Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Résumé

Les modèles de métastases osseuses ne développent pas de métastases uniformément ou avec une incidence de 100%. L’injection directe de cellules tumorales intra-osseuses peut entraîner une embolisation du poumon. Nous présentons notre technique de modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses en utilisant l’implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os, conduisant à une greffe et une croissance reproductibles.

Résumé

Les tumeurs osseuses primaires ou les métastases osseuses des tumeurs solides entraînent des lésions ostéolytiques, ostéoblastiques ou mixtes ostéolytiques / ostéoblastiques douloureuses. Ces lésions compromettent la structure osseuse, augmentent le risque de fracture pathologique et laissent aux patients des options de traitement limitées. Les tumeurs osseuses primaires métastasent à des organes distants, certains types pouvant se propager à d’autres sites squelettiques. Cependant, des preuves récentes suggèrent qu’avec de nombreuses tumeurs solides, les cellules cancéreuses qui se sont propagées aux os peuvent être la principale source de cellules qui finissent par métastaser à d’autres systèmes organiques. La plupart des modèles murins syngéniques ou xénogreffés de tumeurs osseuses primaires impliquent une injection intra-osseuse (orthotopique) de suspensions de cellules tumorales. Certains modèles animaux de métastases squelettiques à partir de tumeurs solides dépendent également de l’injection osseuse directe, tandis que d’autres tentent de récapituler des étapes supplémentaires de la cascade métastatique osseuse en injectant des cellules par voie intravasculaire ou dans l’organe de la tumeur primaire. Cependant, aucun de ces modèles ne développe de métastases osseuses de manière fiable ou avec une incidence de 100%. En outre, il a été démontré que l’injection intra-osseuse directe de cellules tumorales est associée à une embolisation tumorale potentielle du poumon. Ces cellules tumorales emboliques se greffent mais ne récapitulent pas la cascade métastatique. Nous avons rapporté un modèle murin d’ostéosarcome dans lequel des fragments tumoraux frais ou cryoconservés (constitués de cellules tumorales et de stroma) sont implantés directement dans le tibia proximal à l’aide d’une technique chirurgicale mini-invasive. Ces animaux ont développé une greffe reproductible, une croissance et, au fil du temps, une ostéolyse et des métastases pulmonaires. Cette technique a la polyvalence d’être utilisée pour modéliser les métastases osseuses tumorales solides et peut facilement utiliser des greffes constituées d’un ou de plusieurs types de cellules, de cellules génétiquement modifiées, de xénogreffes dérivées de patients et / ou de cellules marquées qui peuvent être suivies par imagerie optique ou avancée. Ici, nous démontrons cette technique, en modélisant les tumeurs osseuses primaires et les métastases osseuses en utilisant l’implantation de greffe de tumeur solide dans l’os.

Introduction

Les modèles murins de maladies humaines et animales sont de plus en plus populaires dans la recherche biomédicale. L’utilité de l’utilisation de souris dans ce contexte est que leur anatomie et leur physiologie sont très similaires à celles des humains. Ils ont une période de gestation relativement courte et une période de vie postnatale pour atteindre la maturité, et sont largement associés à un coût relativement faible et à une facilité de logement, bien que l’augmentation des coûts de développement ou d’achat soit associée à des degrés plus élevés de modification génétique, d’immunodéficience et / ou d’humanisation¹. L’utilisation de souches consanguines permet d’obtenir une population animale largement uniforme avant l’inclusion dans l’étude. Une connaissance complète de leur génome suggère un haut degré de similitude avec les humains. Des cibles moléculaires orthologues pour de nombreux processus pathologiques ont été identifiées dans le génome de la souris et il existe maintenant une vaste bibliothèque de réactifs spécifiques à la souris qui sont facilement disponibles. Par conséquent, ils offrent la possibilité d’une analyse à débit relativement élevé d’une manière plus rapide et moins coûteuse par rapport aux modèles animaux plus grands¹. De plus, avec l’avènement des stratégies d’édition génétique qui permettent la surexpression ou la délétion de certains gènes soit globalement, soit de manière spécifique à un type cellulaire et/ou de manière constitutive ou inductible, ils représentent un système modèle très utile biologiquement pour l’investigation des maladies humaines et animales².

Le cancer est un domaine dans lequel les modèles murins ont une grande utilité. Les modèles génétiques murins de cancer reposent sur la modulation de l’expression des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs, seuls ou en combinaison, pour que les cellules subissent une transformation oncogénique. L’injection de lignées cellulaires tumorales primaires ou établies chez la souris est également effectuée. L’introduction de lignées cellulaires ou de tissus provenant d’humains ou d’autres espèces animales, y compris les souris, reste le modèle de cancer le plus largement utilisé in vivo. L’utilisation de cellules et de tissus d’espèces différentes (xénogreffes) chez des souris immunodéprimées est le plus souvent réalisée². Cependant, l’utilisation de cellules ou de tissus tumoraux allogreffés où l’hôte et le receveur sont de la même espèce permet l’interaction avec un système immunitaire intact lorsqu’il est combiné avec la même souche de souris hôte dans les systèmes syngéniques³.

Les tumeurs osseuses primitives ou les métastases osseuses des tumeurs solides entraînent des lésions ostéolytiques, ostéoblastiques ou mixtes ostéolytiques / ostéoblastiques^{douloureuses 3,4}. Ces tumeurs compromettent la structure osseuse, augmentant le risque de fracture pathologique, et laissent les patients avec des options de traitement limitées. Les tumeurs osseuses primaires métastasent à des organes distants, certains types pouvant se propager à d’autres sites squelettiques. Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein, l’os est le site le plus fréquent de première métastase et le premier site de présentation le plus fréquent de la maladie métastatique ^5,6. En outre, des cellules tumorales disséminées (DTC) sont présentes dans la moelle osseuse avant le diagnostic et prédisent le développement de métastases dans d’autres organes⁷. Par conséquent, on croit que les cellules cancéreuses présentes dans les os sont la source de cellules qui finissent par métastaser à d’autres systèmes organiques. Il existe de nombreux modèles murins de métastases tumorales solides qui développent des métastases principalement dans les poumons et les ganglions lymphatiques et, selon le type de tumeur et la technique d’injection, potentiellement d’autres systèmes organiques³. Cependant, il manque des modèles murins de métastases osseuses qui produisent de manière fiable et reproductible des métastases squelettiques spécifiques au site et développent des métastases osseuses avant que les souris n’atteignent les critères d’élimination précoce de la charge tumorale primaire ou des métastases à d’autres organes. Nous avons rapporté un modèle de l’ostéosarcome de la tumeur osseuse primitive qui repose sur l’implantation chirurgicale d’une allogreffe de tumeur solide dans le tibia proximal de souris⁸. Les tumeurs osseuses se sont formées chez 100% des souris et 88% ont développé des métastases pulmonaires. Cette incidence de métastases dépasse ce qui est couramment rapporté cliniquement chez les personnes (~20-50%), mais est d’un grand intérêt puisque le poumon est le site le plus fréquent de métastases pour l’ostéosarcome 9,10,11. Bien que ce modèle soit avantageux dans la modélisation des tumeurs osseuses primaires, il a également une grande utilité dans la modélisation des métastases osseuses à partir d’autres tumeurs solides ostéotropes telles que les tumeurs du sein, du poumon, de la prostate, de la thyroïde, hépatiques, rénales et gastro-intestinales.

La raison d’être du développement de ce modèle était de développer une alternative à l’injection intra-osseuse traditionnelle typiquement dans le tibia proximal ou le fémur distal pour modéliser les tumeurs osseuses primaires ou les métastases osseuses¹². Notre objectif principal était d’atténuer une limitation connue de cette technique, à savoir l’embolisation tumorale du poumon. Il en résulte la greffe de ces cellules tumorales emboliques et des « métastases artéfactuelles » qui ne récapitulent pas la cascade métastatique complète d’une tumeur osseuse primitive établie qui métastase aux poumons ^8,13. Ce serait également la situation lorsqu’une métastase osseuse établie se propage à un site éloigné. En outre, cette technique a également été développée pour produire un modèle de métastases osseuses qui assurerait une plus grande incidence de greffe et de croissance des tumeurs dans l’os et à un site uniforme par rapport aux techniques d’injection orthotopique ou intravasculaire. Ce modèle présente des avantages distincts par rapport à ces techniques décrites. Ce modèle implique une livraison contrôlée et cohérente des cellules tumorales dans l’os. Il évite également les métastases pulmonaires artificielles après une embolisation pulmonaire et établit une population d’étude uniforme de base. Il y a l’avantage des tumeurs spécifiques au site avec ce modèle sans le risque de critères d’élimination précoce résultant de tumeurs primaires ou de métastases à d’autres organes. Enfin, ce modèle a une grande utilité pour la modification, y compris l’utilisation de xénogreffes dérivées de patients.

Le modèle présenté présente des similitudes avec l’injection directe de suspension cellulaire dans l’os à la suite d’une approche chirurgicale suivie soit d’une injection à travers le cortex, soit d’une administration dans la cavité médullaire après avoir fait un petit défaut dans le cortex (avec ou sans alésage de la cavité médullaire)8,14,15,16,17 . Cependant, l’implantation d’une allogreffe tumorale rend cette technique nettement différente. Par conséquent, le but de ce rapport était de démontrer ce modèle de tumeurs osseuses primaires et de métastases osseuses à partir de tumeurs solides, qui surmonte de nombreuses limitations des modèles décrits précédemment. Les groupes de recherche ayant de l’expérience dans la culture cellulaire, les modèles murins, l’anesthésie et la chirurgie de la souris, et l’anatomie de la souris sont bien équipés pour reproduire notre technique de modélisation des tumeurs osseuses primaires ou des métastases osseuses chez la souris.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Cambridge, Cambridge, Royaume-Uni.

1. Préparation des lignées cellulaires

1. Cultiver des lignées cellulaires conformément aux protocoles de culture cellulaire standard du laboratoire pour la culture cellulaire traditionnelle ou l’injection chez la souris. Les protocoles standard utilisés ici sont la croissance dans le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de pénicilline / streptomycine (ci-après connu sous le nom de milieu de croissance complet).
   NOTE: Dans cette expérience, les cellules d’ostéosarcome d’Abrams sont utilisées chez les souris Balb / c Foxn1 nu / nu . Pour les études sur le cancer du sein, les cellules 4T1 chez les souris Balb/c et les cellules EO771 chez les souris C57BL/6 sont utilisées.
2. Faire pousser des cellules dans des flacons de culture tissulaire ventilés ou des plaques de culture tissulaire à 6 puits à 37 °C dans 5 % de CO₂.
3. Passage de la lignée cellulaire d’intérêt et préparation des cellules pour l’injection lorsque les cellules atteignent une confluence couramment utilisée avec l’injection de ces cellules chez la souris.

2. Animaux

1. Utilisez des souris Balb/c Foxn1 nu/nu âgées d’au moins 6 à 8 semaines pour la génération de tumeurs sous-cutanées afin de vous assurer que les animaux ont dépassé la phase de croissance rapide et ont atteint l’âge adulte et la maturité squelettique.
2. Utilisez des souris mâles ou femelles. Faites des exceptions lors de la sélection de lignées cellulaires hormono-sensibles (p. ex. cellules cancéreuses du sein chez les souris femelles et cellules cancéreuses de la prostate chez les souris mâles).
3. Pour les expériences de xénogreffe, utiliser des souris nues athymiques immunodéficientes basées sur l’incompatibilité de la lignée cellulaire avec un système immunitaire de souris intact dans des conditions normales.
4. Pour les expériences d’allogreffe utilisant des lignées cellulaires murines, cela est également recommandé en fonction des antécédents génétiques et immunitaires dissemblables de la souris. Cependant, pour les expériences syngéniques, utilisez des animaux de la même souche que la lignée cellulaire d’intérêt.
5. Animaux domestiques à des densités standard en fonction des politiques d’élevage de l’institution.

3. Tumeurs sous-cutanées

1. Récolter des lignées cellulaires de culture par trypsinisation et les remettre en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile.
2. Évaluer la viabilité cellulaire et déterminer la densité cellulaire par la méthode d’exclusion du bleu de trypan. Utilisez un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules. Une viabilité cellulaire minimale de 90% doit être utilisée pour l’injection chez la souris afin de créer des tumeurs sous-cutanées.
3. Ajuster la densité cellulaire pour injecter 1-2 x 10⁵ cellules dans un volume final de 0,1 à 0,15 mL (100 à 150 μL) de PBS stérile. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à l’injection.
4. Alternativement, les cellules de pastilles par centrifugation à 800 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées dans un milieu matriciel membranaire stérile non dilué pour obtenir 1-2 x 10⁵ cellules dans un volume final de 0,1 à 0,15 mL (100 à 150 μL). Gardez les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées à nouveau.
5. Anesthésier les souris à utiliser pour la croissance tumorale sous-cutanée avec de l’isoflurane dans l’anesthésie à l’oxygène. Utiliser une dose d’induction de 5 % d’isoflurane dans 2 L/min d’oxygène et une dose d’entretien de 2 à 3 % d’isoflurane dans 2 L/min d’oxygène. Vérifiez l’absence de réflexes de clignement ou de pédale avant de continuer.
   REMARQUE : L’isoflurane est un anesthésique inhalé. Utiliser l’isoflurane dans un endroit bien ventilé doté de systèmes appropriés de récupération et de collecte libre des gaz. Veuillez consulter le personnel vétérinaire de l’établissement pour élaborer un plan pour l’induction, l’entretien et la surveillance de l’anesthésie, et vous assurer que le personnel de laboratoire a reçu une formation appropriée sur la surveillance de l’anesthésie et la manipulation des agents anesthésiques inhalés.
6. Retirez les poils de la région dorsale du thorax ou de l’abdomen des souris anesthésiées avec une solution d’épilation ou avec une tondeuse électrique. La solution d’épilation est préférée pour minimiser les traumatismes potentiels de la peau. Ignorez cette étape si vous utilisez des souris nues athymiques.
7. Nettoyez la zone préparée avec un tampon d’éthanol à 70% avant l’injection de la suspension cellulaire.
8. Utilisez une seringue tuberculine de 1 mL avec une aiguille de 27 G pour injecter des cellules par voie sous-cutanée sur la région dorsale du thorax ou de l’abdomen, afin de ne pas être affectée par le mouvement des omoplates. Alternativement, injecter les cellules par voie sous-cutanée sous forme de suspension dans la matrice extracellulaire disponible dans le commerce.
   NOTE: L’injection dans la matrice extracellulaire disponible dans le commerce limitera la migration de la suspension cellulaire dans l’espace sous-cutané car ces matrices se solidifient à température ambiante.
9. Récupérer les souris sur un coussin chauffant dans des cages individuelles jusqu’à ce qu’elles soient ambulatoires. Les souris peuvent ensuite être placées dans leurs cages normales avec une litière propre et sèche.
10. Surveiller la taille de la tumeur sous-cutanée recouvrant le thorax dorsal ou l’abdomen avec un pied à coulisse et mesurer le poids corporel chaque semaine pour s’assurer que les tumeurs sous-cutanées ne s’ulcérent pas ou que les souris répondent aux critères d’élimination précoce établis par le comité de soin et d’utilisation des animaux des institutions. Une taille maximale de tumeur de 15 mm dans n’importe quelle dimension est recommandée pour réduire le risque d’ulcération de la peau ou de nécrose tumorale centrale.
    REMARQUE: Consultez les directives locales pour déterminer la taille / volume maximal admissible de la tumeur.
11. Euthanasier des souris porteuses de tumeurs sous-cutanées après trois à quatre semaines par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale. Suivez les politiques acceptables de l’établissement en matière d’euthanasie des souris.
12. Récolter les tumeurs sous-cutanées en utilisant la technique chirurgicale aseptique. Stérilisez la peau recouvrant la tumeur comme avant avec de l’éthanol à 70% après l’épilation (le cas échéant). Inciser à travers la peau recouvrant la tumeur avec une lame de scalpel #15 (avec ou sans poignée de lame de scalpel). Disséquer brusquement la tumeur des tissus mous environnants attachés avec une paire de ciseaux chirurgicaux stériles.
13. Placez la tumeur dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant un milieu de croissance complet et hachez-la en plusieurs petits fragments de taille prédéterminée (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm 3 jusqu’à 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm³) avec une lame de scalpel #15 (avec ou sans poignée de lame de scalpel).
14. Maintenir les fragments tumoraux dans un milieu de croissance complet stérile à température ambiante jusqu’au moment de l’implantation intratibiale. Pour les lignées cellulaires porteuses de gènes rapporteurs de luciférase ou fluorescents, utilisez l’imagerie bioluminescente ou fluorescente ex vivo pour confirmer la viabilité tumorale avant l’implantation intratibiale chez la souris.
15. Pour la cryoconservation, placer plusieurs fragments dans le même cryovial dans un milieu de croissance complet complété par 20% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Congeler graduellement à l’aide d’un système de cryoconservation commercial à –80 °C et conserver à long terme dans de l’azote liquide. Conserver les fragments tumoraux pour une analyse ultérieure, mais pas pour une implantation future, par congélation instantanée par immersion à l’azote liquide. Conservez ces fragments tumoraux congelés à long terme à -80 °C.
    REMARQUE: Il a déjà été rapporté que les tumeurs congelées ne se grefferont pas et ne se développeront pas in vivo⁸.

4. Implantation chirurgicale de fragments de tumeur sous-cutanée

1. Apporter des fragments frais ou cryoconservés de tumeur sous-cutanée à température ambiante dans un milieu de croissance complet avant l’implantation chirurgicale.
2. Anesthésier les souris de la souche d’intérêt à l’aide d’isoflurane en anesthésie à l’oxygène, comme décrit à la rubrique 3. Vérifiez l’absence de réflexes de pédale avant de continuer. Administrer de la buprénorphine sous-cutanée à une dose de 0,02 à 0,05 mg / kg pour fournir une analgésie périopératoire. Cela peut être répété toutes les 6-8 heures dans la période post-opératoire, si nécessaire.
3. Enlevez les poils de l’articulation du genou droit et du tibia proximal du membre postérieur avec une solution d’épilation pour minimiser le traumatisme potentiel de la peau.
4. Frottez la zone préparée avec un antiseptique chirurgical. Frotter d’abord avec un tampon à 70% d’éthanol, puis frotter avec une alternance de chlorhexidine et de gommage salin.
5. Visualisez le tibia proximal comme la région juste distale à l’articulation du genou tout en fléchissant et en étendant l’articulation.
6. Créez une incision de 3-4 mm au niveau du tibia proximal sur la face médiale du membre avec une lame de scalpel #15 (avec ou sans manche de lame de scalpel). Inciser à travers la peau et le tissu sous-cutané pour exposer le cortex médial du tibia proximal.
7. Appliquez une légère pression avec la pointe d’une aiguille de 25 G, tout en tournant la pointe, pour créer un petit trou dans le cortex médial du tibia proximal. Faites ce trou d’environ 2 mm distal à l’articulation du genou en un point équidistant entre les cortex tibial crânien et caudal. Sélectionnez la taille de l’aiguille en fonction de la taille des fragments tumoraux.
8. Utilisez des pinces stériles pour ramasser et insérer les fragments de tumeur dans la cavité médullaire du tibia proximal. Utilisez une aiguille de 27 à 30 G pour manipuler le fragment de tumeur dans le canal médullaire. Selon la taille des fragments tumoraux, implanter un minimum de 0,5 mm³ volume tumoral total dans chaque tibia. Cela peut nécessiter l’implantation de 1 ou plusieurs fragments tumoraux en fonction de la taille des fragments tumoraux créés.
   NOTE: Les modifications visant à prévenir ou à limiter le déplacement du greffon à l’extérieur de l’os consisteraient à placer de la cire osseuse ou du ciment osseux dans le défaut osseux ou une mousse de gel ou une greffe de graisse sous-cutanée sur le trou dans l’os.
9. Apposez les bords de la peau avec un adhésif liquide stérile ou une seule suture de peau. N’utilisez pas de clips de plaie sur ce site. Soyez prudent si vous utilisez l’imagerie par fluorescence dans la période postopératoire, car les adhésifs tissulaires et la suture ont le potentiel de devenir fluorescents.
10. Récupérer les souris sur un coussin chauffant dans des cages individuelles jusqu’à ce qu’elles soient ambulatoires.

5. Évaluation en série et évaluation finale

1. Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane dans l’anesthésie à l’oxygène comme décrit précédemment.
2. Évaluer la croissance tumorale tibiale de manière non invasive par radiographie numérique hebdomadaire, bioluminescence ou imagerie par fluorescence (si vous utilisez des cellules exprimant la luciférase ou un gène rapporteur fluorescent). Les mesures de l’étrier du membre au site d’implantation peuvent également être effectuées chez des souris éveillées.
3. En plus de la surveillance traditionnelle des souris porteuses de tumeurs (poids corporel, niveau d’activité, fréquence respiratoire, toilettage, posture, mentalité et comportement), surveillez les souris chaque semaine pour détecter les signes de boiterie des membres postérieurs, d’enflure et d’infection du site chirurgical.
4. Surveillez la plaie chirurgicale cutanée pendant les 10 à 14 premiers jours pour détecter toute rougeur excessive, gonflement, drainage et déhiscence de la plaie jusqu’à ce que la plaie cutanée soit guérie. Après 4-5 semaines, évaluer les souris conformément à l’évaluation des résultats de l’étude, vivantes ou après l’euthanasie.

Résultats

Un résultat positif serait associé à la greffe de tumeur et à la croissance tumorale progressive au fil du temps. Selon le type de tumeur, la croissance tumorale intraosseuse peut être associée à une boiterie progressive des membres postérieurs, mais de nombreuses tumeurs ne provoquent pas de boiterie malgré les signes de maladie osseuse associée. La réussite de la greffe a été documentée par imagerie avancée, où il y aurait des changements progressifs de la radiographie, de la μCT ou de l’IRM dans le ...

Discussion

Ce rapport documente notre modèle pour créer des tumeurs osseuses primaires ou des métastases osseuses suite à l’implantation intratibiale d’une allogreffe tumorale. Nous pensons qu’il y a plusieurs étapes critiques dans ce processus. Un plan anesthésique sûr doit être établi à la fois pour l’injection sous-cutanée de la suspension de cellules tumorales et le placement intratibial des fragments tumoraux résultants. Il doit y avoir une préparation stérile du site chirurgical pour le retrait de l’al...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed