Моделирование первичных опухолей костей и метастазов в кости с имплантацией солидного опухолевого трансплантата в кость

Резюме

Модели метастазирования в кости не развивают метастазы равномерно или со 100% частотой. Прямая внутрикостная инъекция опухолевых клеток может привести к эмболизации легкого. Мы представляем нашу методику моделирования первичных опухолей костей и метастазов в кости с использованием имплантации солидного опухолевого трансплантата в кость, что приводит к воспроизводимому приживлению и росту.

Аннотация

Первичные опухоли костей или метастазы в кости из солидных опухолей приводят к болезненным остеолитическим, остеобластическим или смешанным остеолитическим/остеобластическим поражениям. Эти поражения нарушают структуру кости, увеличивают риск патологических переломов и оставляют пациентов с ограниченными возможностями лечения. Первичные опухоли костей метастазируют в отдаленные органы, причем некоторые типы способны распространяться на другие участки скелета. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что при многих солидных опухолях раковые клетки, которые распространились на кости, могут быть основным источником клеток, которые в конечном итоге метастазируют в другие системы органов. Большинство сингенных или ксенотрансплантатных мышиных моделей первичных опухолей костей включают внутрикостную (ортотопическую) инъекцию суспензий опухолевых клеток. Некоторые животные модели скелетных метастазов из солидных опухолей также зависят от прямой инъекции в костную ткань, в то время как другие пытаются повторить дополнительные этапы костного метастатического каскада путем внутрисосудистого введения клеток или в орган первичной опухоли. Однако ни одна из этих моделей не развивает метастазы в кости надежно или со 100% заболеваемостью. Кроме того, было показано, что прямая внутрикостная инъекция опухолевых клеток связана с потенциальной эмболизацией опухоли легкого. Эти эмболические опухолевые клетки приживаются, но не повторяют метастатический каскад. Мы сообщили о мышиной модели остеосаркомы, в которой свежие или криоконсервированные фрагменты опухоли (состоящие из опухолевых клеток плюс стромы) имплантируются непосредственно в проксимальный отдел большеберцовой кости с использованием минимально инвазивной хирургической техники. У этих животных развилось воспроизводимое приживление, рост и, со временем, остеолиз и метастазирование в легкие. Этот метод обладает универсальностью для моделирования метастазов в костную ткань солидной опухоли и может легко использовать трансплантаты, состоящие из одного или нескольких типов клеток, генетически модифицированных клеток, ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, и / или меченых клеток, которые можно отслеживать с помощью оптической или расширенной визуализации. Здесь мы демонстрируем эту технику, моделируя первичные опухоли костей и метастазы в кости с помощью имплантации солидного опухолевого трансплантата в кость.

Введение

Мышиные модели болезней человека и животных становятся все более популярными в биомедицинских исследованиях. Полезность использования мышей в этом контексте заключается в том, что их анатомия и физиология очень похожи на человеческие. Они имеют относительно короткий период беременности и время в послеродовой жизни для достижения зрелости и в значительной степени связаны с относительно низкой стоимостью и простотой жилья, хотя растущие затраты на развитие или покупку связаны с большей степенью генетической модификации, иммунодефицита и/или гуманизации¹. Использование инбредных штаммов приводит к созданию в значительной степени однородной популяции животных до включения в исследование. Полное знание их генома предполагает высокую степень сходства с людьми. Ортологичные молекулярные мишени для многих болезненных процессов были идентифицированы в геноме мыши, и в настоящее время существует обширная библиотека специфических для мышей реагентов, которые легко доступны. Таким образом, они предоставляют возможность для относительно высокопроизводительного анализа более быстрым и менее дорогостоящим способом по сравнению с более крупными моделями животных¹. Кроме того, с появлением стратегий генетического редактирования, которые допускают сверхэкспрессию или делецию определенных генов либо глобально, либо специфическим образом для типа клеток и/или конститутивно или индуцируемым образом, они представляют собой очень биологически полезную модельную систему для исследования болезней человека и животных².

Рак — это одна из областей, в которой модели мышей имеют большую полезность. Генетические мышиные модели рака основаны на модуляции экспрессии либо онкогенов, либо генов-супрессоров опухолей, отдельно или в комбинации, чтобы клетки подвергались онкогенной трансформации. Также выполняется инъекция первичных или установленных линий опухолевых клеток мышам. Введение клеточных линий или тканей от людей или других видов животных, включая мышей, остается наиболее широко используемой моделью рака in vivo. Чаще всего выполняется использование клеток и тканей разнородных видов (ксенотрансплантатов) у мышей с ослабленным иммунитетом². Однако использование опухолевых клеток или тканей аллотрансплантата, где и хозяин, и реципиент принадлежат к одному и тому же виду, позволяет взаимодействовать с интактной иммунной системой в сочетании с одним и тем же штаммом мыши-хозяина в сингенных системах³.

Первичные опухоли костей или метастазы в кости из солидных опухолей приводят к болезненным остеолитическим, остеобластическим или смешанным остеолитическим/остеобластическим поражениям ^3,4. Эти опухоли нарушают структуру кости, увеличивая риск патологического перелома, и оставляют пациентов с ограниченными возможностями лечения. Первичные опухоли костей метастазируют в отдаленные органы, причем некоторые типы способны распространяться на другие участки скелета. У пациентов с раком молочной железы кость является наиболее распространенным местом первого метастазирования и наиболее частым первым местом проявления метастатического заболевания ^5,6. Кроме того, диссеминированные опухолевые клетки (DTC) присутствуют в костном мозге до постановки диагноза и предсказывают развитие метастазов в других органах⁷. Поэтому считается, что раковые клетки, присутствующие в кости, являются источником клеток, которые в конечном итоге метастазируют в другие системы органов. Существует множество мышиных моделей метастазов солидной опухоли, которые развивают метастазы преимущественно в легких и лимфатических узлах, а в зависимости от типа опухоли и техники инъекции потенциально другие системы органов³. Тем не менее, мышиные модели метастазирования в кости отсутствуют, чтобы надежно, воспроизводимо производить специфические для сайта скелетные метастазы и развивать метастазы в кости до того, как мыши достигнут критериев раннего удаления из первичной опухолевой нагрузки или метастазирования в другие органы. Мы сообщили о модели первичной костной опухолевой остеосаркомы, которая основана на хирургической имплантации аллотрансплантата солидной опухоли в проксимальный отдел большеберцовой кости мышей⁸. Опухоли костей образовались у 100% мышей, а у 88% развились легочные метастазы. Эта частота метастазирования превышает то, что обычно сообщается клинически у людей (~ 20-50%), но представляет большой интерес, поскольку легкое является наиболее распространенным местом метастазирования остеосаркомы 9,10,11. Хотя эта модель выгодна при моделировании первичных опухолей костей, она также имеет большое значение для моделирования метастазов в кости из других остеотропных солидных опухолей, таких как опухоли молочной железы, легких, простаты, щитовидной железы, печени, почек и желудочно-кишечного тракта.

Обоснование разработки этой модели состояло в том, чтобы разработать альтернативу традиционной внутрикостной инъекции, обычно в проксимальный отдел большеберцовой или дистальной части бедренной кости, для моделирования первичных опухолей кости или метастазов^{в кости 12}. Наша основная цель состояла в том, чтобы смягчить известное ограничение этого метода, т.е. эмболизацию опухоли легкого. Это приводит к приживлению этих эмболических опухолевых клеток и «искусственному метастазированию», которые не повторяют полный метастатический каскад из установленной первичной опухоли кости, которая метастазирует в легкие ^8,13. Это также может быть ситуация, когда установленный костный метастаз распространяется на отдаленный участок. Кроме того, этот метод также был разработан для получения модели метастазирования в кости, которая обеспечила бы большую частоту приживления и роста опухолей в кости и в однородном месте по сравнению с ортотопическими или внутрисосудистыми инъекционными методами. Эта модель имеет явные преимущества по сравнению с этими описанными методами. Эта модель включает контролируемую, последовательную доставку опухолевых клеток в кость. Он также позволяет избежать искусственного метастазирования в легкие после эмболизации легочной артерии и устанавливает исходную однородную исследуемую популяцию. Существует преимущество сайт-специфических опухолей с этой моделью без риска раннего удаления критериев в результате первичных опухолей или метастазирования в другие органы. Наконец, эта модель очень полезна для модификации, включая использование ксенотрансплантатов, полученных от пациентов.

Представленная модель имеет сходство с прямой инъекцией клеточной суспензии в кость после хирургического доступа с последующей инъекцией через кору головного мозга или доставкой в полость костного мозга после создания небольшого дефекта в коре (с развертыванием или без развертывания медуллярной полости)8,14,15,16,17 . Однако имплантация опухолевого аллотрансплантата делает этот метод совершенно другим. Таким образом, целью данного доклада была демонстрация данной модели первичных опухолей костей и метастазирования в кости из солидных опухолей, которая преодолевает многие ограничения ранее описанных моделей. Исследовательские группы, имеющие опыт работы с клеточными культурами, мышиными моделями, анестезией и хирургией мышей, а также анатомией мышей, хорошо оснащены для воспроизведения нашей техники моделирования первичных опухолей костей или метастазов в кости у мышей.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Кембриджского университета, Кембридж, Великобритания.

1. Подготовка клеточных линий

1. Выращивайте клеточные линии в соответствии со стандартными лабораторными протоколами культивирования клеток для традиционной клеточной культуры или инъекции мышам. Стандартными протоколами, используемыми здесь, являются рост в модифицированной среде Игла Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), L-глютамин и пенициллин/стрептомицин (далее известный как полная среда для роста).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте клетки остеосаркомы Абрамса используются у мышей Balb/c Foxn1 nu/nu . Для исследований рака молочной железы используются клетки 4T1 у мышей Balb/c и клетки EO771 у мышей C57BL/6.
2. Выращивайте клетки либо в вентилируемых колбах для культивирования тканей, либо в 6-луночных планшетах для культивирования тканей при 37 ° C при 5% CO₂.
3. Пройдите интересующую клеточную линию и подготовьте клетки к инъекции, когда клетки достигнут слияния, обычно используемого при инъекции этих клеток мышам.

2. Животные

1. Используйте мышей Balb/c Foxn1 nu/nu в возрасте не менее 6-8 недель для образования подкожных опухолей, чтобы убедиться, что животные вышли из фазы быстрого роста и достигли взрослой жизни и зрелости скелета.
2. Используйте либо самцов, либо самок мышей. Делайте исключения при выборе гормонально-чувствительных клеточных линий (например, клетки рака молочной железы у самок мышей и клетки рака предстательной железы у самцов мышей).
3. Для экспериментов с ксенотрансплантатами используйте иммунодефицитных атимических обнаженных мышей на основе того, что клеточная линия несовместима с интактной иммунной системой мыши в нормальных условиях.
4. Для экспериментов с аллотрансплантатами с использованием линий мышиных клеток это также рекомендуется на основе различных генетических и иммунных предпосылок мышей. Однако для сингенных экспериментов используйте животных того же штамма, что и интересующая клеточная линия.
5. Домашние животные со стандартной плотностью в зависимости от политики содержания в учреждении.

3. Подкожные опухоли

1. Собирают клеточные линии из культуры путем трипсинизации и ресуспендируют в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
2. Оцените жизнеспособность клеток и определите плотность клеток методом исключения трипанового синего. Используйте гемоцитометр или автоматический счетчик клеток для подсчета клеток. Минимальная жизнеспособность клеток 90% должна использоваться для инъекций мышам для создания подкожных опухолей.
3. Отрегулируйте плотность клеток, чтобы ввести 1-2 x 10⁵ клеток в конечный объем от 0,1 до 0,15 мл (от 100 до 150 мкл) стерильного PBS. Держите клетки на льду до инъекции.
4. В качестве альтернативы, грануляторы центрифугируют при 800 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в неразбавленной стерильной матричной среде базальной мембраны, чтобы получить 1-2 х 10⁵ клеток в конечном объеме от 0,1 до 0,15 мл (от 100 до 150 мкл). Держите клетки на льду до дальнейшего использования.
5. Обезболивают мышей для использования при росте подкожной опухоли изофлураном в кислородной анестезии. Используйте индукционную дозу 5% изофлурана в 2 л/мин кислорода и поддерживающую дозу 2-3% изофлурана в 2 л/мин кислорода. Проверьте отсутствие моргания или педальных рефлексов, прежде чем двигаться дальше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран является ингаляционным анестетиком. Используйте изофлуран в хорошо проветриваемом помещении с соответствующими системами продувки и сбора свободного газа. Пожалуйста, проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом учреждения, чтобы разработать план индукции, обслуживания и мониторинга анестезии, а также убедитесь, что персонал лаборатории прошел соответствующую подготовку по мониторингу анестезии и обращению с ингаляционными анестетиками.
6. Удалите волосы из дорсальной области грудной клетки или живота анестезированных мышей раствором для депиляции или с помощью электрической машинки для стрижки. Раствор для депиляции предпочтителен, чтобы свести к минимуму потенциальную травму кожи. Пропустите этот шаг, если используете мышей с атимической обнаженной натурой.
7. Очистите подготовленную область 70% тампоном этанола перед инъекцией клеточной суспензии.
8. Используйте туберкулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 27 г для подкожного введения клеток в дорсальную область грудной клетки или живота, чтобы на них не влияло движение лопаток. В качестве альтернативы, вводят клетки подкожно в виде суспензии в коммерчески доступный внеклеточный матрикс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция в коммерчески доступный внеклеточный матрикс ограничит миграцию клеточной суспензии в подкожном пространстве, поскольку эти матрицы затвердевают при комнатной температуре.
9. Восстановите мышей на грелке в отдельных клетках до амбулатории. Затем мышей можно поместить в их обычные клетки с чистой, сухой подстилкой.
10. Контролируйте размер подкожной опухоли, покрывающей дорсальную грудную клетку или брюшную полость, с помощью штангенциркуля и еженедельно измеряйте массу тела, чтобы убедиться, что подкожные опухоли не изъязвляются или мыши не соответствуют критериям раннего удаления, установленным комитетом по уходу за животными и их использованию. Рекомендуется максимальный размер опухоли 15 мм в любом измерении, чтобы снизить риск изъязвления кожи или некроза центральной опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проконсультируйтесь с местными рекомендациями, чтобы определить максимально допустимый размер/объем опухоли.
11. Усыпляют мышей с подкожными опухолями через три-четыре недели путем вдыхания CO₂ с последующим вывихом шейки матки. Следуйте принятой политике учреждения в отношении эвтаназии мышей.
12. Собирают подкожные опухоли с помощью асептической хирургической техники. Стерилизуйте кожу, покрывающую опухоль, как и раньше, 70% этанолом после удаления волос (если применимо). Надрежьте кожу, покрывающую опухоль, лезвием скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее). Резко рассеките опухоль от окружающих прикрепленных мягких тканей с помощью стерильных хирургических ножниц.
13. Поместите опухоль в 6-луночные пластины для культивирования тканей, содержащие полную питательную среду, и измельчите на несколько небольших фрагментов заранее определенного размера (~ 0,6 мм x 0,6 мм x 0,6 мм - 0,25 мм³ до 1 мм x 1 мм x 1 мм - 1 мм³) с помощью лезвия скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее).
14. Хранить опухолевые фрагменты в стерильной полной питательной среде при комнатной температуре до момента интрабольшеберной имплантации. Для клеточных линий, которые несут люциферазу или флуоресцентные репортерные гены, используйте биолюминесцентную или флуоресцентную визуализацию ex-vivo, чтобы подтвердить жизнеспособность опухоли перед внутрибольшеберцовой имплантацией мышам.
15. Для криоконсервации поместите несколько фрагментов в один и тот же криовиал в полную питательную среду с добавлением 20% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Постепенно замораживайте с помощью коммерческой системы криоконсервации при –80 °C и храните в жидком азоте длительное время. Сохранить фрагменты опухоли для последующего анализа, но не для будущей имплантации, путем мгновенной заморозки с помощью погружения в жидкий азот. Храните эти замороженные опухолевые фрагменты в течение длительного времени при температуре –80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее сообщалось, что замороженные опухоли не будут приживаться и расти in vivo⁸.

4. Хирургическая имплантация подкожных опухолевых фрагментов

1. Перед хирургической имплантацией доведите свежие или криоконсервированные фрагменты подкожной опухоли до комнатной температуры в полной питательной среде.
2. Анестезируют мышей интересующего штамма, используя изофлуран в кислородной анестезии, как описано в разделе 3. Прежде чем продолжить, проверьте отсутствие педальных рефлексов. Вводят подкожный бупренорфин в дозе 0,02-0,05 мг/кг для обеспечения периоперационной анальгезии. При необходимости это можно повторять каждые 6-8 ч в послеоперационном периоде.
3. Удалите волосы на правом коленном суставе и проксимальном отделе большеберцовой кости задней конечности с помощью раствора для депиляции, чтобы свести к минимуму потенциальную травму кожи.
4. Протрите подготовленный участок хирургическим антисептиком. Сначала потрите 70% этанолом, а затем потрите чередующимся хлоргексидином и солевым скрабом.
5. Визуализируйте проксимальный отдел большеберцовой кости как область, расположенную дистальнее коленного сустава, сгибая и разгибая сустав.
6. Сделайте разрез 3-4 мм на уровне проксимального отдела большеберцовой кости на медиальной стороне конечности с помощью лезвия скальпеля #15 (с ручкой лезвия скальпеля или без нее). Надрежьте кожу и подкожную клетчатку, чтобы обнажить медиальную кору проксимального отдела большеберцовой кости.
7. Слегка надавите кончиком иглы 25 G, одновременно вращая наконечник, чтобы создать небольшое отверстие в медиальной коре проксимального отдела большеберцовой кости. Сделайте это отверстие примерно на 2 мм дистальнее коленного сустава в точке, равноудаленной между корой черепа и каудальной большеберцовой кости. Подбирайте размер иглы в зависимости от размера опухолевых фрагментов.
8. С помощью стерильных щипцов подхватывайте и вставляйте опухолевые фрагменты в костномозговую полость проксимального отдела большеберцовой кости. Используйте иглу от 27 до 30 G, чтобы манипулировать фрагментом опухоли в медуллярный канал. В зависимости от размера опухолевых фрагментов имплантируйте минимум 0,5 мм³ общего объема опухоли в каждую большеберцовую кость. Для этого может потребоваться имплантация 1 или более опухолевых фрагментов в зависимости от размера созданных опухолевых фрагментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Модификации для предотвращения или ограничения смещения трансплантата за пределы кости будут заключаться в размещении костного воска или костного цемента в костном дефекте или гелевой пены или подкожного жирового трансплантата поверх отверстия в кости.
9. Нанесите на края кожи стерильный жидкий тканевый клей или один кожный шов. Не используйте зажимы для ран в этом месте. Будьте осторожны при использовании флуоресцентной визуализации в послеоперационном периоде, так как и тканевые клеи, и шов могут флуоресцировать.
10. Восстановите мышей на грелке в отдельных клетках до амбулатории.

5. Последовательная и конечная оценка

1. Анестезируйте мышей, используя изофлуран в кислородной анестезии, как описано ранее.
2. Оценивайте рост опухоли большеберцовой кости неинвазивно с помощью еженедельной цифровой рентгенографии, биолюминесценции или флуоресцентной визуализации (при использовании клеток, экспрессирующих люциферазу или флуоресцентный репортерный ген). Измерения штангенциркуля конечности в месте имплантации также могут быть выполнены у бодрствующих мышей.
3. В дополнение к традиционному мониторингу мышей с опухолями (масса тела, уровень активности, частота дыхания, уход, осанка, мышление и поведение) еженедельно наблюдайте за мышами на наличие признаков хромоты задних конечностей, отека и инфекции в области хирургического вмешательства.
4. Следите за хирургической раной кожи в течение первых 10-14 дней на предмет чрезмерного покраснения, отека, дренажа и расхождения раны, пока кожная рана не заживет. Через 4-5 недель оценивают мышей в соответствии с оценкой результатов исследования либо живыми, либо после эвтаназии.

Результаты

Положительный результат будет связан с приживлением опухоли и прогрессирующим ростом опухоли с течением времени. В зависимости от типа опухоли внутрикостный рост опухоли может быть связан с прогрессирующей хромотой задних конечностей, но многие опухоли не вызывают хромоты, несмотря ...

Обсуждение

В этом отчете задокументирована наша модель создания первичных опухолей костей или метастазов в кости после интратибиальной имплантации опухолевого аллотрансплантата. Мы считаем, что в этом процессе есть несколько важных шагов. Безопасная плоскость анестетика должна быть установле?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed