הזרקת דם ישירה כפולה לתוך מגנה צ'יסטרנה כודל של דימום Subarachnoid

Summary

תיארנו בפרוטוקול זה מודל עכבר מתוקננת של דימום תת-עכבישי (SAH) על ידי הזרקה כפולה של דם מלא אוטולוגי לתוך הבור מגנה. רמת הסטנדרטיזציה הגבוהה של הליך ההזרקה הכפולה מייצגת מודל בינוני עד אקוטי של SAH עם בטיחות יחסית לגבי תמותה.

Abstract

בין שבץ, דימום subarachnoid (SAH) ברצף לקרע של מפרצת עורקי מוחי מייצג 5-9% אבל אחראי על כ 30% של התמותה הכוללת הקשורה לשבץ עם מחלה חשובה במונחים של תוצאה נוירולוגית. Vasospasm מוחי מושהה (CVS) עלול להתרחש לעתים קרובות בשיתוף עם איסכמיה מוחית מושהית. מודלים שונים של בעלי חיים של SAH נמצאים כעת בשימוש כולל ניקוב אנדווסקולרי והזרקה ישירה של דם לתוך מגנה בור המים או אפילו בור מים prechiasmatic, כל אחד מפגין יתרונות וחסרונות ברורים. במאמר זה, מודל עכבר מתוקננת של SAH על ידי הזרקה ישירה כפולה של כרכים נחושים של דם שלם אוטולוגי לתוך magna בור המים מוצג. בקצרה, עכברים נשקלו ולאחר מכן מנופים על ידי שאיפת isoflurane. לאחר מכן, החיה הונחה בתמומת שכיבה על שמיכה מחוממת תוך שמירה על טמפרטורה פי הטבעת של 37°C וממוקמת במסגרת סטריאוטיפית עם עיקול צוואר הרחם של כ-30°. ברגע שהיה במקום, קצה של מיקרופיפט זכוכית מוארך מלא בדם עורקי הומולוגי נלקח מעורק ראשי של עכבר אחר באותו גיל ומין (C57Bl/6J) היה ממוקם בזווית ישרה במגע עם קרום atlanto-occipital באמצעות מיקרומניפולטור. ואז 60 μL של דם הוזרק מגנה בור המים ואחריו הטיה כלפי מטה 30 מעלות של החיה במשך 2 דקות. האינפוזיה השנייה של 30 μL של דם לתוך הבור מגנה בוצע 24 שעות לאחר הראשון. המעקב הפרטני של כל בעל חיים מתבצע מדי יום (הערכה קפדנית של משקל ושלום). הליך זה מאפשר התפלגות צפויה וניתנת לשחזור של דם, ככל הנראה מלווה בגובה לחץ תוך גולגולתי שניתן לחקות על ידי זריקה מקבילה של נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי (CSF), ומייצג מודל אקוטי עד מתון של SAH הגורם לתמותה נמוכה.

Introduction

דימום Subarachnoid (SAH) מהווה עד 5% מכלל מקרי שבץ ומהווה פתולוגיה נפוצה יחסית עם שכיחות של 7.2 כדי 9 חולים לכל 100,000 בשנה, עם שיעור תמותה של 20%-60%^{בהתאם למחקר 1,2,3}. בשלב אקוטי, התמותה מיוחסת לחומרת דימום, דימום מחדש, vasospasm מוחי (CVS) ו / או סיבוכים רפואיים⁴. בניצולים, פגיעה מוחית מוקדמת (EBI) קשורה עם הארכה parenchymal של דימום ועלייה פתאומית בלחץ תוך גולגולתי, אשר עלול לגרום איסכמיה^{מוחית ראשונית 5 ומוות} מיידי על 10%-15%^{מהמקרים 6}. לאחר השלב הראשוני "אקוטי" של SAH, הפרוגנוזה תלויה בהתרחשות של איסכמיה מוחית "משנית" או מעוכבת (DCI), שזוהתה בכמעט 40% מהחולים על ידי טומוגרפיה ממוחשבת מוחית, ועד 80% מהחולים לאחר הדמיית תהודה מגנטית (MRI)^7,8. בנוסף CVS המתרחשים בין 4 ל 21 ימים לאחר קרע מפרצת ברוב של חולי SAH, DCI⁹ עשוי לנבוע נגעים מוחיים מפוזרים רב-מפזרים משני להיווצרות microthrombosis, הפחתת נוזל מוחי, דלקת עצבית, ודיכאון התפשטות קליפתית (CSD)^10,11,12,13. זה משפיע על 30% של ניצולי SAH ומשפיע על תפקודים קוגניטיביים כולל זיכרון חזותי, זיכרון מילולי, זמן תגובה, ותפקודי מנהל, visuospatial^{ושפה 14} פגיעה בחיי^{היומיום 15}. טיפולים סטנדרטיים נוכחיים כדי למנוע CVS ו / או את התוצאות הקוגניטיביות המסכן בחולים SAH מבוססים על החסימה של Ca²⁺ איתות ו- vasoconstriction באמצעות מעכבי ערוץ Ca²⁺ כמו Nimodipine. עם זאת, ניסויים קליניים עדכניים יותר המתמקדים בהתחלואה חשפו ניתקה בין התוצאה הנוירולוגית של המטופל ומניעה של CVS¹⁶, מה שמצביע על מנגנונים פתופיזיולוגיים מורכבים יותר המעורבים בהשלכות ארוכות הטווח של SAH. לכן, יש צורך רפואי בהבנה רבה יותר של מספר האירועים הפתולוגיים הנלווים SAH ופיתוח מודלים בעלי חיים תקפים ומתורבתים כדי לבדוק התערבויות טיפוליות מקוריות.

הקרע של מפרצת תוך גולגולתית אחראי בעיקר SAH בבני אדם קשה לחקות במודלים בעלי חיים פרה-גולגולתיים. כיום, הקרע במפרצת ומצב SAH יכול להיבדק באופן זמני על ידי ניקוב של העורק המוחי האמצעי (מודל ניקוב אנדווסקולרי) אחראי CVS וssensitivomotor תפקוד לקוי בעכברים^17,18. בשל חוסר שליטה אפשרית על תחילת הדימום ודיפוזיה של דם במודל זה, שיטות אחרות פותחו מכרסמים כדי ליצור מודלים SAH ללא קרע אנדווסקולרי. ליתר דיוק, הם מורכבים מהניהל הישיר של דם עורקי לתוך החלל subarachnoid באמצעות זריקה אחת או כפולה ב magna בור^{19 או זריקה} אחת לתוך בור המים prechiasmatic²⁰. היתרון העיקרי של מודלים אלה העכבר ללא קרע אנדווסקולרי היא האפשרות לשלוט באופן רפרוצדור בהליך כירורגי ואת האיכות והכמות של דגימת הדם המוזרק. יתרון נוסף של מודל זה על פני המודל על ידי ניקוב אנדווסקולרי בפרט הוא שימור רווחתו הכללית של בעל החיים. למעשה, ניתוח זה הוא פחות פולשני וטכנית פחות מאתגר מזה הנדרש כדי ליצור קרע בקיר בעורק התו הרכב. במודל האחרון הזה, בעל החיים צריך להיות צנרר ומאוורר מכנית, בעוד מונופילמנט מוכנס בעורק הראשי החיצוני, ומתקדם לתוך העורק הראשי הפנימי. זה כנראה מוביל לאיכימיה ארעית עקב חסימה של כלי השיט על ידי נתיב התיל. כתוצאה מכך, התולדות ההתלומה ההתלומה (מצב moribund, כאב חשוב ומוות) הקשורים לניתוח חשוב פחות במודל הזרקה כפולה לעומת מודל ניקוב אנדווסקולרי. בנוסף להיותו SAH עקבי יותר, שיטת ההזרקה הישירה הכפולה תואמת את רווחת בעלי החיים במחקר ובדיקה (זמן מופחת תחת הרדמה, כאב מהפרעה ברקמות בניתוח ומצוקה) ומוביל למספר מינימלי של בעלי חיים המשמשים למחקר פרוטוקול והכשרת כוח אדם.

יתר על כן, זה מאפשר יישום של אותו פרוטוקול לעכברים טרנסגניים, המוביל הבנה פתולוגית אופטימיזציה של SAH ואת האפשרות של בדיקה השוואתית של תרכובות טיפוליות פוטנציאליות. כאן, אנו מציגים מודל עכבר מתוקננת של דימום subarachnoid (SAH) על ידי הזרקה יומית כפולה ברצף של דם עורקים אוטולוגי לתוך magna בור המים בעכברים C57Bl/6J זכר בן 6-8 שבועות. היתרון העיקרי של מודל זה הוא השליטה של נפח הדימום לעומת מודל ניקוב אנדווסקולרי, וחיזוק האירוע דימום ללא עלייה דרסטית של^{לחץ תוך גולגולתי 21}. לאחרונה, הזרקת דם ישירה כפולה לתוך magna בור המים תוארה היטב על בעיות ניסיוניות ופיזיופתולוגיות בעכברים. אכן, הראינו לאחרונה CVS של עורקים מוחיים גדולים (basilar (BA), אמצע (MCA) ו קדמי (ACA) עורקים מוחיים), תצהיר פיברוסקולרי ואפופטוזיס תא מהיום 3 (D3) כדי 10 (D10), פגמים במחזור הדם של נוזל מוחי שדרתי paravascular בליווי sensitivomotor שונה ותפקודים קוגניטיביים בעכברים, 10 ימים לאחר SAH במודל זה²². לכן, הוא הופך מודל זה שולט, מאומת ומאופיין עבור אירועים לטווח קצר וארוך לאחר SAH. זה צריך להיות מתאים באופן אידיאלי לזיהוי פוטנציאלי של מטרות חדשות ולימו מחקרים על אסטרטגיות טיפוליות חזקות ויעילות נגד סיבוכים הקשורים SAH.

Protocol

כל ההליכים בוצעו תחת פיקוחו של ה. קסטל בהתאם לוועדת האתיקה הצרפתית ולהנחיות הנחיית הפרלמנט האירופי 2010/63/EU והמועצה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. פרויקט זה אושר על ידי CENOMEXA המקומית וועדת האתיקה הלאומית למחקר וניסויים בבעלי חיים. זכר C57Bl/6J Rj עכברים (Janvier), בגילאי 8-12 שבועות, היו שוכנו בתנאים סביבתיים סטנדרטיים מבוקרים: 22 °C ± 1 °C, 12 שעות / 12 שעות מחזור אור / כהה, ומים ומזון זמין אד libitum.

1. התקנה של ניתוח SAH והכנה להזרקה

1. לפני תחילת הניתוח, למשוך מספר מספיק של נימים זכוכית באמצעות מושך micropipette. פיפטה ההזרקה צריך להפגין קוטר פנימי של 0.86 מ"מ וקוטר החוצה של 1.5 מ"מ.
2. הכן את נוזל המוח השדרה המלאכותי (aCSF) למצב מזויף.
   1. הכן פתרון עם 119 מ"מ NaCl, 2.5 מ"ר KCl, 1 מ"מ NaH_{2PO 4}, 1.3 mM MgCl_2,10 mM גלוקוז, 26.2 mM NaHCO₃ ב H₂O, pH 7.4.
   2. גז aCSF עם 95% O_{2 ו} 5% CO_{2 במשך} 15 דקות, ולאחר מכן להוסיף 2.5 mM CaCl₂.
   3. לחטא את aCSF מחומצן עם 0.22 μm מסנן 2. פתרון aCSF יכול להיות יציב במשך 3-4 שבועות ב- 4 °C. אם זיהום (הפתרון הופך מעונן) או היווצרות הפקדה הופיע, להיפטר ולהפוך aCSF טרי.
3. אוסף דם מתורם עכבר הומולוגי
   1. בודדו את העורק הראשי לאורך קנה הנשימה ואספו את הכמות המרבית של דם על ידי ניקוב של העורק הראשי.
   2. בפועל, מניחים את העכבר בתא הרדמה ועמיסו את התא ב-5% איזולורן עד שהחיה מאבדת את הכרתה.
   3. בדוק את חוסר רפלקסים על ידי הידוק אחד משני גפיים אחוריות כדי לאפשר את ההגדרה של ההליך הניסיוני כירורגי.
   4. מעיל מזרק 1 מ"ל עם תמיסת הפרין באמצעות מחט 26 G (נתרן הפרין). פעולה זו תמנע קרישה בדם בשלבים הבאים.
   5. התקן את החיה ממוקמת בדנובה גב עם רגליים בנפרד, ואת האף במסכת הרדמה (תחזוקת הרדמה עם 2-2.5% isoflurane).
   6. בודדו את העורק הראשי לאורך קנה הנשימה על ידי ניתוח שריר האומוהיואיד באופן אורכי. ברגע שהעורק מבודד, הכנס את המחט לכיוון הלב בעזרת וו המיקרו-דיסקט וממחטים ואספו את המקסימום של הדם באמצעות ניקוב של העורק הראשי (60 μL נחוץ לכל עכבר SAH).
   7. להקריב את העכבר התורם מדם מיד לאחר איסוף הדם באמצעות נקע צוואר הרחם.

2. הכנת בעלי חיים (8-10 שבועות C57BL/6J זכר) הכנה

1. שקלו כל עכבר בדיוק באמצעות איזון אלקטרוני. במחקר הנוכחי, עכברים יהיה משקל גוף בטווח של 20 כדי 25 גרם ממש לפני הניתוח.
2. כפי שהוסבר קודם לכן (ראה שלבים 1.3.2 ו- 1.3.3), לגרום להרדמה של עכברים להיות מופעלים.
3. לגלח את הצוואר ואת החלל בין האוזניים עם קוצץ חשמלי מתאים.
4. התקן את החיה ממוקמת בדנוויטוס גחוני עם רגליים בנפרד ואת האף במסכת הרדמה (תחזוקת הרדמה עם 2 ו 2.5% isoflurane) על מסגרת סטריאוטיפית.
5. ודא שהעכבר ישן ושראשו חסום כראוי.
6. תת עורי להזריק 100 μL של buprenorphine (0.1 מ"ג/ ק"ג) עם מחט 26 G בגב התחתון, כדי למנוע כאב לאחר התעוררות.
7. מנע עיניים יבשות באמצעות ג'ל נוזלי מגן ולשמור על טמפרטורה תוך-טרקטאלית של 37 °C באמצעות שמיכה חשמלית מוסדרת אוטומטית.
8. לטפל באזור הצוואר האחורי מגולח עם תמיסת חיטוי (povidone-יוד או כלורהקסידין באמצעות כביש כותנה סטרילי).
9. חטא מראש את כל המכשירים הנוגעים ברקמת העור/עורית המוכנה (חימום ל-200 מעלות צלזיוס למשך שעתיים) ולטפל באופן אפטי.

3. אינדוקציה SAH

1. ביום הראשון (D-1)
   1. חותכים חתך של 1 ס"מ עם מספריים דקות בצוואר האחורי, ואחריו הפרדת השרירים לאורך קו האמצע כדי לגשת למגנה של הבור.
   2. חותכים את קצה פיפטת הזכוכית הריקה עם מספריים דקות. לאחר מכן, התאם את עצמו למזרק המחובר למחבר סיליקון גמיש.
   3. להעביר 60 μL של דם או aCSF (עבור SAH או מצב מזויף, בהתאמה) בצינור 0.5 מ"ל באמצעות micropipette מדויק.
   4. לשאוב לתוך פיפטה זכוכית 60 μL של דם למצב SAH או 60 μL של aCSF למצב מזויף.
   5. להזרקה, להתקין את הפיפטה על המסגרת הסטריאוטיפית באמצעות טבעת או טקטיקה כחולה ולאט להביא את קצה פיפטה לממברנה בממשק עם magna בור מים.
   6. לאט להכניס את קצה פיפטה דרך קרום atlanto-occipital לתוך magna בור המים, באמצעות מיקרו מניפולטור של המסגרת הסטריאוטיפית.
   7. חבר את הפיפטה שמלאה בעבר בדם או ב-aCSF למזרק המוכן לאינדוקציה של לחץ.
   8. להזריק על ידי לחיצה על הבוכנה בקצב נמוך סביב 10 μL / דקה, כדי למנוע לחץ תוך גולגולתי חריפה.
   9. במהלך ההזרקה, עקבו מקרוב אחר קצב הנשימה ועל טמפרטורת פי הטבעת.
   10. בסוף הזריקה, בזהירות להוריד את הפיפטה באמצעות מיקרו מניפולטור ובאופן חזותי להבטיח כי אין דליפה במהלך הנסיגה.
   11. השג hemostasis באמצעות hemostat נספג ולהפעיל שני תפרים עם חוט תפירה קלוע לא נספג.
   12. מיד לאחר הניתוח, לבודד ולמקם את העכבר בירידה decubitus ולכסות אותו עם שמיכת הישרדות בקופסה פתוחה למשך ההחלמה.
2. היום השני של אינדוקציה (D0)
   1. לאחר 24 שעות, לגרום להרדמה (ראה שלבים 1.3.2 ו- 1.3.3). תת עורית להזריק 100 μL של buprenorphine שוב (0.1 מ"ג/ק"ג) ולמנוע עיניים יבשות באמצעות ג'ל נוזלי מגן (ראה שלבים 2.7 ו 2.8).
   2. התקן את החיה על המסגרת הסטריאוטיפית כמו ביום הקודם.
   3. הסר בזהירות את התפרים באמצעות מיקרו-תפרים.
   4. הכינו את קרום ה-atlanto-occipital כמו קודם והתחילו הכנה מחטא על האזור המגולח של הצוואר עם מוט כותנה סטרילי.
   5. להזריק 30 μL של דם או aCSF בשיעור נמוך (ראה שלבים 3.1.2 כדי 3.1.8). לפקח על קצב הנשימה וטמפרטורת פי הטבעת.
   6. בסוף הזריקה, בזהירות להוריד את הפיפטה ולשלוט בהיעדר דליפת דם במהלך הגמילה.
   7. להשיג hemostasis ולהפעיל שני תפרים עם חוט תפירה קלוע נספג.

4. מעקב לאחר הניתוח וסיום הניסוי

1. מיד לאחר הניתוח, לבודד ולמקם את העכבר בירידה decubitus עם שמיכת הישרדות על גבו בתיבה פתוחה במהלך ההחלמה.
2. לשקול ובזהירות לצפות מדי יום את ההתנהגות של כל עכבר עד הקרבה (למשל, D7 לאחר הניתוח).
3. בקרב נקודות קצה הושות, ירידה משמעותית במשקל (>15% מהמשקל) מורגש קלאסי. תנוחה "רכונה לאחור", תנועות איטיות, השתרעה, קולות חריגים של כאב ו/או התנהגות אגרסיבית משמעותית הם גם סימנים חשובים לסבל של בעלי חיים. אם מופיע אחד מהסימנים או שילוב של סימנים אלה, הניטור של בעל החיים מתחזק בתוך שעות מהמראה שלהם. אם רווחת החיה מחמירה או אינה משתפרת בתוך 48 שעות, ייחשב כי תושג רמה של סבל בלתי נסבל, ומתת חסד מתבצעת.
4. בזמן הבחירה, להקריב עכברים מותמים על ידי עריפת ראש, ולקצור מוח לניתוחים נוספים.
5. לבצע המתת חסד (עריפת ראש) לאחר הרדמה isoflurane (5%).

תוצאות

ציר זמן ניסיוני, הליך, מעקב ותמותה
איור 1א ואיור 1B מסכמים את פרוטוקול מודל SAH על-ידי הזרקת דם כפולה. בקצרה, ביום הראשון של אינדוקציה SAH (D-1), 60 μL של דם נסוג עכבר הומולוגי או 60 μL של נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (aCSF) הוזרקו לתוך magna בור מים ב SAH או תנאים מזויפים,...

Discussion

למרות עוצמת המחקר בתחום SAH ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות כגון אנדווסקול ואפשרויות טיפול תרופתי גדל במהלך עשרים השנים האחרונות, התמותה נשאר גבוה בשבוע הראשון של אשפוז בבית החולים מגיע כ 50% במהלך 6 החודשים^{הבאים 24,25}. מודל פרה-קליפתי הנוכחי על ידי הזרקה כפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071