Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Riepilogo

I modelli di metastasi ossee non sviluppano metastasi in modo uniforme o con un'incidenza del 100%. L'iniezione diretta di cellule tumorali intra-ossee può provocare l'embolizzazione del polmone. Presentiamo la nostra tecnica di modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso, portando a attecchimento e crescita riproducibili.

Abstract

I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o osteolitiche / osteoblastiche miste. Queste lesioni compromettono la struttura ossea, aumentano il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che con molti tumori solidi, le cellule tumorali che si sono diffuse alle ossa possono essere la fonte primaria di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. La maggior parte dei modelli murini singeneici o xenograft di tumori ossei primari comportano l'iniezione intra-ossea (ortotopica) di sospensioni di cellule tumorali. Alcuni modelli animali di metastasi scheletriche da tumori solidi dipendono anche dall'iniezione ossea diretta, mentre altri tentano di ricapitolare ulteriori passaggi della cascata metastatica ossea iniettando cellule intravascolarmente o nell'organo del tumore primario. Tuttavia, nessuno di questi modelli sviluppa metastasi ossee in modo affidabile o con un'incidenza del 100%. Inoltre, è stato dimostrato che l'iniezione intraossea diretta di cellule tumorali è associata a una potenziale embolizzazione tumorale del polmone. Queste cellule tumorali emboliche si innestano ma non ricapitolano la cascata metastatica. Abbiamo riportato un modello murino di osteosarcoma in cui frammenti tumorali freschi o crioconservati (costituiti da cellule tumorali più stroma) vengono impiantati direttamente nella tibia prossimale utilizzando una tecnica chirurgica minimamente invasiva. Questi animali hanno sviluppato attecchimento riproducibile, crescita e, nel tempo, osteolisi e metastasi polmonari. Questa tecnica ha la versatilità per essere utilizzata per modellare metastasi ossee tumorali solide e può facilmente impiegare innesti costituiti da uno o più tipi di cellule, cellule geneticamente modificate, xenotrapianti derivati dal paziente e / o cellule marcate che possono essere monitorate mediante imaging ottico o avanzato. Qui, dimostriamo questa tecnica, modellando i tumori ossei primari e le metastasi ossee utilizzando l'impianto di innesto tumorale solido nell'osso.

Introduzione

I modelli murini di malattie umane e animali stanno diventando sempre più popolari nella ricerca biomedica. L'utilità di usare i topi in questo contesto è che la loro anatomia e fisiologia sono molto simili agli esseri umani. Hanno un periodo di gestazione relativamente breve e un tempo nella vita post-natale per raggiungere la maturità e sono in gran parte associati a un costo relativamente basso e alla facilità di alloggio, sebbene l'aumento dei costi di sviluppo o acquisto sia associato a maggiori gradi di modificazione genetica, immunodeficienza e / o umanizzazione¹. L'uso di ceppi inbred si traduce in una popolazione animale ampiamente uniforme prima dell'inclusione nello studio. Una conoscenza completa del loro genoma suggerisce un alto grado di somiglianza con gli esseri umani. Nel genoma del topo sono stati identificati bersagli molecolari ortologhi per molti processi patologici e ora esiste una vasta libreria di reagenti specifici per il topo che sono facilmente ottenibili. Pertanto, offrono l'opportunità di analisi a produttività relativamente elevata in modo più rapido e meno costoso rispetto ai modelli animali più grandi¹. Inoltre, con l'avvento di strategie di editing genetico che consentono la sovraespressione o la delezione di determinati geni sia globalmente che in modo specifico di un tipo cellulare e/o costitutivamente o in modo inducibile, rappresentano un sistema modello biologicamente molto utile per lo studio delle malattie umane e animali².

Il cancro è un campo in cui i modelli murini hanno una grande utilità. I modelli genetici murini di cancro si basano sulla modulazione dell'espressione di oncogeni o geni oncosoppressori, da soli o in combinazione, affinché le cellule subiscano una trasformazione oncogena. Viene eseguita anche l'iniezione di linee cellulari tumorali primarie o stabilite nei topi. L'introduzione di linee cellulari o tessuti da esseri umani o altre specie animali, compresi i topi, rimane il modello di cancro più utilizzato in vivo. L'uso di cellule e tessuti di specie dissimili (xenotrapianti) in topi immunocompromessi è più comunemente eseguito². Tuttavia, l'uso di cellule o tessuti tumorali allogenici in cui sia l'ospite che il ricevente sono della stessa specie consente l'interazione con un sistema immunitario intatto quando combinato con lo stesso ceppo di topo ospite nei sistemi singeneici³.

I tumori ossei primari o le metastasi ossee da tumori solidi provocano lesioni osteolitiche, osteoblastiche o miste osteolitiche/osteoblastiche dolorose ^3,4. Questi tumori compromettono la struttura ossea, aumentando il rischio di fratture patologiche e lasciano i pazienti con opzioni di trattamento limitate. I tumori ossei primari metastatizzano in organi distanti, con alcuni tipi in grado di diffondersi ad altri siti scheletrici. Nelle pazienti con carcinoma mammario, l'osso è il sito più comune di prima metastasi e il più frequente primo sito di presentazione della malattia metastatica ^5,6. Inoltre, le cellule tumorali disseminate (DTC) sono presenti nel midollo osseo prima della diagnosi e predicono lo sviluppo di metastasi in altri organi⁷. Pertanto, si ritiene che le cellule tumorali presenti nelle ossa siano la fonte di cellule che alla fine metastatizzano in altri sistemi di organi. Esistono molti modelli murini di metastasi tumorali solide che sviluppano metastasi prevalentemente nei polmoni e nei linfonodi e, a seconda del tipo di tumore e della tecnica di iniezione, potenzialmente altri sistemi di organi³. Tuttavia, mancano modelli murini di metastasi ossee che producano in modo affidabile e riproducibile metastasi scheletriche specifiche del sito e sviluppino metastasi ossee prima che i topi raggiungano i criteri di rimozione precoce dal carico tumorale primario o dalle metastasi ad altri organi. Abbiamo riportato un modello di osteosarcoma tumorale osseo primario che si basa sull'impianto chirurgico di un allotrapianto tumorale solido nella tibia prossimale dei topi⁸. I tumori ossei si sono formati nel 100% dei topi e l'88% ha sviluppato metastasi polmonari. Questa incidenza di metastasi supera quanto comunemente riportato clinicamente nelle persone (~20-50%), ma è di grande interesse poiché il polmone è il sito più comune di metastasi per l'osteosarcoma 9,10,11. Mentre questo modello è vantaggioso nella modellazione dei tumori ossei primari, ha anche una grande utilità nella modellazione delle metastasi ossee da altri tumori solidi osteotropi come tumori al seno, polmone, prostata, tiroide, epatici, renali e gastrointestinali.

Il razionale per lo sviluppo di questo modello era quello di sviluppare un'alternativa alla tradizionale iniezione intra-ossea tipicamente nella tibia prossimale o nel femore distale per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee¹². Il nostro obiettivo primario era quello di alleviare una limitazione nota di questa tecnica, cioè l'embolizzazione tumorale del polmone. Ciò si traduce nell'attecchimento di queste cellule tumorali emboliche e "metastasi artifattuali" che non ricapitolano la cascata metastatica completa da un tumore osseo primario stabilito che metastatizza ai polmoni ^8,13. Questa sarebbe anche la situazione in cui una metastasi ossea stabilita si diffonde in un sito distante. Inoltre, questa tecnica è stata sviluppata anche per produrre un modello di metastasi ossee che garantisse una maggiore incidenza di attecchimento e crescita dei tumori nell'osso e in un sito uniforme rispetto alle tecniche di iniezione ortotopica o intravascolare. Questo modello presenta vantaggi distinti rispetto a queste tecniche descritte. Questo modello comporta la consegna controllata e coerente delle cellule tumorali nell'osso. Inoltre, evita metastasi polmonari artifattuali dopo l'embolizzazione polmonare e stabilisce una popolazione di studio uniforme di base. C'è il beneficio dei tumori sito-specifici con questo modello senza il rischio di criteri di rimozione precoce derivanti da tumori primari o metastasi ad altri organi. Infine, questo modello ha una grande utilità per la modifica, compreso l'uso di xenotrapianti derivati dal paziente.

Il modello presentato ha somiglianze con l'iniezione diretta di sospensione cellulare nell'osso seguendo un approccio chirurgico seguito da iniezione attraverso la corteccia o consegna nella cavità del midollo dopo aver commesso un piccolo difetto nella corteccia (con o senza alesatura della cavità midollare)8,14,15,16,17. Tuttavia, l'impianto di un allotrapianto tumorale rende questa tecnica nettamente diversa. Pertanto, lo scopo di questo rapporto era quello di dimostrare questo modello di tumori ossei primari e metastasi ossee da tumori solidi, che supera molte limitazioni dei modelli precedentemente descritti. I gruppi di ricerca con esperienza in colture cellulari, modelli murini, anestesia e chirurgia del topo e anatomia del topo sono ben attrezzati per riprodurre la nostra tecnica per modellare tumori ossei primari o metastasi ossee nei topi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Cambridge, Cambridge, Regno Unito.

1. Preparazione di linee cellulari

1. Coltivare linee cellulari in conformità con i protocolli di coltura cellulare standard del laboratorio per la coltura cellulare tradizionale o l'iniezione nei topi. I protocolli standard utilizzati qui sono la crescita nel terreno di coltura modificato di Eagle di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), L-glutammina e penicillina / streptomicina (di seguito noto come mezzo di crescita completo).
   NOTA: In questo esperimento, le cellule di osteosarcoma di Abrams sono utilizzate nei topi Balb / c Foxn1 nu / nu . Per gli studi sul cancro al seno, vengono utilizzate cellule 4T1 in topi Balb / c e cellule EO771 in topi C57BL / 6.
2. Coltivare le cellule in flaconi di coltura tissutale ventilati o piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti a 37 °C in CO₂ al 5%.
3. Far passare la linea cellulare di interesse e preparare le cellule per l'iniezione quando le cellule raggiungono una confluenza comunemente usata con l'iniezione di queste cellule nei topi.

2. Animali

1. Utilizzare topi Balb/c Foxn1 nu/nu di almeno 6-8 settimane di età per la generazione di tumori sottocutanei per assicurarsi che gli animali siano oltre la fase di crescita rapida e abbiano raggiunto l'età adulta e la maturità scheletrica.
2. Usa topi maschi o femmine. Fare eccezioni quando si selezionano linee cellulari sensibili agli ormoni (ad esempio, cellule di cancro al seno in topi femmina e cellule tumorali della prostata nei topi maschi).
3. Per gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzare topi nudi atimici immunodeficienti in base al fatto che la linea cellulare è incompatibile con un sistema immunitario di topo intatto in condizioni normali.
4. Per gli esperimenti di allotrapianto che utilizzano linee cellulari murine, questo è raccomandato anche sulla base di background genetici e immunitari di topo dissimili. Tuttavia, per esperimenti singeneici, utilizzare animali dello stesso ceppo della linea cellulare di interesse.
5. Ospitare animali a densità standard a seconda delle politiche di allevamento dell'istituzione.

3. Tumori sottocutanei

1. Raccogliere linee cellulari dalla coltura mediante tripsinizzazione e risospendere in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
2. Valutare la vitalità cellulare e determinare la densità cellulare con il metodo di esclusione del blu tripano. Utilizzare un emocitometro o un contatore automatico delle cellule per contare le cellule. Una vitalità cellulare minima del 90% deve essere utilizzata per l'iniezione nei topi per creare tumori sottocutanei.
3. Regolare la densità cellulare per iniettare 1-2 x 10⁵ cellule in un volume finale da 0,1 a 0,15 ml (da 100 a 150 μL) di PBS sterile. Tenere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione.
4. In alternativa, celle a pellet centrifugando a 800 x g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in un mezzo di matrice basale sterile non diluito per ottenere 1-2 x 10⁵ cellule in un volume finale da 0,1 a 0,15 ml (da 100 a 150 μL). Mantenere le celle sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.
5. Anestetizzare topi da utilizzare per la crescita tumorale sottocutanea con isoflurano in anestesia dell'ossigeno. Utilizzare una dose di induzione del 5% di isoflurano in 2 L/min di ossigeno e una dose di mantenimento del 2-3% di isoflurano in 2 L/min di ossigeno. Verificare la mancanza di riflessi di battito di ciglia o pedale prima di procedere ulteriormente.
   NOTA: L'isoflurano è un anestetico inalatorio. Utilizzare l'isoflurano in un'area ben ventilata con adeguati sistemi di scavenging e raccolta del gas libero. Si prega di consultare il personale veterinario istituzionale per sviluppare un piano per l'induzione, il mantenimento e il monitoraggio dell'anestesia e assicurarsi che il personale di laboratorio abbia una formazione adeguata nel monitoraggio dell'anestesia e nella manipolazione di agenti anestetici inalanti.
6. Rimuovere i peli dalla regione dorsale del torace o dell'addome di topi anestetizzati con soluzione depilante o con un tagliacapelli elettrico. La soluzione depilante è preferibile per ridurre al minimo il potenziale trauma alla pelle. Salta questo passaggio se usi topi nudi athymi.
7. Pulire l'area preparata con un tampone etanolo al 70% prima dell'iniezione della sospensione cellulare.
8. Utilizzare una siringa da 1 mL di tubercolina con un ago da 27 G per iniettare le cellule per via sottocutanea sulla regione dorsale del torace o dell'addome, per non essere influenzato dal movimento delle scapole. In alternativa, iniettare le cellule per via sottocutanea come sospensione nella matrice extracellulare disponibile in commercio.
   NOTA: L'iniezione nella matrice extracellulare disponibile in commercio limiterà la migrazione della sospensione cellulare nello spazio sottocutaneo perché queste matrici si solidificano a temperatura ambiente.
9. Recuperare i topi su una piastra elettrica in gabbie individuali fino a deambulazione. I topi possono quindi essere collocati nelle loro gabbie normali con lettiere pulite e asciutte.
10. Monitorare le dimensioni del tumore sottocutaneo sovrastante il torace dorsale o l'addome con una pinza e misurare il peso corporeo settimanalmente per garantire che i tumori sottocutanei non ulcerino o che i topi soddisfino i criteri di rimozione precoce stabiliti dal comitato per la cura e l'uso degli animali delle istituzioni. Si raccomanda una dimensione massima del tumore di 15 mm in qualsiasi dimensione per ridurre il rischio di ulcerazione cutanea o necrosi tumorale centrale.
    NOTA: Consultare le linee guida locali per determinare la dimensione / volume massimo ammissibile del tumore.
11. Eutanasia topi portatori di tumori sottocutanei dopo tre o quattro settimane per inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale. Seguire le politiche accettabili dell'istituzione per l'eutanasia dei topi.
12. Raccogliere tumori sottocutanei utilizzando la tecnica chirurgica asettica. Sterilizzare la pelle sovrastante il tumore come prima con etanolo al 70% dopo la rimozione dei peli (se applicabile). Incidere attraverso la pelle sovrastante il tumore con una lama di bisturi # 15 (con o senza un manico della lama del bisturi). Sezionare bruscamente il tumore dai tessuti molli circostanti attaccati con un paio di forbici chirurgiche sterili.
13. Posizionare il tumore in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti contenenti terreno di crescita completo e tritare in più piccoli frammenti di dimensioni predeterminate (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm – 0,25 mm 3 fino a 1 mm x 1 mm x 1 mm – 1 mm³) con una lama di bisturi #15 (con o senza manico a lama di bisturi).
14. Mantenere i frammenti tumorali in terreno di crescita completo sterile a temperatura ambiente fino al momento dell'impianto intratibiale. Per le linee cellulari che trasportano geni reporter luciferasi, utilizzare l'imaging bioluminescente o fluorescente ex-vivo per confermare la vitalità del tumore prima dell'impianto intratibiale nei topi.
15. Per la crioconservazione, posizionare più frammenti nello stesso crioviale in mezzo di crescita completo integrato con 20% FBS e 10% dimetil solfossido (DMSO). Congelare gradualmente utilizzando un sistema di crioconservazione commerciale a -80 °C e conservare a lungo termine in azoto liquido. Conservare i frammenti tumorali per le analisi successive, ma non per l'impianto futuro, mediante congelamento a scatto mediante immersione di azoto liquido. Conservare questi frammenti tumorali congelati a lungo termine a -80 °C.
    NOTA: È stato precedentemente riportato che i tumori congelati a scatto non si attecchiscono e crescono in vivo⁸.

4. Impianto chirurgico di frammenti tumorali sottocutanei

1. Portare frammenti freschi o crioconservati di tumore sottocutaneo a temperatura ambiente in mezzo di crescita completo prima dell'impianto chirurgico.
2. Anestetizzare topi del ceppo di interesse usando isoflurano in anestesia con ossigeno come descritto nel paragrafo 3. Verificare la mancanza di riflessi del pedale prima di procedere. Somministrare buprenorfina sottocutanea alla dose di 0,02-0,05 mg/kg per fornire analgesia perioperatoria. Questo può essere ripetuto ogni 6-8 ore nel periodo post-operatorio, se necessario.
3. Rimuovere i peli sull'articolazione del ginocchio destro e la tibia prossimale dell'arto posteriore con soluzione depilante per ridurre al minimo il potenziale trauma alla pelle.
4. Strofinare l'area preparata con antisettico chirurgico. Strofinare prima con un tampone etanolo al 70% e poi strofinare con clorexidina alternata e scrub salino.
5. Visualizza la tibia prossimale come la regione appena distale all'articolazione del ginocchio mentre fletti ed estendi l'articolazione.
6. Creare un'incisione di 3-4 mm a livello della tibia prossimale sull'aspetto mediale dell'arto con una lama di bisturi #15 (con o senza manico a lama di bisturi). Incidere attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo per esporre la corteccia mediale della tibia prossimale.
7. Applicare una leggera pressione con la punta di un ago da 25 G, ruotando anche la punta, per creare un piccolo foro nella corteccia mediale della tibia prossimale. Fai questo foro distale di circa 2 mm all'articolazione del ginocchio in un punto equidistante tra la corteccia tibiale cranica e caudale. Selezionare la dimensione dell'ago in base alla dimensione dei frammenti tumorali.
8. Utilizzare una pinza sterile per raccogliere e inserire i frammenti tumorali nella cavità midollare della tibia prossimale. Utilizzare un ago da 27 a 30 G per manipolare il frammento tumorale nel canale midollare. A seconda delle dimensioni dei frammenti tumorali, impiantare un volume tumorale totale di almeno 0,5 mm³ in ciascuna tibia. Ciò può richiedere l'impianto di 1 o più frammenti tumorali a seconda delle dimensioni dei frammenti tumorali creati.
   NOTA: Le modifiche per prevenire o limitare lo spostamento dell'innesto al di fuori dell'osso sarebbero il posizionamento di cera ossea o cemento osseo nel difetto osseo o schiuma di gel o un innesto di grasso sottocutaneo sopra il foro nell'osso.
9. Applicare i bordi della pelle con adesivo sterile per tessuti liquidi o una sutura a pelle singola. Non utilizzare clip per ferite in questo sito. Prestare attenzione se si utilizza l'imaging a fluorescenza nel periodo post-operatorio, poiché sia gli adesivi tissutali che la sutura hanno il potenziale di fluorescenza.
10. Recuperare i topi su una piastra elettrica in gabbie individuali fino a deambulazione.

5. Valutazione seriale ed endpoint

1. Anestetizzare i topi usando l'isoflurano in anestesia con ossigeno come descritto in precedenza.
2. Valutare la crescita del tumore tibiale in modo non invasivo mediante radiografia digitale settimanale, bioluminescenza o imaging a fluorescenza (se si utilizzano cellule che esprimono luciferasi o un gene reporter fluorescente). Le misurazioni del calibro dell'arto nel sito di impianto possono essere eseguite anche nei topi svegli.
3. Oltre al monitoraggio tradizionale dei topi portatori di tumore (peso corporeo, livello di attività, frequenza respiratoria, toelettatura, postura, mentazione e comportamento) monitorare settimanalmente i topi per segni di zoppia degli arti posteriori, gonfiore e infezione del sito chirurgico.
4. Monitorare la ferita chirurgica della pelle per i primi 10-14 giorni per arrossamento eccessivo, gonfiore, drenaggio e deiscenza della ferita fino a quando la ferita cutanea non è guarita. Dopo 4-5 settimane, valutare i topi in base alla valutazione dei risultati dello studio vivi o dopo l'eutanasia.

Risultati

Un risultato positivo sarebbe associato all'attecchimento del tumore e alla crescita progressiva del tumore nel tempo. A seconda del tipo di tumore, la crescita tumorale intraossea può essere associata a zoppia progressiva degli arti posteriori, ma molti tumori non causano zoppia nonostante i segni di malattia ossea associata. L'attecchimento riuscito è stato documentato con imaging avanzato, per cui ci sarebbero cambiamenti radiografici, μTC o μMRI progressivi nella tibia prossimale associata al fenotipo osseo della...

Discussione

Questo rapporto documenta il nostro modello per creare tumori ossei primari o metastasi ossee dopo l'impianto intratibiale di un allotrapianto tumorale. Riteniamo che ci siano diversi passaggi critici in questo processo. Deve essere stabilito un piano anestetico sicuro sia per l'iniezione sottocutanea della sospensione delle cellule tumorali che per il posizionamento intratibiale dei frammenti tumorali risultanti. Ci dovrebbe essere una preparazione sterile del sito chirurgico sia per la rimozione dell'allotrapianto sott...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed