Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Resumen

Los modelos de metástasis óseas no desarrollan metástasis de manera uniforme o con una incidencia del 100%. La inyección directa de células tumorales intraóseas puede resultar en la embolización del pulmón. Presentamos nuestra técnica de modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso, lo que lleva a un injerto y crecimiento reproducibles.

Resumen

Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos producen lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas. Estas lesiones comprometen la estructura ósea, aumentan el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que con muchos tumores sólidos, las células cancerosas que se han diseminado al hueso pueden ser la fuente principal de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. La mayoría de los modelos de ratón singénico o xenoinjerto de tumores óseos primarios implican la inyección intraósea (ortotópica) de suspensiones de células tumorales. Algunos modelos animales de metástasis esqueléticas de tumores sólidos también dependen de la inyección ósea directa, mientras que otros intentan recapitular pasos adicionales de la cascada metastásica ósea inyectando células por vía intravascular o en el órgano del tumor primario. Sin embargo, ninguno de estos modelos desarrolla metástasis óseas de forma fiable o con una incidencia del 100%. Además, se ha demostrado que la inyección intraósea directa de células tumorales está asociada con una posible embolización tumoral del pulmón. Estas células tumorales embólicas se injertan pero no recapitulan la cascada metastásica. Se informó un modelo de ratón de osteosarcoma en el que se implantan fragmentos tumorales frescos o criopreservados (que consisten en células tumorales más estroma) directamente en la tibia proximal mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Estos animales desarrollaron injertos reproducibles, crecimiento y, con el tiempo, osteólisis y metástasis pulmonares. Esta técnica tiene la versatilidad de ser utilizada para modelar metástasis óseas tumorales sólidas y puede emplear fácilmente injertos que consisten en uno o múltiples tipos de células, células genéticamente modificadas, xenoinjertos derivados de pacientes y / o células marcadas que pueden rastrearse mediante imágenes ópticas o avanzadas. Aquí, demostramos esta técnica, modelando tumores óseos primarios y metástasis óseas utilizando la implantación de injerto de tumor sólido en el hueso.

Introducción

Los modelos de ratón de enfermedades humanas y animales son cada vez más populares en la investigación biomédica. La utilidad de usar ratones en este contexto es que su anatomía y fisiología son muy similares a las de los humanos. Tienen un período de gestación relativamente corto y un tiempo en la vida postnatal para alcanzar la madurez, y se asocian en gran medida con un costo relativamente bajo y facilidad de vivienda, aunque los crecientes costos de desarrollo o compra se asocian con mayores grados de modificación genética, inmunodeficiencia y / o humanización¹. El uso de cepas endogámicas da como resultado una población animal en gran medida uniforme antes de la inclusión en el estudio. Un conocimiento completo de su genoma sugiere un alto grado de similitud con los humanos. Se han identificado objetivos moleculares ortólogos para muchos procesos de enfermedad en el genoma del ratón y ahora existe una extensa biblioteca de reactivos específicos para ratones que se pueden obtener fácilmente. Por lo tanto, brindan la oportunidad de un análisis de rendimiento relativamente alto de una manera más rápida y menos costosa en comparación con los modelos animales más grandes¹. Además, con el advenimiento de estrategias de edición genética que permiten la sobreexpresión o eliminación de ciertos genes, ya sea globalmente o de una manera específica del tipo celular y / o constitutivamente o de manera inducible, representan un sistema modelo muy útil biológicamente para la investigación de enfermedades humanas y animales².

El cáncer es un campo en el que los modelos de ratón tienen una gran utilidad. Los modelos genéticos de cáncer en ratones se basan en la modulación de la expresión de oncogenes o genes supresores de tumores, solos o en combinación, para que las células experimenten una transformación oncogénica. También se realiza la inyección de líneas celulares tumorales primarias o establecidas en ratones. La introducción de líneas celulares o tejidos de humanos u otras especies animales, incluidos ratones, sigue siendo el modelo de cáncer in vivo más utilizado. El uso de células y tejidos de especies disímiles (xenoinjertos) en ratones inmunocomprometidos se realiza con mayor frecuencia². Sin embargo, el uso de células tumorales de aloinjerto o tejidos donde tanto el huésped como el receptor son de la misma especie permite la interacción con un sistema inmune intacto cuando se combina con la misma cepa de ratón huésped en sistemas singénicos³.

Los tumores óseos primarios o metástasis óseas de tumores sólidos dan lugar a lesiones osteolíticas, osteoblásticas o mixtas osteolíticas/osteoblásticas, dolorosas ^3,4. Estos tumores comprometen la estructura ósea, aumentando el riesgo de fractura patológica y dejan a los pacientes con opciones de tratamiento limitadas. Los tumores óseos primarios hacen metástasis a órganos distantes, con algunos tipos capaces de diseminarse a otros sitios esqueléticos. En pacientes con cáncer de mama, el hueso es el sitio más común de la primera metástasis y el primer sitio de presentación más frecuente de la enfermedad metastásica ^5,6. Además, las células tumorales diseminadas (DTC) están presentes en la médula ósea antes del diagnóstico y predicen el desarrollo de metástasis en otros órganos⁷. Por lo tanto, se cree que las células cancerosas presentes en el hueso son la fuente de células que finalmente hacen metástasis a otros sistemas de órganos. Existen muchos modelos de ratón de metástasis tumorales sólidas que desarrollan metástasis predominantemente en el pulmón y los ganglios linfáticos, y dependiendo del tipo de tumor y la técnica de inyección, potencialmente otros sistemas de órganos³. Sin embargo, faltan modelos de metástasis ósea en ratones que produzcan metástasis esqueléticas específicas del sitio de manera confiable y reproducible y desarrollen metástasis óseas antes de que los ratones alcancen los criterios de eliminación temprana de la carga tumoral primaria o metástasis a otros órganos. Hemos reportado un modelo del osteosarcoma tumoral óseo primario que se basa en la implantación quirúrgica de un aloinjerto tumoral sólido en la tibia proximal de ratones⁸. Los tumores óseos se formaron en el 100% de los ratones y el 88% desarrollaron metástasis pulmonar. Esta incidencia de metástasis excede lo que comúnmente se informa clínicamente en personas (~ 20-50%), pero es de gran interés ya que el pulmón es el sitio más común de metástasis para el osteosarcoma 9,10,11. Si bien este modelo es ventajoso para modelar tumores óseos primarios, también tiene una gran utilidad para modelar metástasis óseas de otros tumores sólidos osteotrópicos como tumores de mama, pulmón, próstata, tiroides, hígado, riñón y gastrointestinales.

La justificación para el desarrollo de este modelo fue desarrollar una alternativa a la inyección intraósea tradicional típicamente en la tibia proximal o el fémur distal para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas¹². Nuestro objetivo principal era aliviar una limitación conocida de esta técnica, es decir, la embolización tumoral del pulmón. Esto resulta en el injerto de estas células tumorales embólicas y "metástasis artificarias" que no recapitulan la cascada metastásica completa de un tumor óseo primario establecido que hace metástasis a los pulmones ^8,13. Esta también sería la situación cuando una metástasis ósea establecida se propaga a un sitio distante. Además, esta técnica también se desarrolló para producir un modelo de metástasis ósea que asegurara una mayor incidencia de injertos y crecimiento de tumores en hueso y en un sitio uniforme en comparación con las técnicas de inyección ortotópica o intravascular. Este modelo tiene claras ventajas sobre estas técnicas descritas. Este modelo implica la administración controlada y consistente de células tumorales en el hueso. También evita la metástasis pulmonar artifactual después de la embolización pulmonar y establece una población de estudio uniforme basal. Existe el beneficio de los tumores específicos del sitio con este modelo sin el riesgo de criterios de extirpación temprana resultantes de tumores primarios o metástasis a otros órganos. Por último, este modelo tiene una gran utilidad para la modificación, incluyendo el uso de xenoinjertos derivados de pacientes.

El modelo presentado tiene similitudes con la inyección directa de suspensión celular en el hueso siguiendo un enfoque quirúrgico seguido de inyección a través de la corteza o la administración en la cavidad medular después de hacer un pequeño defecto en la corteza (con o sin escariado de la cavidad medular)8,14,15,16,17 . Sin embargo, la implantación de un aloinjerto tumoral hace que esta técnica sea claramente diferente. Por lo tanto, el propósito de este informe fue demostrar este modelo de tumores óseos primarios y metástasis óseas de tumores sólidos, que supera muchas limitaciones de los modelos descritos anteriormente. Los grupos de investigación con experiencia en cultivo celular, modelos de ratón, anestesia y cirugía de ratón y anatomía de ratón están bien equipados para reproducir nuestra técnica para modelar tumores óseos primarios o metástasis óseas en ratones.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido.

1. Preparación de líneas celulares

1. Cultivar líneas celulares de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo celular del laboratorio para el cultivo celular tradicional o la inyección en ratones. Los protocolos estándar utilizados aquí son el crecimiento en el medio de Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y penicilina / estreptomicina (en lo sucesivo conocido como medio de crecimiento completo).
   NOTA: En este experimento, las células de osteosarcoma de Abrams se utilizan en ratones Balb/c Foxn1 nu/nu . Para los estudios de cáncer de mama, se utilizan células 4T1 en ratones Balb/c y células EO771 en ratones C57BL/6.
2. Cultivar células en frascos de cultivo de tejidos ventilados o en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos a 37 °C con un 5% de_CO2.
3. Pasar la línea celular de interés y preparar las células para la inyección cuando las células alcanzan una confluencia comúnmente utilizada con la inyección de estas células en ratones.

2. Animales

1. Use ratones Balb/c Foxn1 nu/nu al menos de 6-8 semanas de edad para la generación de tumores subcutáneos para asegurarse de que los animales están más allá de la fase de crecimiento rápido y han alcanzado la edad adulta y la madurez esquelética.
2. Use ratones machos o hembras. Haga excepciones al seleccionar líneas celulares sensibles a las hormonas (por ejemplo, células de cáncer de mama en ratones hembra y células de cáncer de próstata en ratones machos).
3. Para experimentos de xenoinjertos, use ratones desnudos atímicos inmunodeficientes basados en que la línea celular es incompatible con un sistema inmune de ratón intacto en condiciones normales.
4. Para experimentos de aloinjertos utilizando líneas celulares murinas, esto también se recomienda en función de diferentes antecedentes genéticos e inmunes de ratón. Sin embargo, para experimentos singénicos, use animales de la misma cepa que la línea celular de interés.
5. Animales domésticos en densidades estándar dependiendo de las políticas de cría de la institución.

3. Tumores subcutáneos

1. Cosechar líneas celulares de cultivo mediante tripsinización y resuspender en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
2. Evaluar la viabilidad celular y determinar la densidad celular mediante el método de exclusión de azul de tripano. Use un hemocitómetro o un contador celular automatizado para contar las células. Se debe utilizar una viabilidad celular mínima del 90% para inyección en ratones para crear tumores subcutáneos.
3. Ajuste la densidad celular para inyectar 1-2 x 10⁵ células en un volumen final de 0.1 a 0.15 ml (100 a 150 μL) de PBS estéril. Mantenga las células en hielo hasta la inyección.
4. Alternativamente, las células de pellet por centrifugación a 800 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y volver a suspender las células peletizadas en un medio de matriz de membrana basal estéril sin diluir para obtener 1-2 x 10⁵ células en un volumen final de 0,1 a 0,15 ml (100 a 150 μL). Mantenga las células en hielo hasta que se sigan usando.
5. Anestesiar ratones para ser utilizados para el crecimiento tumoral subcutáneo con isoflurano en anestesia con oxígeno. Utilizar una dosis de inducción de isoflurano al 5% en 2 L/min de oxígeno y una dosis de mantenimiento de 2-3% de isoflurano en 2 L/min de oxígeno. Compruebe la falta de reflejos de parpadeo o pedal antes de continuar.
   NOTA: El isoflurano es un anestésico inhalatorio. Use isoflurano en un área bien ventilada con sistemas apropiados de recolección de gases libres y eliminación. Consulte con el personal veterinario institucional para desarrollar un plan para la inducción, mantenimiento y monitoreo de la anestesia, y asegúrese de que el personal del laboratorio tenga la capacitación adecuada en el monitoreo de la anestesia y el manejo de agentes anestésicos inhalantes.
6. Retire el vello de la región dorsal del tórax o el abdomen de ratones anestesiados con solución depilatoria o con un cortapelos eléctrico. Se prefiere la solución depilatoria para minimizar el trauma potencial en la piel. Omita este paso si usa ratones desnudos atímicos.
7. Limpie el área preparada con un hisopo de etanol al 70% antes de la inyección de la suspensión celular.
8. Use una jeringa de tuberculina de 1 ml con una aguja de 27 G para inyectar células por vía subcutánea sobre la región dorsal del tórax o el abdomen, para que no se vean afectadas por el movimiento de los omóplatos. Alternativamente, inyecte las células por vía subcutánea como una suspensión en la matriz extracelular disponible comercialmente.
   NOTA: La inyección en la matriz extracelular disponible comercialmente limitará la migración de la suspensión celular en el espacio subcutáneo porque estas matrices se solidifican a temperatura ambiente.
9. Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio. Los ratones pueden ser colocados en sus jaulas normales con ropa de cama limpia y seca.
10. Monitorear el tamaño del tumor subcutáneo que recubre el tórax dorsal o el abdomen con un calibrador y medir el peso corporal semanalmente para asegurar que los tumores subcutáneos no se ulceren o que los ratones cumplan con los criterios de extracción temprana establecidos por el comité de cuidado y uso de animales de las instituciones. Se recomienda un tamaño máximo del tumor de 15 mm en cualquier dimensión para reducir el riesgo de ulceración cutánea o necrosis tumoral central.
    NOTA: Consulte las pautas locales para determinar el tamaño/volumen máximo permisible del tumor.
11. Eutanasia a ratones portadores de tumores subcutáneos después de tres a cuatro semanas por inhalación de_CO2 seguida de luxación cervical. Siga las políticas aceptables de la institución para la eutanasia de ratón.
12. Cosechar tumores subcutáneos mediante técnica quirúrgica aséptica. Esterilice la piel que recubre el tumor como antes con etanol al 70% después de la eliminación del vello (si corresponde). Incide a través de la piel que recubre el tumor con una hoja de bisturí # 15 (con o sin un mango de hoja de bisturí). Diseccionar bruscamente el tumor de los tejidos blandos adjuntos circundantes con un par de tijeras quirúrgicas estériles.
13. Coloque el tumor en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos que contengan un medio de crecimiento completo y pique en múltiples fragmentos pequeños de tamaño predeterminado (~ 0.6 mm x 0.6 mm x 0.6 mm – 0.25 mm 3 hasta 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm³) con una hoja de bisturí #15 (con o sin mango de hoja de bisturí).
14. Mantener los fragmentos tumorales en medio de crecimiento completo estéril a temperatura ambiente hasta el momento de la implantación intratibial. Para las líneas celulares que portan luciferasa o genes reporteros fluorescentes, use imágenes bioluminiscentes o fluorescentes ex vivo para confirmar la viabilidad del tumor antes de la implantación intratibial en ratones.
15. Para la criopreservación, coloque múltiples fragmentos en el mismo criovial en un medio de crecimiento completo suplementado con 20% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar gradualmente utilizando un sistema de criopreservación comercial a –80 °C y almacenar a largo plazo en nitrógeno líquido. Preservar los fragmentos tumorales para su posterior análisis, pero no para su futura implantación, mediante congelación rápida mediante inmersión en nitrógeno líquido. Almacene estos fragmentos tumorales congelados a largo plazo a –80 °C.
    NOTA: Se ha informado previamente que los tumores congelados a presión no se injertan y crecen in vivo⁸.

4. Implantación quirúrgica de fragmentos tumorales subcutáneos

1. Llevar los fragmentos frescos o criopreservados del tumor subcutáneo a temperatura ambiente en un medio de crecimiento completo antes de la implantación quirúrgica.
2. Anestesiar ratones de la cepa de interés utilizando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describe en la Sección 3. Compruebe la falta de reflejos del pedal antes de continuar. Administrar buprenorfina subcutánea a una dosis de 0,02-0,05 mg/kg para proporcionar analgesia perioperatoria. Esto se puede repetir cada 6-8 h en el período postoperatorio, si es necesario.
3. Elimine el vello de la articulación de la rodilla derecha y la tibia proximal de la extremidad posterior con una solución depilatoria para minimizar el posible trauma en la piel.
4. Frote el área preparada con antiséptico quirúrgico. Frote primero con un hisopo de etanol al 70% y luego frote con clorhexidina alterna y exfoliante salino.
5. Visualice la tibia proximal como la región distal a la articulación de la rodilla mientras flexiona y extiende la articulación.
6. Cree una incisión de 3-4 mm a nivel de la tibia proximal en la cara medial de la extremidad con una hoja de bisturí # 15 (con o sin mango de hoja de bisturí). Incisar a través de la piel y el tejido subcutáneo para exponer la corteza medial de la tibia proximal.
7. Aplique una presión suave con la punta de una aguja de 25 G, mientras gira la punta, para crear un pequeño orificio en la corteza medial de la tibia proximal. Haga este orificio aproximadamente 2 mm distal a la articulación de la rodilla en un punto equidistante entre las cortezas tibiales craneal y caudal. Seleccione el tamaño de la aguja según el tamaño de los fragmentos del tumor.
8. Use fórceps estériles para recoger e insertar los fragmentos tumorales en la cavidad medular de la tibia proximal. Use una aguja de 27 a 30 G para manipular el fragmento tumoral en el canal medular. Dependiendo del tamaño de los fragmentos del tumor, implante un mínimo de 0,5 mm³ de volumen tumoral total en cada tibia. Esto puede requerir la implantación de 1 o más fragmentos tumorales dependiendo del tamaño de los fragmentos tumorales creados.
   NOTA: Las modificaciones para prevenir o limitar el desplazamiento del injerto fuera del hueso serían la colocación de cera ósea o cemento óseo en el defecto óseo o espuma de gel o un injerto de grasa subcutánea sobre el orificio en el hueso.
9. Coloque los bordes de la piel con adhesivo de tejido líquido estéril o una sola sutura de piel. No utilice clips para heridas en este sitio. Tenga cuidado si utiliza imágenes de fluorescencia en el período postoperatorio, ya que tanto los adhesivos tisulares como la sutura tienen el potencial de fluorescer.
10. Recuperar los ratones en una almohadilla térmica en jaulas individuales hasta que sea ambulatorio.

5. Evaluación en serie y de punto final

1. Anestesiar ratones usando isoflurano en anestesia con oxígeno como se describió anteriormente.
2. Evaluar el crecimiento del tumor tibial de forma no invasiva mediante radiografía digital semanal, bioluminiscencia o imágenes de fluorescencia (si se utilizan células que expresan luciferasa o un gen reportero fluorescente). Las mediciones de calibre de la extremidad en el sitio de implantación también se pueden realizar en ratones despiertos.
3. Además del monitoreo tradicional de ratones portadores de tumores (peso corporal, nivel de actividad, frecuencia respiratoria, aseo, postura, mentalidad y comportamiento), monitoree a los ratones semanalmente para detectar signos de cojera de las extremidades posteriores, hinchazón e infección del sitio quirúrgico.
4. Controle la herida quirúrgica de la piel durante los primeros 10-14 días para detectar enrojecimiento excesivo, hinchazón, drenaje y dehiscencia de la herida hasta que la herida cutánea se cure. Después de 4-5 semanas, evalúe a los ratones de acuerdo con la evaluación de los resultados del estudio, ya sea vivos o después de la eutanasia.

Resultados

Un resultado positivo se asociaría con el injerto tumoral y el crecimiento tumoral progresivo a lo largo del tiempo. Dependiendo del tipo de tumor, el crecimiento tumoral intraóseo puede estar asociado con cojera progresiva de las extremidades posteriores, pero muchos tumores no causan cojera a pesar de los signos de enfermedad ósea concomitante. El injerto exitoso se documentó con imágenes avanzadas, por lo que habría cambios radiográficos, μCT o μMRI progresivos en la tibia proximal asociados con el fenotipo ?...

Discusión

Este informe documenta nuestro modelo para crear tumores óseos primarios o metástasis óseas después de la implantación intratibial de un aloinjerto tumoral. Creemos que hay varios pasos críticos en este proceso. Se debe establecer un plano anestésico seguro tanto para la inyección subcutánea de la suspensión de células tumorales como para la colocación intratibial de los fragmentos tumorales resultantes. Debe haber una preparación estéril del sitio quirúrgico tanto para la extracción del aloinjerto subcut...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed