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Resumen

Describimos en este protocolo un modelo estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) mediante una doble inyección de sangre entera autóloga en la cisterna magna. El alto grado de estandarización del procedimiento de doble inyección representa un modelo de media a aguda de SAH con relativa seguridad con respecto a la mortalidad.

Resumen

Entre los accidentes cerebrovasculares, la hemorragia subaracnoidea (HS) consecutiva a la ruptura de un aneurisma arterial cerebral representa 5-9%, pero es responsable de alrededor del 30% de la mortalidad total relacionada con el accidente cerebrovascular con una morbilidad importante en términos de desenlace neurológico. Un vasoespasmo cerebral retrasado (CVS) puede ocurrir con mayor frecuencia en asociación con una isquemia cerebral retrasada. Se están utilizando diferentes modelos animales de SAH, incluyendo perforación endovascular e inyección directa de sangre en la cisterna magna o incluso en la cisterna prequismática, cada una de las que presenta ventajas y desventajas distintas. En este artículo, se presenta un modelo de ratón estandarizado de SAH mediante la inyección directa doble de volúmenes determinados de sangre entera autóloga en la cisterna magna. Brevemente, los ratones fueron pesados y luego anestesiados por inhalación de isoflurano. A continuación, el animal se colocó en una posición reclinable sobre una manta calentada manteniendo una temperatura rectal de 37 oC y se colocó en un marco estereotáctico con una curva cervical de unos 30o. Una vez en su lugar, la punta de una micropipeta de vidrio alargada llena con la sangre arterial homóloga extraída de la arteria carótida de otro ratón de la misma edad y sexo (C57Bl/6J) se posicionó en un ángulo recto en contacto con la membrana atlanto-occipital por medio de un micromaniprulador. Luego se inyectaron 60 l de sangre en la cisterna magna seguida de una inclinación descendente de 30o del animal durante 2 minutos. La segunda perfusión de sangre de 30oL en la cisterna magna se realizó 24 h después de la primera. El seguimiento individual de cada animal se lleva a cabo diariamente (evaluación cuidadosa del peso y el bienestar). Este procedimiento permite una distribución predecible y altamente reproducible de la sangre, probablemente acompañada de una elevación de la presión intracraneal que puede ser imitada por una inyección equivalente de un líquido cefalorraquídeo artificial (CSF), y representa un modelo agudo a leve de SAH que induce la baja mortalidad.

Introducción

La hemorragia subaracnoidea (SAH) representa hasta el 5% de todos los casos de accidente cerebrovascular y constituye una patología relativamente común con una incidencia de 7,2 a 9 pacientes por cada 100.000 por año, con una tasa de mortalidad del 20%-60% dependiendo del estudio1,,2,,3. En la fase aguda, la mortalidad es atribuible a la gravedad del sangrado, sangrado, vasoespasmo cerebral (CVS) y/o complicaciones médicas4. En los sobrevivientes, la lesión cerebral temprana (EBI) se asocia con la extensión parénquima de la hemorragia y el aumento abrupto de la presión intracraneal, que puede resultar en isquemia cerebral primaria5 y la muerte inmediata en aproximadamente 10%-15% de los casos6. Después de la etapa inicial "aguda" de la SAH, el pronóstico depende de la aparición de isquemia cerebral "secundaria" o retardada (DCI), detectada en casi el 40% de los pacientes por tomografía computarizada cerebral, y en hasta el 80% de los pacientes después de la resonancia magnética (RM)7,,8. Además del CVS que ocurre entre 4 y 21 días después de la ruptura del aneurisma en la mayoría de los pacientes con SAH, DCI9 puede ser el resultado de lesiones cerebrales difusas multifactoriales secundarias a la formación de microtrombosis, reducción de la perfusión cerebral, neuroinflamación y depresión de propagación cortical (CSD)10,11,12,13. Esto afecta al 30% de los sobrevivientes de SAH e impacta las funciones cognitivas incluyendo memoria visual, memoria verbal, tiempo de reacción, y funciones ejecutivas, visuospatiales y del lenguaje14 deteriorando la vida diaria15. Las terapias estándar actuales para prevenir el CVS y/o los malos resultados cognitivos en pacientes con SAH se basan en el bloqueo de la señalización y vasoconstricción de Ca2+ mediante el uso de inhibidores del canal Ca2+ como nimodipina. Sin embargo, ensayos clínicos más recientes dirigidos a vasoconstricción revelaron disociación entre el resultado neurológico del paciente y la prevención del CVS16,lo que sugiere mecanismos fisiopatológicos más complejos implicados en las consecuencias a largo plazo de la SAH. Por lo tanto, existe una necesidad médica de una mayor comprensión del número de eventos patológicos que acompañan a la SAH y el desarrollo de modelos animales válidos y estandarizados para probar las intervenciones terapéuticas originales.

La ruptura de un aneurisma intracraneal mayormente responsable de la SAH en humanos es probablemente difícil de imitar en modelos animales preclínicos. Actualmente, la ruptura del aneurisma y la situación de la SAH se pueden probar tentativamente mediante la perforación de la arteria cerebral media (modelo de punción endovascular) responsable de CVS y disfunciones sensitivomotoras en ratones17,,18. Debido a la falta de un posible control sobre la aparición del sangrado y la difusión de la sangre en este modelo, se han desarrollado otros métodos en roedores para generar modelos SAH sin ruptura endovascular. Más precisamente, consisten en la administración directa de sangre arterial en el espacio subaracnoideo a través de una inyección única o doble en las cisternas magna19 o una sola inyección en la cisterna prequismática20. La principal ventaja de estos modelos de ratón sin ruptura endovascular es la posibilidad de dominar reproduciblemente el procedimiento quirúrgico y la calidad y cantidad de la muestra de sangre inyectada. Otra ventaja de este modelo sobre el modelo mediante perforación endovascular en particular es la preservación del bienestar general del animal. De hecho, esta cirugía es menos invasiva y técnicamente menos difícil que la necesaria para generar una ruptura de la pared carótida. En este último modelo, el animal tiene que ser intubado y ventilado mecánicamente, mientras que un monofilamento se inserta en la arteria carótida externa, y avanza en la arteria carótida interna. Esto probablemente conduce a isquemia transitoria debido a la obstrucción del vaso por la trayectoria del alambre. En consecuencia, la comorbilidad (estado moribundo, dolor importante y muerte) asociada con la cirugía es menos importante en el modelo de doble inyección en comparación con el modelo de perforación endovascular. Además de ser un SAH más consistente, el método de inyección directa doble cumple con el bienestar animal en la investigación y las pruebas (tiempo reducido bajo anestesia, dolor por alteración del tejido en la cirugía y angustia) y conduce a un número total mínimo de animales utilizados para el estudio del protocolo y la formación del personal.

Además, esto permite la implementación del mismo protocolo a ratones transgénicos, lo que conduce a una comprensión patológica optimizada de la SAH y la posibilidad de pruebas comparativas de posibles compuestos terapéuticos. Aquí, presentamos un modelo de ratón estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) por una doble inyección diaria consecutiva de sangre arterial autóloga en la cisterna magna en ratones C57Bl/6J machos de 6-8 semanas de edad. La principal ventaja de este modelo es el control del volumen de sangrado en comparación con el modelo de perforación endovascular, y el refuerzo del evento de sangrado sin un aumento drástico de la presión intracraneal21. Recientemente, la doble inyección directa de sangre en la cisterna magna ha sido bien descrita en los problemas experimentales y fisiopatológicos en ratones. De hecho, recientemente demostramos CVS de grandes arterias cerebrales (basilar (BA), medias (MCA) y arterias cerebrales anteriores (ACA), deposición cerebrovascular de fibrina y apoptosis celular desde el día 3 (D3) hasta 10 (D10), defectos de circulación del líquido cefalorraquídeo paravascular acompañados de alteraciones de las funciones sensitivomotoras y cognitivas en ratones, 10 días después de SAH en este modelo22. Por lo tanto, hace que este modelo dominado, validado y caracterizado para eventos a corto y duradero plazo después de SAH. Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas potentes y eficientes contra complicaciones asociadas a la SAH.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo la supervisión de H. Castel de conformidad con el Comité ético francés y las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y el Consejo para la Protección de los Animales Utilizados con Fines Científicos. Este proyecto fue aprobado por el CENOMEXA local y los comités éticos nacionales de investigación y pruebas de animales. Los ratones macho c57Bl/6J Rj (Janvier), de 8 a 12 semanas, se alojaron en condiciones ambientales estándar controladas: 22 oC a 1 oC, 12 horas/12 horas de ciclo de luz/oscuridad, y agua y alimentos disponibles ad libitum.

1. Configuración de la cirugía SAH y preparación para la inyección

  1. Antes del comienzo de la cirugía, tire de un número adecuado de capilares de vidrio mediante el uso de un tirador de micropipeta. La pipeta de inyección debe presentar un diámetro interior de 0,86 mm y un diámetro exterior de 1,5 mm.
  2. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) para la afección falsa.
    1. Preparar una solución con 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM de glucosa, 26,2 mM NaHCO3 en H2O, pH 7,4.
    2. Gas aCSF con 95% O2 y 5% CO2 durante 15 min, y luego añadir 2,5 mM CaCl2.
    3. Esterilice el aCSF oxigenado con un aparato de filtro de 0,22 m. La solución de aCSF puede ser estable durante 3-4 semanas a 4 oC. Si ha aparecido contaminación (solución turbia) o una formación de depósitos, deseche y haga aCSF fresco.
  3. Recolección de sangre de un donante homólogo de ratón
    1. Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea y recoja la cantidad máxima de sangre mediante punción de la arteria carótida.
    2. En la práctica, coloque el ratón en una cámara de anestesia y cargue la cámara con 5% de isoflurano hasta que el animal pierda el conocimiento.
    3. Compruebe la falta de reflejos sujetando una de las dos extremidades posteriores para permitir el ajuste del procedimiento quirúrgico experimental.
    4. Recubrir una jeringa de 1 ml con una solución de heparina utilizando una aguja de 26 G (heparina sódica). Esto evitará la coagulación de la sangre durante los siguientes pasos.
    5. Instalar el animal posicionado en decúbito dorsal con las piernas separadas, y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de la anestesia con 2 a 2.5% isoflurano).
    6. Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea diseccionando el músculo omohioides longitudinalmente. Una vez aislada la arteria, inserte la aguja hacia el corazón con la ayuda del gancho y los fórceps microdissecantes y recoja el máximo de sangre a través de una punción de la arteria carótida (se necesita 60 l por ratón SAH).
    7. Sacrificar el ratón donante anestesiado inmediatamente después de la recolección de sangre mediante el uso de la luxación cervical.

2. Animal (8-10 semanas de edad C57BL/6J ratones macho) preparación

  1. Pese cada ratón con precisión utilizando una balanza electrónica. En el estudio actual, ratones tendrían peso corporal dentro del rango de 20 Para 25 gramos justo antes de la cirugía.
  2. Como se explicó anteriormente (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3), inducir anestesia de ratones a ser operados.
  3. Afeitar el cuello y el espacio entre las orejas con un clipper eléctrico adecuado.
  4. Instalar el animal posicionado en decúbito ventral con las piernas separadas y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de anestesia con 2 y 2.5% isoflurano) en un marco estereotáctico.
  5. Compruebe que el ratón está durmiendo y que su cabeza está correctamente bloqueada.
  6. Inyectar por vía subcutánea 100 ml de buprenorfina (0,1 mg/kg) con una aguja de 26 G en la parte inferior de la espalda, para evitar el dolor después del despertar.
  7. Evitar la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector y mantener una temperatura intrarectal de 37 oC mediante el uso de una manta eléctrica autorregulada.
  8. Tratar la zona afeitada del cuello posterior con una solución antiséptica (povidona-yodo o clorhexidina mediante el uso de una carretera de algodón estéril).
  9. Pre-esterilizar todos los instrumentos que tocan la piel preparada / tejido subcutáneo (calentamiento a 200 oC durante 2 horas) y manejar asépticamente.

3. Inducción de SAH

  1. El primer día (D-1)
    1. Cortar una incisión de 1 cm con tijeras delgadas en el cuello posterior, seguido de la separación de los músculos a lo largo de la línea media para acceder a la cisterna magna.
    2. Corte la punta de la pipeta de vidrio vacía con tijeras delgadas. A continuación, adáptese a una jeringa conectada a un conector de silicona flexible.
    3. Transfiera 60 l de sangre o aCSF (para SAH o condición falsa, respectivamente) en un tubo de 0,5 ml utilizando una micropipeta de precisión.
    4. Succionar en la pipeta de vidrio los 60 l de sangre para la condición SAH o 60 l de aCSF para la condición falsa.
    5. Por inyección, instale la pipeta en el marco estereotáctico utilizando un anillo o una tachuela azul y lentamente lleve la punta de la pipeta a la membrana en la interfaz con la cisterna magna.
    6. Inserte lentamente la punta de la pipeta a través de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna, utilizando un micro-manipulador del marco estereotáctico.
    7. Conecte la pipeta previamente llena de sangre o aCSF a la jeringa lista para la inducción de presión.
    8. Inyectar presionando el émbolo a una velocidad baja de alrededor de 10 l/min, para evitar la presión intracraneal aguda.
    9. Durante la inyección, controle de cerca la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.
    10. Al final de la inyección, retire cuidadosamente la pipeta a través del micromantenador y asegúrese visualmente de que no haya fugas durante la extracción.
    11. Alcanza la hemostasia usando una hemostat absorbible y ejecuta dos suturas con hilo suturante trenzado no absorbible.
    12. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decubito y cúbralo con una manta de supervivencia en una caja abierta durante la recuperación.
  2. Segundo día de inducción (D0)
    1. Después de 24 horas, induzca la anestesia (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3). Inyectar de nuevo 100 ml de buprenorfina por vía subcutánea (0,1 mg/kg) y prevenir la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector (ver pasos 2.7 y 2.8).
    2. Instale el animal en el marco estereotáctico como el día anterior.
    3. Retire cuidadosamente las suturas con microscisores.
    4. Preparar la membrana atlanto-occipital como antes y aplicar la preparación antiséptica en la zona afeitada del cuello con una varilla de algodón estéril.
    5. Inyectar 30 l de sangre o aCSF a una velocidad baja (ver pasos 3.1.2 a 3.1.8). Controlar la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.
    6. Al final de la inyección, quite cuidadosamente la pipeta y controle la ausencia de fuga de sangre durante la retirada.
    7. Lograr hemostasis y ejecutar dos suturas con hilo de sutura absorbible trenzado.

4. Seguimiento postoperatorio y final del experimento

  1. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decúbito con una manta de supervivencia en su espalda en una caja abierta durante la recuperación.
  2. Pesar y observar cuidadosamente diariamente el comportamiento de cada ratón hasta el sacrificio (por ejemplo, D7 post-cirugía).
  3. Entre los puntos finales humanos, una pérdida de peso significativa (>15% del peso) se nota clásicamente. Una postura "encorvada hacia atrás", movimientos lentos, postración, vocalizaciones anormales de dolor y/o comportamiento agresivo significativo también son signos importantes de sufrimiento animal. Si aparece alguno de estos signos o una combinación de signos, el control del animal se refuerza a las pocas horas de su aparición. Si el bienestar del animal empeora o no mejora en 48 horas, se considerará que se alcanza un nivel de sufrimiento intolerable, y se lleva a cabo la eutanasia.
  4. En el momento de la elección, sacrificar ratones anestesiados por decapitación, y cosechar cerebros para análisis posteriores.
  5. Realizar eutanasia (decapitación) después de la anestesia isoflurano (5%).

Resultados

Cronología experimental, procedimiento, seguimiento y mortalidad
La Figura 1A y la Figura 1B resumen el protocolo modelo SAH mediante inyección de sangre de doble intracisterna. Brevemente, el primer día de inducción de SAH (D-1), se inyectaron 60 l de sangre retirada de un ratón homólogo o 60 l de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) en la cisterna magna en SAH o en condiciones falsas, respectivamente. Al día siguiente (D0), se...

Discusión

A pesar de la intensidad de la investigación en el campo de la SAH y el desarrollo de estrategias terapéuticas como opciones de tratamiento endovascular y farmacológico que aumentan en los últimos veinte años, la mortalidad sigue siendo alta en la primera semana de ingreso hospitalario y alcanza alrededor del 50% durante los siguientes 6 meses24,,25.. Este modelo preclínico actual mediante doble inyección diaria de sangre arterial homólo...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la plataforma PRIMACEN (Universidad de Normandie Rouen, Francia) por su equipo de imagen y al Sr. Arnaud Arabo, a la Sra. Julie Maucotel y a la Sra. Martine Dubois, por su alojamiento y cuidado de los animales. Agradecemos a la señora Celeste Nicola por prestar su voz a la grabación del protocolo. Este trabajo fue apoyado por el programa de maduración seinari Normandía, La Fundación AVC bajo la égida de la FRM, la Universidad Normandie Rouen y el Inserm. La Región de Normandía y la Unión Europea (proyecto 3R). Europa participa en Normandía con el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
absorbable hemostatEthiconSurgicel
absorbable suturing threadEthiconVicryl 5.0
auto-regulated electric blanketHarvard Apparatus50-7087-F
bluetack for capillary fixationUHUPatafix
electronic balanceDenver InstrumentMXX-2001
glass capillariesHarvard ApparatusGC150F-15inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizerPhymepV100
micropipette pullerSutter Instrument CompanyP-97
needle 26 GBD microbalance300300
non absorbable suturing threadPeters surgicalFilapeau 4.0
stereotaxic frameDavid Kopf instrumentsModel 902
surgical equipmentKent scientificclamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMOThermofisher11866071

Referencias

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