Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Özet

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Özet

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur. Bu lezyonlar kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini artırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Bununla birlikte, son kanıtlar, birçok katı tümörle, kemiğe yayılmış kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin birincil kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Primer kemik tümörlerinin çoğu sinjenik veya ksenogreft fare modeli, tümör hücresi süspansiyonlarının intra-osseöz (ortotopik) enjeksiyonunu içerir. Katı tümörlerden iskelet metastazının bazı hayvan modelleri de doğrudan kemik enjeksiyonuna bağlıdır, diğerleri ise hücreleri intravasküler olarak veya primer tümörün organına enjekte ederek kemik metastatik kaskadının ek adımlarını özetlemeye çalışır. Bununla birlikte, bu modellerin hiçbiri güvenilir bir şekilde veya% 100 insidansı ile kemik metastazı geliştirmez. Ek olarak, tümör hücrelerinin doğrudan intra-osseöz enjeksiyonunun, akciğerin potansiyel tümör embolizasyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu embolik tümör hücreleri aşılanır, ancak metastatik kaskatı özetlemez. Taze veya kriyokorunmuş tümör fragmanlarının (tümör hücreleri artı stromadan oluşan) minimal invaziv bir cerrahi teknik kullanılarak doğrudan proksimal tibiaya implante edildiği bir fare osteosarkom modeli sunduk. Bu hayvanlar tekrarlanabilir engraftman, büyüme ve zamanla osteoliz ve akciğer metastazı geliştirdi. Bu teknik, solid tümör kemik metastazını modellemek için kullanılacak çok yönlülüğe sahiptir ve optik veya ileri görüntüleme ile izlenebilen bir veya daha fazla hücre tipi, genetiği değiştirilmiş hücreler, hasta kaynaklı ksenogreftler ve / veya etiketli hücrelerden oluşan greftleri kolayca kullanabilir. Burada, primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını kemiğe solid tümör greft implantasyonu kullanarak modelleyen bu tekniği gösterdik.

Giriş

İnsan ve hayvan hastalıklarının fare modelleri, biyomedikal araştırmalarda giderek daha popüler hale geliyor. Bu bağlamda fareleri kullanmanın yararı, anatomi ve fizyolojilerinin insanlara çok benzemesidir. Olgunluğa ulaşmak için doğum sonrası yaşamda nispeten kısa bir gebelik süresine ve süresine sahiptirler ve büyük ölçüde nispeten düşük bir maliyet ve barınma kolaylığı ile ilişkilidirler, ancak artan geliştirme veya satın alma maliyetleri daha yüksek derecelerde genetik modifikasyon, immün yetmezlik ve / veya insancıllaştırma ile ilişkilidir¹. Akraba suşların kullanımı, çalışmanın dahil edilmesinden önce büyük ölçüde tekdüze bir hayvan popülasyonu ile sonuçlanır. Genomlarının tam bir bilgisi, insanlara yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Fare genomunda birçok hastalık süreci için ortolog moleküler hedefler tanımlanmıştır ve şimdi kolayca elde edilebilen fareye özgü reaktiflerin kapsamlı bir kütüphanesi bulunmaktadır. Bu nedenle, daha büyük hayvan modellerine kıyasla daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde nispeten yüksek verimli analiz için fırsat sağlarlar¹. Ek olarak, belirli genlerin küresel olarak veya hücre tipine özgü bir şekilde ve / veya yapısal veya indüklenebilir bir şekilde aşırı ekspresyonuna veya silinmesine izin veren genetik düzenleme stratejilerinin ortaya çıkmasıyla, insan ve hayvan hastalıklarının araştırılması için biyolojik olarak çok yararlı bir model sistemi temsil etmektedirler².

Kanser, fare modellerinin büyük faydaya sahip olduğu bir alandır. Kanserin genetik fare modelleri, hücrelerin onkojenik transformasyona uğraması için onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunun tek başına veya kombinasyon halinde modülasyonuna dayanır. Primer veya yerleşik tümör hücre hatlarının farelere enjeksiyonu da gerçekleştirilir. İnsanlardan veya fareler de dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinden hücre hatlarının veya dokuların tanıtılması, in vivo olarak en yaygın kullanılan kanser modeli olmaya devam etmektedir. İmmün sistemi baskılanmış farelerde farklı türlerden (ksenogreftler) hücrelerin ve dokuların kullanımı en yaygın olarak gerçekleştirilir². Bununla birlikte, hem konakçının hem de alıcının aynı türden olduğu allogreft tümör hücrelerinin veya dokularının kullanılması, sinjenik sistemlerde aynı konakçı fare suşu ile birleştirildiğinde sağlam bir bağışıklık sistemi ile etkileşime izin verir³.

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur ^3,4. Bu tümörler kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini arttırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Meme kanserli hastalarda kemik, metastatik hastalığın ilk metastazının en sık görüldüğü ve ilk ortaya çıktığı yerdir ^5,6. Ek olarak, yayılmış tümör hücreleri (DTC'ler) diğer organlarda metastaz tanısı konmadan önce kemik iliğinde bulunur ve gelişimini öngörür⁷. Bu nedenle, kemikte bulunan kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin kaynağı olduğuna inanılmaktadır. Ağırlıklı olarak akciğer ve lenf nodlarında metastaz geliştiren ve tümör tipine ve enjeksiyon tekniğine bağlı olarak, potansiyel olarak diğer organ sistemlerinde metastaz geliştiren birçok fare katı tümör metastazı modeli mevcuttur³. Bununla birlikte, kemik metastazının fare modelleri, güvenilir bir şekilde, bölgeye özgü iskelet metastazı üreten ve fareler primer tümör yükünden veya metastazdan diğer organlara erken çıkarma kriterlerine ulaşmadan önce kemik metastazı geliştiren eksiktir. Primer kemik tümörü osteosarkomunun, solid tümör allogreftinin farelerin proksimal tibiasına cerrahi implantasyonuna dayanan bir modelini sunduk⁸. Kemik tümörleri farelerin %100'ünde oluşmuş ve %88'inde pulmoner metastaz gelişmiştir. Bu metastaz insidansı, insanlarda klinik olarak yaygın olarak bildirilenleri aşmaktadır (~% 20-50), ancak akciğer osteosarkom için en sık metastaz yeri olduğu için büyük ilgi çekmektedir 9,10,11. Bu model primer kemik tümörlerinin modellenmesinde avantajlı olmakla birlikte, meme, akciğer, prostat, tiroid, hepatik, renal ve gastrointestinal tümörler gibi diğer osteotropik solid tümörlerden kemik metastazının modellenmesinde de büyük faydası vardır.

Bu modelin geliştirilmesinin mantığı, primer kemik tümörlerini veya kemik metastazını modellemek için tipik olarak proksimal tibia veya distal femura geleneksel intra-osseöz enjeksiyona bir alternatif geliştirmekti¹². Öncelikli amacımız bu tekniğin bilinen bir kısıtlılığını, yani akciğerin tümör embolizasyonunu hafifletmekti. Bu, bu embolik tümör hücrelerinin engraftmanı ve akciğerlere metastaz yapan yerleşik bir primer kemik tümöründen tam metastatik kaskatı özetlemeyen "yapay metastaz" ile sonuçlanır ^8,13. Bu aynı zamanda yerleşik bir kemik metastazının uzak bir bölgeye yayıldığı durum olacaktır. Ek olarak, bu teknik, ortotopik veya intravasküler enjeksiyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, kemikte ve tekdüze bir bölgede daha fazla engraftman ve tümör büyümesi insidansı sağlayacak bir kemik metastazı modeli üretmek için geliştirilmiştir. Bu modelin, açıklanan bu tekniklere göre belirgin avantajları vardır. Bu model, tümör hücrelerinin kemiğe kontrollü ve tutarlı bir şekilde verilmesini içerir. Ayrıca, pulmoner embolizasyonu takiben yapay akciğer metastazını önler ve temel bir tekdüze çalışma popülasyonu oluşturur. Primer tümörlerden veya diğer organlara metastaz sonucu oluşan erken çıkarma kriterleri riski olmadan bu model ile bölgeye özgü tümörlerin yararı vardır. Son olarak, bu model, hasta kaynaklı ksenogreftlerin kullanımı da dahil olmak üzere modifikasyon için büyük bir faydaya sahiptir.

Sunulan model, cerrahi bir yaklaşımı takiben kemiğe doğrudan hücre süspansiyonu enjeksiyonu ile benzerlikler göstermektedir, ardından korteksten enjeksiyon veya kortekste küçük bir kusur yaptıktan sonra kemik iliği boşluğuna verilmesi (medüller boşluğu raybalama ile veya olmadan)8,14,15,16,17. Bununla birlikte, bir tümör allogreftinin implantasyonu bu tekniği belirgin şekilde farklı kılar. Bu nedenle, bu raporun amacı, daha önce tarif edilen modellerin birçok sınırlamasının üstesinden gelen primer kemik tümörleri ve solid tümörlerden kemik metastazı modelini göstermektir. Hücre kültürü, fare modelleri, fare anestezisi ve cerrahisi ve fare anatomisi konusunda deneyime sahip araştırma grupları, farelerde birincil kemik tümörlerini veya kemik metastazını modelleme tekniğimizi yeniden üretmek için iyi donanımlıdır.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Cambridge Üniversitesi, Cambridge, İngiltere'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hücre hatlarının hazırlanması

1. Geleneksel hücre kültürü veya farelere enjeksiyon için laboratuvarın standart hücre kültürü protokollerine uygun olarak hücre hatlarını büyütün. Burada kullanılan standart protokoller, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve penisilin / streptomisin (bundan böyle tam büyüme ortamı olarak anılacaktır) içeren modifiye Eagle's besiyerinde büyümedir.
   NOT: Bu deneyde, Abrams osteosarkom hücreleri Balb / c Foxn1 nu / nu farelerde kullanılmıştır. Meme kanseri çalışmaları için, Balb / c farelerde 4T1 hücreleri ve C57BL / 6 farelerde EO771 hücreleri kullanılır.
2. Havalandırmalı doku kültürü şişelerinde veya 6 kuyucuklu doku kültürü plakalarında 37 ° C'de% 5 CO_2'de hücreleri büyütün.
3. İlgilenilen hücre hattını geçin ve hücreler bu hücrelerin farelere enjeksiyonu ile yaygın olarak kullanılan bir akıcılığa ulaştığında hücreleri enjeksiyon için hazırlayın.

2. Hayvanlar

1. Hayvanların hızlı büyüme fazının ötesinde olduklarından ve yetişkinlik ve iskelet olgunluğuna ulaştıklarından emin olmak için deri altı tümör oluşumu için en az 6-8 haftalık olan Balb / c Foxn1 nu / nu farelerini kullanın.
2. Erkek veya dişi fareler kullanın. Hormona duyarlı hücre hatlarını seçerken istisnalar yapın (örneğin, dişi farelerde meme kanseri hücreleri ve erkek farelerde prostat kanseri hücreleri).
3. Ksenogreft deneyleri için, normal koşullar altında sağlam bir fare bağışıklık sistemi ile uyumsuz olan hücre hattına dayanan immün yetmezlikli atletik çıplak fareler kullanın.
4. Murin hücre hatlarını kullanan allogreft deneyleri için, bu aynı zamanda farklı fare genetik ve bağışıklık geçmişlerine dayanarak da önerilir. Bununla birlikte, sinjenik deneyler için, ilgilenilen hücre çizgisiyle aynı suştaki hayvanları kullanın.
5. Kurumun hayvancılık politikalarına bağlı olarak standart yoğunluklarda ev hayvanları.

3. Subkutan tümörler

1. Tripsinizasyon yoluyla kültürden hücre hatlarını toplayın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
2. Hücre canlılığını değerlendirin ve tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücreleri saymak için bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Deri altı tümörleri oluşturmak için farelere enjeksiyon için minimum% 90'lık bir hücre canlılığı kullanılmalıdır.
3. Hücre yoğunluğunu, 0,1 ila 0,15 mL (100 ila 150 μL) steril PBS'nin son hacminde 1-2 x 10⁵ hücre enjekte edecek şekilde ayarlayın. Enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
4. Alternatif olarak, pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj edilerek. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri seyreltilmemiş steril bazal membran matris ortamında yeniden askıya alarak 0,1 ila 0,15 mL'lik (100 ila 150 μL) son hacimde 1-2 x 10⁵ hücre elde edin. Daha sonraki kullanıma kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
5. Oksijen anestezisinde izofluran ile deri altı tümör büyümesi için kullanılacak fareleri anestezi altına alın. 2 L/dak oksijende %5 izofluran indüksiyon dozu ve 2 L/dak oksijende %2-3 izofluran idame dozu kullanın. Daha fazla ilerlemeden önce yanıp sönme veya pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin.
   NOT: İzofluran inhalasyonel bir anesteziktir. İzofluranı, uygun süpürme ve serbest gaz toplama sistemleri ile iyi havalandırılan bir alanda kullanın. Anestezi indüksiyonu, bakımı ve izlenmesi için bir plan geliştirmek ve laboratuvar personelinin anestezi izleme ve inhalan anestezik ajanların kullanımı konusunda uygun eğitime sahip olduğundan emin olmak için lütfen kurumsal veteriner hekim personeline danışın.
6. Anestezi uygulanan farelerin toraksının dorsal bölgesinden veya karnından saçları epilasyon çözeltisi veya elektrikli bir kesme makinesi ile çıkarın. Cilde gelebilecek olası travmayı en aza indirmek için epilasyon solüsyonu tercih edilir. Atimik çıplak fareler kullanıyorsanız bu adımı atlayın.
7. Hücre süspansiyonunun enjeksiyonundan önce hazırlanan alanı% 70 etanol çubukla temizleyin.
8. Omuz bıçaklarının hareketinden etkilenmemek için hücreleri göğüs kafesinin veya karnın dorsal bölgesine deri altından enjekte etmek için 27 G iğneli 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngası kullanın. Alternatif olarak, hücreleri ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matriste bir süspansiyon olarak deri altından enjekte edin.
   NOT: Ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matrise enjeksiyon, hücre süspansiyonunun deri altı boşluğundaki göçünü sınırlayacaktır, çünkü bu matrisler oda sıcaklığında katılaşır.
9. Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın. Fareler daha sonra temiz, kuru yataklarla normal kafeslerine yerleştirilebilir.
10. Dorsal toraks veya karın bölgesini kaplayan subkutan tümörün boyutunu bir kumpas ile izleyin ve deri altı tümörlerin ülsere olmadığından veya farelerin kurumların hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından belirlenen erken çıkarma kriterlerini karşılamadığından emin olmak için haftalık olarak vücut ağırlıklarını ölçün. Cilt ülserasyonu veya santral tümör nekrozu riskini azaltmak için herhangi bir boyutta maksimum 15 mm'lik bir tümör boyutu önerilir.
    NOT: İzin verilen maksimum tümör boyutunu/hacmini belirlemek için yerel kılavuzlara başvurun.
11. Üç ila dört hafta sonra deri altı tümörleri taşıyan fareleri CO₂ inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Kurumun fare ötenazisi için kabul edilebilir politikalarına uyun.
12. Aseptik cerrahi teknik kullanarak deri altı tümörleri toplayın. Tüyü çıkardıktan sonra% 70 etanol ile tümörün üstündeki cildi daha önce olduğu gibi sterilize edin (varsa). Tümörün üzerini örten deriden #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) kesin. Tümörü çevreleyen bağlı yumuşak dokulardan bir çift steril cerrahi makasla keskin bir şekilde diseke edin.
13. Tümörü, tam büyüme ortamı içeren 6 delikli doku kültürü plakalarına yerleştirin ve #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya sapsız) önceden belirlenmiş boyutta (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm - 0,25 mm 3'e kadar³ ila 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm³) birden fazla küçük parçaya bölün.
14. Tümör fragmanlarını intratibial implantasyon zamanına kadar oda sıcaklığında steril tam büyüme ortamında tutun. Lusiferaz veya floresan muhabir genleri taşıyan hücre hatları için, farelere intratibial implantasyondan önce tümör canlılığını doğrulamak için ex-vivo biyolüminesan veya floresan görüntüleme kullanın.
15. Kriyoprezervasyon için,% 20 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tam büyüme ortamına aynı kriyoviyal içine birden fazla parça yerleştirin. Ticari bir kriyoprezervasyon sistemi kullanarak –80 °C'de kademeli olarak dondurun ve sıvı azotta uzun süre saklayın. Tümör fragmanlarını sonraki analizler için koruyun, ancak gelecekteki implantasyon için değil, sıvı azot daldırma kullanarak anında dondurma ile koruyun. Bu donmuş tümör parçalarını -80 ° C'de uzun süre saklayın.
    NOT: Daha önce snap frozen tümörlerin in vivo⁸ infüzyon yapmayacağı ve büyümeyeceği bildirilmiştir.

4. Subkutan tümör fragmanlarının cerrahi implantasyonu

1. Cerrahi implantasyondan önce deri altı tümörün taze veya kriyokorunmuş parçalarını tam büyüme ortamında oda sıcaklığına getirin.
2. Bölüm 3'te açıklandığı gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak ilgili suşun farelerini uyuşturun. Devam etmeden önce pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin. Perioperatif analjezi sağlamak için subkutan buprenorfin'i 0.02-0.05 mg / kg'lık bir dozda uygulayın. Bu, gerekirse ameliyat sonrası dönemde her 6-8 saatte bir tekrarlanabilir.
3. Cilde potansiyel travmayı en aza indirmek için sağ diz eklemindeki ve arka bacağın proksimal tibiasındaki kılları epilasyon solüsyonu ile çıkarın.
4. Hazırlanan bölgeyi cerrahi antiseptik ile ovalayın. Önce %70 etanol çubukla ovalayın ve ardından alternatif klorheksidin ve tuzlu su ovma ile ovalayın.
5. Proksimal tibiayı, eklemi esnetirken ve uzatırken diz eklemine sadece distal bölge olarak görselleştirin.
6. Ekstremitenin medial kısmında proksimal tibia seviyesinde #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) 3-4 mm'lik bir kesi oluşturun. Proksimal tibianın medial korteksini açığa çıkarmak için deri ve deri altı dokusundan kesin.
7. Proksimal tibianın medial korteksinde küçük bir delik oluşturmak için ucu döndürürken 25 G'lik bir iğnenin ucuyla hafif bir basınç uygulayın. Bu deliği diz eklemine yaklaşık 2 mm distal olarak, kraniyal ve kaudal tibial korteksler arasında eşit uzaklıkta bir noktada yapın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak iğne boyutunu seçin.
8. Tümör parçalarını almak ve proksimal tibianın medüller boşluğuna yerleştirmek için steril forseps kullanın. Tümör parçasını medüller kanala manipüle etmek için 27 ila 30 G'lik bir iğne kullanın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak, her bir tibia içine en az 0.5 mm³ toplam tümör hacmi implante edin. Bu, oluşturulan tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak 1 veya daha fazla tümör fragmanının implantasyonunu gerektirebilir.
   NOT: Greftin kemik dışına çıkmasını önlemek veya sınırlamak için yapılan değişiklikler, kemik kusuruna kemik mumu veya kemik çimentosu veya jel köpük veya deri altı yağ greftinin kemikteki deliğin üzerine yerleştirilmesi olacaktır.
9. Cilt kenarlarını steril sıvı doku yapıştırıcısı veya tek bir cilt sütürü ile yerleştirin. Bu sitede yara klipsleri kullanmayın. Ameliyat sonrası dönemde floresan görüntüleme kullanıyorsanız dikkatli olun, çünkü hem doku yapıştırıcıları hem de dikiş floresan potansiyeline sahiptir.
10. Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın.

5. Seri ve bitiş noktası değerlendirmesi

1. Daha önce tarif edildiği gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak fareleri uyuşturun.
2. Tibial tümör büyümesini haftalık dijital radyografi, biyolüminesans veya floresan görüntüleme ile invaziv olmayan bir şekilde değerlendirin (lusiferaz eksprese eden hücreler veya floresan muhabir geni kullanılıyorsa). İmplantasyon bölgesindeki uzuvun kaliper ölçümleri uyanık farelerde de yapılabilir.
3. Tümör taşıyan farelerin geleneksel olarak izlenmesine ek olarak (vücut ağırlığı, aktivite seviyesi, solunum hızı, tımar, duruş, mentasyon ve davranış) fareleri arka ekstremite topallığı, şişlik ve cerrahi alan enfeksiyonu belirtileri açısından haftalık olarak izleyin.
4. Cilt cerrahi yarasını ilk 10-14 gün boyunca aşırı kızarıklık, şişlik, drenaj ve yara ayrışması açısından cilt yarası iyileşene kadar izleyin. 4-5 hafta sonra, fareleri canlı veya ötenazi sonrası çalışma sonucu değerlendirmesine göre değerlendirin.

Sonuçlar

Pozitif bir sonuç, tümör engraftmanı ve zamanla ilerleyici tümör büyümesi ile ilişkili olacaktır. Tümör tipine bağlı olarak, intraosseöz tümör büyümesi ilerleyici arka ekstremite topallığı ile ilişkili olabilir, ancak birçok tümör eşlik eden kemik hastalığı belirtilerine rağmen topallığa neden olmaz. Başarılı engraftman, ileri görüntüleme ile belgelenmiştir, bu sayede ilgilenilen hücre hattının kemik fenotipiyle ilişkili proksimal tibiada progresif radyografik, μBT veya μMRG ...

Tartışmalar

Bu yazı, bir tümör allogreftinin intratibial implantasyonunu takiben primer kemik tümörleri veya kemik metastazı oluşturma modelimizi belgelemektedir. Bu süreçte birkaç kritik adım olduğuna inanıyoruz. Hem tümör hücresi süspansiyonunun deri altına enjeksiyonu hem de ortaya çıkan tümör fragmanlarının intratibial yerleşimi için güvenli bir anestezi düzlemi oluşturulmalıdır. Hem subkutan allogreftin çıkarılması hem de allogreftin intratibial yerleştirilmesi için cerrahi bölgenin steril ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 scalpel blade	Henry Schein Ltd.	75614	None
6-well tissue culture plates	Thermo Fisher Scientific	10578911	Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture
Abrams osteosarcoma cell line	Not applicable	Not applicable	None
Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)	VetEquip	901805	None
Animal weighing scale	Kent Scientific	SCL- 1015	None
BALB/c nude mouse (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 weeks of age. Male or female mice
Bone cement	Depuy Synthes	160504	Optional use instead of bone wax
Bone wax	Ethicon	W31G	Optional
Buprenorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats
Carbon dioxide euthanasia station	N/A	N/A	Should be provided within animal facility
Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide	Heraeus	Various	None
Chlorhexidine surgical scrub	Vetoquinol	411412	None
Cryovials (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Optional if cryopreserving tumor fragments
D-luciferin (Firefly), potassium salt	Perkin Elmer	122799	Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene
Digital caliper	Mitutoyo	500-181-30	Can be manual
Digital microradiography cabinet	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Optional to evaluate bone response to tumor growth
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Optional if cryopreserving tumor fragments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	None
Ethanol (70%)	Sigma Aldrich	2483	None
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140079	None
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	None
Freezer (– 80 °C)	Sanyo	MDF-794C	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Hemocytometer	Thermo Fisher Scientific	11704939	Can also use automated cell counter, if available
Hypodermic needles (27 gauge)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles
Ice	N/A	N/A	Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage
Iris scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	None
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	None
IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system	Perkin Elmer	CLS136334	Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	None
Liquid nitrogen	British Oxygen Corporation	NA	Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments
Liquid nitrogen dewar, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Optional if cryopreserving tumor fragments
Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	Optional. Also available in 10 ml size (354230)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002549	Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes
Mr. Frosty freezing containiner	Fisher Scientific	10110051	Optional if cryopreserving tumor fragments
NAIR Hair remover lotion/oil	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Can alternatively use an electric clipper with fine blade
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	None
Scalpel handle, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	User preference as long as it accepts #15 scalpel blade
Small animal heated pad	VetTech	HE006	None
Stereomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	None
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine
Tissue adhesive (sterile)	3M Corporation	84-1469SB	Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	5250061	None
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Use 0.05%-0.25%
Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)	Becton Dickinson	309659	Slip tip preferred over Luer
Vented tissue culture flasks, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Can also use smaller or larger flasks, as needed