyme der Glykolyse auf das Hauptstück^15,16beschränkt zu sein scheinen. Diese Abschottung führt zu einer anhaltenden Debatte darüber, ob Pyruvat, das im Hauptstück durch Glykolyse produziert wird, mitochondriale Oxphos im Mittelstück unterstützen kann und ob ATP, die von Oxophs im Mittelstück produziert wird, in der Lage wäre, ausreichend schnell entlang der Länge des Flagellums zu diffundieren, um den Energiebedarf in distalen Teilen des Hauptteils^17,18,19zu unterstützen. Es gibt auch Unterstützung einer Rolle für Oxphos in Spermien-Capacitation. Oxphos ist nicht nur energetisch günstiger als Glykolyse, erzeugt 16-mal mehr ATP als Glykolyse, sondern Mittelstückvolumen und mitochondrialer Gehalt sind direkt mit der Reproduktivfitness bei Säugetierarten korreliert, die einen größeren Grad des Wettbewerbs zwischen Männchen für^{Kumpels zeigen 20}. Um diese Fragen zu beantworten, sind Methoden zur Untersuchung der relativen Beiträge von Glykolyse und Oxphos während der Spermien-Kapazität erforderlich.

Tourmente et al. wandten einen 24-Well extrazellulären Flussanalysator an, um den Energiestoffwechsel eng verwandter Mausarten mit signifikant unterschiedlichen Spermienleistungsparametern zu vergleichen²¹. Anstatt die basalen ECAR- und OCR-Werte von nicht kapazitierten Spermien zu melden, passen wir hier ihre Methode mit einem 96-Well extrazellulären Flussanalysator an, um Veränderungen des Energiestoffwechsels während der Flüchtigkeit der Maus in Echtzeit zu überwachen. Wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Glykolyse und Oxphos in Echtzeit in Spermien mit schlagenden Flagella in bis zu zwölf verschiedenen Versuchsbedingungen zu überwachen, indem der Fluss von Sauerstoff_(O2) und Protonen (H⁺) gemessen wird (Abbildung 1A). Durch den Abbau von Pyruvat zu Laktat während der Glykolyse und die Produktion von_CO2 über den TCA-Zyklus extrudieren nicht-kapazitierte und kapazitierte Spermien H⁺ in die Assaymedien, die vom extrazellulären Flussanalysator über H⁺-empfindliche Fluorophore zur Sondenspitze einer Sensorpatrone immobilisiert werden. Parallel dazu wird der_O2-Verbrauch durch oxidative Phosphorylierung über_{O2-empfindliche}Fluorophore immobilisiert, die zur gleichen Sondenspitze immobilisiert sind (Abbildung 1B). Der effektive Nachweis des freigesetzten H⁺ und verbrauchten O₂ erfordert einen modifizierten Spermienpuffer mit geringer Pufferkapazität ohne Bicarbonat oder Phenolrot. Um also in Abwesenheit von Bicarbonat eine Kapacitation zu induzieren, haben wir die Verwendung eines zelldurchlässigen cAMP-Analogos übernommen, das zusammen mit dem Breitbereichs-PDE-Hemmer IBMX²²injiziert wurde. Drei zusätzliche unabhängige Injektionsöffnungen ermöglichen die Injektion von pharmakologischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren, was die Echtzeitdetektion von Veränderungen der zellulären Atmung und Glykolyserate aufgrund experimenteller Manipulation enciert.

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Protokoll

Spermien werden von 8-16 Wochen alten CD-1 männlichen Mäusen gesammelt. Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Weill Cornell Medicine genehmigt.

1. Tag vor dem Assay

1. Vorbereitung von Sensorpatrone und extrazellulärem Flussanalysator-Kalibrant
   1. Um die Sensorpatrone zu hydratisieren, entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem XFe96 Extracellular Flux Assay Kit und stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Versorgungsplatte.
   2. Füllen Sie ein Lösungsreservoir mit 25 ml doppeldestilliertem_H2O mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie jedem Brunnen der Versorgungsplatte 200 l_H2O hinzu. Legen Sie die Sensorpatrone wieder in die Nutzplatte und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
      HINWEIS: Die Kartusche muss mindestens 4 h hydratisiert werden.
   3. Aliquot 25 ml des extrazellulären Flussanalysators kalibrieren in ein 50 ml konisches Rohr und inkubieren es über Nacht in einem 37 °C Nicht-CO2-Inkubator.
2. Herstellung von ConA-beschichteten Mikroplatten
   1. 2,5 mg ConA in 5 ml doppeldestilliertem_H2O auflösen, um einen 0,5 mg/ml (w/v) Vorrat zu erstellen.
   2. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jeden Brunnen einer extrazellulären Flussanalysator 96-Well-Platte mit 50 l der 0,5 mg/ml Con A-Lösung. Lassen Sie den Deckel offen und lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
      HINWEIS: Mehrere Platten können auf einmal beschichtet und bis zu vier Wochen bei 4 °C gelagert werden, bis sie einsatzbereit sind.
3. Vorbereitung des Spermienpuffers
   1. Bereiten Sie 250 ml extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer mit niedrigen HEPES mit 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 5,6 mM Glukose und 1 mM HEPES. Den Puffer auf 37 °C erhitzen und den pH-Wert auf 7,4 einstellen.

2. Tag des Assays

1. Vorbereitung für die Kartuschenkalibrierung
   1. Ersetzen Sie die H₂O in der Nutzplatte durch 200 l XF-Kalibrant pro Bohrkörper und inkubieren Sie mindestens 1 h in einem Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubator.
      HINWEIS: Anstelle von kalibrierenden, sterilgefilterten PBS kann pH 7.4 verwendet werden.
   2. 50 ml TYH-Puffer bei 37 °C erhitzen.
2. Generieren einer Wellenvorlage für den extrazellulären Flussanalysator
   1. Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator ein und lassen Sie die Temperatur auf 37 °C stabilisieren.
   2. Öffnen Sie die Wellensoftware und entwerfen Sie eine neue Vorlage, indem Sie eine leere Vorlage öffnen (siehe Ergänzungsdatei 1, Wellenvorlage).
   3. Öffnen Sie die Registerkarte Gruppendefinitionen. Definieren Sie Assay-Medien als TYH; pH 7.4 und Zelltyp als Maussperma, lassen Injektionsstrategien und Vorbehandlungen leer. Erstellen Sie verschiedene Gruppen für jede Assaybedingung; In diesem Beispiel gibt es 6 verschiedene Gruppen (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) und 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) zur Induzieren von Kapatizien, 2-Deoxyglucose (2-DG) als Glykolysehemmer, Antimycin A (AntA) und Roton (Rot) als Inhibitor des komplexen III und des komplexen I der Elektronentransportkette.
      HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den Brunnen zu berücksichtigen, sollten mindestens 7-8 Brunnen pro Zustand parallel gemessen werden.
   4. Öffnen Sie die Registerkarte "Platte" und definieren Sie die Plattenkarte, indem Sie Gruppen bestimmten Brunnen zuweisen.
      HINWEIS: Die vier Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) werden mit TYH-Puffer (kein Sperma) gefüllt und später für die Hintergrundsubtraktion verwendet.
   5. Öffnen Sie die Registerkarte Protokoll, fügen Sie 4 verschiedene Messzyklen hinzu, wählen Sie den jeweiligen Port aus und bearbeiten Sie die Messdetails (Abbildung 2, Tabelle 1). Markieren Sie die Maßnahme nach der Injektion und markieren Sie nicht das Gleichgewicht.
   6. Speichern Sie die Testvorlage, füllen Sie die Projektzusammenfassung aus, und definieren Sie den Speicherort für die Ergebnisdatei.
3. Herstellung von Verbindungen zum Laden in die Sensorpatrone
   1. Bereiten Sie 2 ml 50 mM db-cAMP vor, indem Sie 9,8 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen und IBMX zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzufügen.
      HINWEIS: IBMX neigt dazu, nach verdünnter TYH-Puffer zu ausfallen. Ausscheidungen können durch Wirbeln und Inkubieren der TYH/db-cAMP/IBMX-Lösung in einem 37 °C-Wärmeblock für 5 min gelöst werden.
   2. Bereiten Sie 1 ml 500 mM 2-DG vor, indem Sie 82,1 mg Verbindung im TYH-Puffer auflösen.
   3. Bereiten Sie 1 ml von 5 m AntA/Rot vor, indem Sie beide Medikamente im TYH-Puffer verdünnen.
      HINWEIS: Verbindungen werden 10-fach durch Injektion in die extrazelluläre Flussanalysatorpatrone verdünnt; Achten Sie daher darauf, dass Injektionslösungen 10x konzentrierter sind.
4. Isolierung von Maussperma
   1. Anästhetisieren Sie 3 männliche Mäuse zwischen 8 und 16 Wochen durch Isofluran und opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, nachdem keine Reaktion auf Zehenkneifen nachgewiesen wurde. Entfernen Sie die Cauda epididymide und vasa deferentia.
   2. Legen Sie jede Cauda in 500 l vorgewärmten TYH-Puffer in 24-Well-Platte gut, immobilisieren Sie die Cauda an der Unterseite der Platte mit einem Paar Zange und öffnen Sie das Gewebe durch 5-7 kleine Schnitte mit Federschere.
   3. Die Platte sofort in einen Nicht-CO₂ 37 °C-Inkubator geben und das Sperma 15 min verteilen lassen.
5. Beladung der Sensorpatrone
   1. Zwei Port-Ladeführungen für Port A und D sowie Port B und C sind im Extrazellulären Flux-Kit enthalten. Entfernen Sie zum Laden eines bestimmten Ports den Deckel von der Sensorkassette, und richten Sie den Buchstaben der entsprechenden Anschlussladeführung an der oberen linken Ecke der Patrone aus. Verwenden Sie beim Einspritzen die Fingerspitzen der nicht injizierenden Hand, um die Anschlussladeführung an Ort und Stelle zu halten und die Pipettenspitzen vertikal in die Anschlussladeführungslöcher einzulegen.
   2. Anschluss A: Mit einer Mehrkanalpipette in jede Spalte 20 L des TYH-Puffers einspritzen.
   3. Port B: Injizieren Sie 22 L TYH-Puffer in Spalte 1-4, injizieren Sie 22 l 500 mM 2-DG in die Spalte 5-8 und 25 l von 5 'M AntA/Rot in Spalte 9-12.
   4. Port C: Injizieren Sie 25 L TYH-Puffer in jede Spalte mit ungeraden Zahlen, injizieren Sie 25 l von 10 mM db-cAMP/ 500 'M IBMX in jede Spalte mit geraden Zahlen.
   5. Legen Sie die Sensorpatrone mit der Kalibrierplatte in den extrazellulären Flussanalysator und starten Sie den Test. Die Kalibrierung dauert 10 - 15 min.
6. Vorbereitung von Spermienplatten
   1. 45 mg BSA in 15 ml TYH-Puffer (3 mg/ml w/v) auflösen und drei Aliquots von 3 ml BSA/TYH-Lösung in jeweils 5 ml Zentrifugenrohren vorbereiten.
   2. Kombinieren Sie zwei Spermienbrunnen in einem 1,5 ml Zentrifugenrohr, zählen Sie das Sperma mit einem Hämatozytometer und verdünnen Sie das Sperma auf eine Konzentration von 2 x 10⁷ Spermien/ml.
      HINWEIS: Verwenden Sie geschnittene Pipettenspitzen zum Pipetieren von Spermien, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
   3. Zentrifugieren Sie das Sperma für 3 min bei 700 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml TYH Puffer hinzu. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie jede Spermiensuspension aliquot in ein 5 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml BSA/TYH.
   4. Legen Sie 180 L TYH-Puffer in jeden Eckbrunnen (A1, A12, H1, H12) einer ConA-beschichteten Platte. Legen Sie 180 l Spermiensuspension in jeden leeren Brunnen der ConA-beschichteten Platte (1,2 x 10⁶ Spermien/Gut).
   5. Zentrifugieren Sie die Spermienplatte bei 250 x g für 1 min, drehen Sie die Platte um 180°, und Zentrifuge wieder bei 250 x g für 1 min (niedrigste Bremsrate 1).
   6. Entfernen Sie die Kalibrierplatte aus dem extrazellulären Flussanalysator und fügen Sie die Spermienplatte hinzu. Setzen Sie den Test fort.
7. Datenextraktion und -analyse
   1. Nach Abschluss des Testes entfernen Sie die Kassette, öffnen Sie die Ergebnisdatei, klicken Sie auf die Registerkarte Exportieren und exportieren Sie die abgeschlossene Ausführung als GraphPad Prism-Datei (Ergänzende Datei 2: Primäre Beispieldaten für Abbildung 3).
   2. Duplizieren Sie die ECAR- und OCR-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Neu und dann auf die Registerkarte "Doppelte Familie" klicken (Abbildung 3A).
   3. Löschen Sie die ersten 7 Datenzeilen (Abbildung 3B).
   4. Normalisieren Sie sich auf den Datenpunkt vor der cAMP/IBMX-Injektion durch Basissubtrahierung von Zeile 1. Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren, dann auf die Registerkarte Basislinie entfernen und Spaltenmathematik. Hervorheben ausgewählter Zeilen: Erste Zeile, Berechnung: Verhältnis:Wert/Baselineund Unterspalten: Unterspalte ignorieren. Klicken Sie auf OK (Abbildung 3C).

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Ergebnisse

Diese Methode verwendet einen extrazellulären Flussanalysator, um Echtzeit-Änderungen in der Rate der Glykolyse und Oxphos während der Maus Sperma-Capacitation zu überwachen. Abbildung 4 zeigt ein beispielhaftes Experiment, bei dem Spermien in Gegenwart von Glukose als einzigem Energiesubstrat und 2-DG und Antimycin und Roton als pharmakologische Modulatoren kapazitiert wurden. Das Energiesubstrat im extrazellulären Flussanalysator TYH Puffer und die pha...

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Diskussion

Der Verlust der Spermienkapazität in Ermangelung bestimmter metabolischer Substrate oder kritischer Stoffwechselenzyme ergab den Energiestoffwechsel als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung. Ein metabolischer Schalter während der Zellaktivierung ist ein etabliertes Konzept in anderen Zelltypen, aber wir beginnen gerade zu verstehen, wie Spermien ihren Stoffwechsel an den steigenden Energiebedarf während der Kapitulation anpassen. Mit einem extrazellulären Flussanalysator haben wir ein leicht anwendbare...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A1470	BSA
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Animal Health	1169567761	Isoflurane
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μL	eppendorf	ES-12-100
12 channel pipette 50-300 μL	vwr	613-5257
37 °C, non-CO2 incubator	vwr	1545
5 mL cetrifuge tubes	eppendorf	30119380
50 mL conical centrifuge tubes	vwr	76211-286
Centrifuge with plate adapter	Thermo Scientific	IEC FL40R
Dissection kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objective	Nikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided	Thomas Scientific	1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.