JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем применение внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений гликолиза в режиме реального времени и окислительного фосфорилирования во время конденсации спермы мыши.

Аннотация

Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению в женском репродуктивном тракте в процессе, известном как емкости. Процессы, связанные с конденсацией, требуют энергии. Остается продолжающаяся дискуссия об источниках генерации АТФ, который питает прогрессивную подвижность спермы, емкости, гиперактивации и акросома реакции. Здесь мы описываем применение внеклеточного анализатора потока как инструмент для анализа изменений в энергетическом метаболизме во время конденсации спермы мыши. Используя Hq- и O2- чувствительные фторофоры, этот метод позволяет контролировать гликолиз и окислительный фосфорилирование в режиме реального времени в не-конденсированных против емкисперма спермы. Использование этого анализа в присутствии различных энергетических субстратов и/или фармакологических активаторов и/или ингибиторов может дать важное представление о вкладе различных метаболических путей и пересечении сигнальных каскадов и метаболизма во время конденсации спермы.

Введение

Применение масс-спектрометрии произвело революцию в изучении метаболизма. Целенаправленное метаболическое профилирование и метаболомическое отслеживание позволяют точно контролировать изменения в энергетическом метаболизме. Тем не менее, выполнение метаболомики успешно требует обширной подготовки, опытный персонал, и дорогие, высокочувствительные масс-спектрометры не легко доступны для каждой лаборатории. В последние годы, используя внеклеточный анализатор потока, таких как Seahorse XFe96 стал популярным в качестве суррогатного метода для измерения изменений в энергетическом метаболизме в различных типах клеток1,2,3,4.

Сперма являются узкоспециализированными мотильные клетки; чья задача состоит в том, чтобы доставить отцовский геном к яйцеклетке. Сперматозоиды, покидающие мужской репродуктивный тракт после эякуляции, по-прежнему функционально незрелы и не могут оплодотворить яйцеклетки, потому что они не могут проникнуть в облачения яйцеклеток. Сперма приобретает компетенцию по оплодотворению, поскольку они проходят через женский репродуктивный тракт в процессе созревания, известном как конденсация6,7. Свежеэякуляция сперма или сперма, расчлененные из кауда эпидидимис может быть конденсирован в пробирке путем инкубации в определенных емчечных носителях, содержащих Ca2 ", бикарбонат (HCO3-) или клеточной проницаемой аналоге cAMP (например, dibutyryl-cAMP), принимая холестерин (например, буйный сывороточный альбомин, BSA) и источник энергии (например, глюкоза). Во время емкости, спермаизменить их шаблон подвижности в асимметричный флагельер бить, представляющий режим плавания называется гиперактивации8,9, и они становятся компетентными пройти акросома реакции7, где протеолитических ферментов освобождены, которые переваривают облачения яйцеклеток. Эти процессы требуют энергии, и аналогичные соматические клетки, сперматозоиды генерировать АТФ и других соединений высокой энергии с помощью гликолиза, а также митохондриальный цикл TCA и окислительного фосфорилирования (оксифос)10. Хотя многочисленные исследования показывают, что гликолиз необходим и достаточно для поддержки спермы емчебой11,12,13,14, вклад oxphos менее ясно. В отличие от других типов клеток, где гликолиз физически связан с циклом TCA, сперма сильно разобщена и, как полагают, поддерживает эти процессы в отдельных отсеках флагеллара: средний элемент концентратирует митохондриальную технику, в то время как ключевые ферменты гликолиза, как представляется, ограничены основной частью15,16. Это разобщенности приводит к продолжающейся дискуссии о том, pyruvate производится в основной кусок гликолизом может поддерживать митохондриальный oxphos в середине, и является ли АТФ производства oxphos в середине будет в состоянии рассеять достаточно быстро по длине flagellum для поддержки энергетических потребностей в дистальных частей основной части17,19. Существует также поддержка роли oxphos в емчеобразной сперме. Мало того, что oxphos более энергетически благоприятным, чем гликолиз, генерации 16 раз больше АТФ, чем гликолиз, но средний объем и митохондриальный содержание непосредственно коррелируют с репродуктивной пригодности у млекопитающих видов, которые демонстрируют большую степень конкуренции между мужчинами для товарищей20. Для решения этих вопросов требуются методы изучения относительного вклада гликолиза и оксифоса во время конденсации спермы.

Tourmente et al. применили 24-хорошо внеклеточный анализатор потока, чтобы сравнить энергетический метаболизм тесно связанных видов мышей со значительно отличаемыми параметрами производительности спермы21. Вместо того, чтобы сообщать о базальных значениях ECAR и OCR неконденционной спермы, здесь мы адаптируем их метод с помощью 96-хорошо внеклеточного анализатора потока потока для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме во время емкостя спермы мыши в режиме реального времени. Мы разработали метод, который позволяет одновременно контролировать гликолиз и oxphos в режиме реального времени в сперме с избиением флагеллы в до двенадцати различных экспериментальных условиях путем измерения потока кислорода (O2) и протонов (H)(Рисунок 1A). В связи с разбивкой пировата лактата во время гликолиза и производства CO2 через Цикл TCA, неемные и емкие спермы экструдировать Hв анализ средств, которые обнаруживаются внеклеточного анализатора флюкса через H-чувствительные флюорофоры обездвижены к кончику зонда датчика. Параллельно, O2 потребление окислительного фосфорилирования обнаруживается через O2чувствительных флюорофоров обездвижены к тому же наконечник зонда (Рисунок 1B). Эффективное обнаружение высвобожденных Hи потребляемых O2 требует модифицированного буфера спермы с низкой буферной емкостью без бикарбоната или фенола красного цвета. Таким образом, чтобы вызвать емки при отсутствии бикарбоната, мы приняли использование клеточного аналога cAMP, введенного вместе с широкодиапазонным ингибитором PDE IBMX22. Три дополнительных независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов, что облегчает обнаружение в режиме реального времени изменений в клеточном дыхании и скорости гликолиза в связи с экспериментальными манипуляциями.

протокол

Сперма тона собрана у 8-16-недельных мышей CD-1. Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Вейла Корнелла (IACUC).

1. День до ассеидов

  1. Приготовление сенсорного картриджа и калибровщика внеклеточного анализаля потока
    1. Для увлажнения картриджа датчика, удалить картридж датчика из XFe96 Extracellular Flux Assay Kit и поместить картридж датчика с ног на голову рядом с утилитой пластины.
    2. Заполните резервуар раствора 25 мл двойной дистиллированной H2O с помощью многоканального пипетки, добавьте 200 Л Л H2O к каждой скважине утилиты пластины. Поместите картридж датчика обратно в утилиту пластины и инкубировать на ночь в 37 КК не-CO2 инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж должен быть гидратированных, по крайней мере 4 ч.
    3. Aliquot 25 мл внеклеточного анализатора потока калибруется в 50 мл конической трубки и инкубировать его на ночь в 37 КС без CO2 инкубатора.
  2. Приготовление микроплит с покрытием ConA
    1. Растворите 2,5 мг ConA в 5 мл двойной дистиллированной H2O, чтобы подготовить 0,5 мг/мл (w/v) бульон.
    2. Используя многоканальный пипетку, заполните каждую скважину внеклеточного анализатора потока 96-ну с 50 л раствора 0,5 мг/мл. Оставьте крышку открытой и дайте пластине высохнуть на ночь при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько пластин могут быть покрыты одновременно и храниться при 4 градусах По Цельсию в течение четырех недель до готовности к использованию.
  3. Подготовка буфера спермы
    1. Подготовьте 250 мл внеклеточного флюс-анализатора TYH с низким HEPES, содержащим 138 мМ NaCl, 4,7 мм KCl, 1,7 мм CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgSO4, 5,6 мм глюкозы, и 1 мМ HEPES. Нагрейте буфер до 37 градусов по Цельсию и отрегулируйте рН до 7,4.

2. День асссея

  1. Подготовка к калибровке картриджа
    1. Замените H2O в утилите пластины с 200 зл и l калибранта XF на скважину и инкубировать, по крайней мере 1 ч в не-CO237 C инкубатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо калиброванного, стерильной фильтрованного PBS, рН 7.4 может быть использован.
    2. Нагрейте 50 мл буфера TYH при температуре 37 градусов по Цельсию.
  2. Создание шаблона волны для внеклеточного анализатора потока
    1. Включите внеклеточный анализатор потока и позвольте температуре стабилизироваться до 37 градусов по Цельсию.
    2. Откройте волновое программное обеспечение и разработайте новый шаблон, открыв пустой шаблон (см. Дополнительный файл 1,шаблон волны).
    3. Откройте вкладку определений группы. Определите медиа-информацию assay как TYH; рН 7.4 и тип клетки как сперма мыши, выходят стратегии впрыски и pretreatments пустые. Создание различных групп для каждого состояния асссея; в этом примере, есть 6 различных групп (TYH, TYH и db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG, db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot dibutyryl cAMP (db-cAMP) и 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) для индуцирования, 2-дезоксиглюкозы (2-DG) в качестве ингибитора гликолиза, антимицина А (анта) и ротенона (гнили) в качестве ингибитора III и комплекса I электросетевого транспорта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для учета изменчивости между скважинами, по крайней мере 7-8 скважин на состояние должно быть измерено параллельно.
    4. Откройте вкладку карты плиты и определите карту пластины, назначив группы к определенным скважинам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре угловые скважины (A1, A12, H1, H12) будут заполнены буфером TYH (без спермы) и позже будут использованы для фонового вычитания.
    5. Откройте вкладку Протокола, добавьте 4 различных цикла измерения, выберите соответствующий порт и отсваивайте детали измерения(рисунок 2, таблица 1). Выделите меру после инъекции и не выделите равновесие.
    6. Сохраните шаблон ассеи, заполните резюме проекта и определите место сохранения для файла результатов.
  3. Приготовление соединений для загрузки в сенсорный картридж
    1. Приготовьте 2 мл 50 мм db-cAMP, растворив 9,8 мг соединения в буфере TYH и добавьте IBMX к конечной концентрации 5 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IBMX имеет тенденцию к осадок после того, как разбавленва в буфере TYH. Осадки могут быть растворены путем вихря и инкубации раствора TYH/db-cAMP/IBMX в тепловом блоке 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
    2. Приготовьте 1 мл 500 мМ 2-DG, растворив 82,1 мг соединения в буфере TYH.
    3. Приготовьте 1 мл из 5 мкм AntA/Rot, разбавив оба препарата в буфере TYH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения разбавляют сяречными 10 раз путем инъекций в картридж внеклеточного анализатора потока; поэтому убедитесь, что инъекционные растворы в 10 раз более концентрированы.
  4. Изоляция мышиной спермы
    1. Анестезия 3 мышей мужского пола между 8 и 16 недель по изофлуран и принести в жертву мышей шейки матки дислокации после того, как не ответ на ноге щипать был обнаружен. Удалите кауда эпидидимиды и ваза поминания.
    2. Поместите каждую кауду в 500 л предогретого буфера TYH в 24-ну хорошо пластины хорошо, обездвижить кауда на дно пластины с помощью пары щипцов и открыть ткань, сделав 5-7 небольших разрезов с пером ножницы.
    3. Перенесите пластину сразу в инкубатор без CO2 37 градусов по Цельсию и дайте сперме разойтись в течение 15 минут.
  5. Загрузка сенсорного картриджа
    1. Два направляющих сярприза для портов A и D и портов B и C предусмотрены в комплекте Extracellular Flux. Для загрузки определенного порта снимите крышку с картриджа датчика и выровняем букву соответствующего руководства по загрузке порта с верхним левым углом картриджа. Во время инъекций, используйте кончики пальцев не инъекционных стороны держать порт погрузки руководство на месте и вставить пипетки советы вертикально в порт загрузки направляющих отверстий.
    2. Порт A: Используя многоканальный пипетки, введите в каждый столбец 20 кЛ буфера TYH.
    3. Порт B: Введите 22 qL буфера TYH в столбец 1-4, введите 22 мЛ 500 мМ 2-DG в колонку 5-8, и 25 qL 5 мкм AntA/Rot в колонку 9-12.
    4. Порт C: Введите 25 юл буфера TYH в каждый столбец с нечетными числами, введите 25 мКм 10 мМ db-cAMP/ 500 мкм IBMX в каждый столбец с четными числами.
    5. Поместите картридж датчика с калибровочной пластиной в внеклеточный анализатор потока и начните анализ. Калибровка занимает 10 - 15 мин.
  6. Приготовление сперматозоидов
    1. Растворите 45 мг BSA в 15 мл буфера TYH (3 мг/мл w/v) и подготовьте три аликота из 3 мл раствора BSA/TYH каждый в 5 мл центрифуговых труб.
    2. Смешайте две сперматозоиды в одной центрифуге 1,5 мл, посчитайте сперму с помощью гематоцитометра и разбавьте сперму до концентрации 2 х 107 сперматозоидов/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вырезать пипетки советы для пипетки спермы, чтобы избежать повреждения клеток.
    3. Centrifuge спермы в течение 3 мин на 700 х г,удалить супернатант и добавить 1 мл буфера TYH. Повторите шаг центрифугации, удалите супернатант и перенесите каждый аликот подвески спермы в одну центрифугу 5 мл с 3 мл BSA/TYH.
    4. Поместите 180 юл буфера TYH в каждый угол окон хорошо (A1, A12, H1, H12) пластины с покрытием ConA. Поместите 180 л сперматозоидов в каждый пустой колодец пластины с покрытием ConA (1,2 x 106 сперматозоидов/хорошо).
    5. Центрифуга пластины спермы на 250 х г в течение 1 мин, поверните пластину на 180 ", и центрифуга снова на 250 х г в течение 1 мин (самый низкий коэффициент торможения 1).
    6. Удалите калибровочную пластину с внеклеточного анализатора потока и добавьте сперматозоидную пластину. Продолжить асссе.
  7. Извлечение и анализ данных
    1. После завершения анализа удалите картридж, откройте файл результатов, щелкните вкладку Экспорт и экспортите завершенный запуск в виде файла GraphPad Prism(Дополнительный файл 2:Первичные данные, используемые для рисунка 3).
    2. Дублировать eCAR и OCR файл, нажав на новую вкладку, а затем Дубликат семьи ...
    3. Удалите первые 7 строк данных(рисунок 3B).
    4. Нормализация к точке данных перед инъекцией cAMP/IBMX путем вычитания строки 1. Нажмите на вкладку Анализ, затем на базовой строке И колонке математики: Выделите выбранную строку (ы): Первый ряд, Расчет: Коэффициент:Значение/Базовый унимыслеи подколонки: Игнорировать подколонку. Нажмите OK (Рисунок 3C).

Результаты

Этот метод использует внеклеточный анализатор потока для мониторинга в реальном времени изменения в скорости гликолиза и oxphos во время емки спермы мыши. На рисунке 4 показан образцовый эксперимент, в ходе котором сперма точника была вложена в присутств...

Обсуждение

Потеря емкостя спермы при отсутствии определенных метаболических субстратов или критических метаболических ферментов выявила энергетический обмен в качестве ключевого фактора, поддерживающего успешное оплодотворение. Метаболический переключатель во время активации клеток являет...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить поддержку д-ра Лавуазье Рамоса-Эспириту в Центре ресурсов Рокфеллера и спектроскопии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
2-Deoxy-D-glucoseSigma-AldrichD83752-DG
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI7018IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots
Antimycin ASigma-AldrichA8674AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots
Bovine serum albuminSigma-AldrichA1470BSA
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016CaCl2
Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut)Sigma-AldrichL7381ConA
GlucoseSigma-AldrichG7528
HepesSigma-AldrichH0887
IsothesiaHenry Schein Animal Health1169567761Isoflurane
Magnesium sulfateSigma-AldrichM2643MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium saltSigma-AldrichD0627db-cAMP
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333KCl
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP5655KH2PO4
RotenoneCayman Chemical Company13995Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761NaHCO3-
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888NaCl
Equipment and materials
12 channel pipette 10-100 μLeppendorfES-12-100
12 channel pipette 50-300 μLvwr613-5257
37 °C, non-CO2 incubatorvwr1545
5 mL cetrifuge tubeseppendorf30119380
50 mL conical centrifuge tubesvwr76211-286
Centrifuge with plate adapterThermo ScientificIEC FL40R
Dissection kitWorld Precision InstrumentsMOUSEKIT
Inverted phase contrast microscope with 40X objectiveNikon
OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, dividedThomas Scientific1159X93
OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, dividedThomas Scientific1159X95
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges.

Ссылки

  1. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
  2. Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
  3. Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
  4. de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
  5. Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
  6. Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
  7. Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
  8. Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
  9. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  10. Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
  11. Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
  12. Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
  13. Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
  14. Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
  15. Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
  16. Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
  17. Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
  18. Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
  19. Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
  20. Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
  21. Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
  22. Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
  23. Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
  24. Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
  25. Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
  26. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены